Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.
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Methodenartikel
Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Aufkommen zielgerichteter CRISPR-Cas-Nuklease-Technologien hat die Fähigkeit revolutioniert, sowohl in etablierten als auch in neu entstehenden Modellsystemen eine präzise Genom-Editierung durchzuführen. CRISPR-Cas-Genomeditierungssysteme verwenden eine synthetische Guide-RNA (sgRNA), um eine CRISPR-assoziierte (Cas) Endonuklease auf bestimmte genomische DNA-Loci auszurichten, wobei die Cas-Endonuklease einen Doppelstrangbruch erzeugt. Die Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch intrinsische fehleranfällige Mechanismen führt zu Insertionen und/oder Deletionen, die den Locus stören. Alternativ kann der Einschluss von doppelsträngigen DNA-Donoren oder einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden in diesen Prozess die Einbeziehung präziser Genom-Editierungen hervorrufen, die von Einzelnukleotid-Polymorphismen über kleine immunologische Markierungen bis hin zu großen fluoreszierenden Proteinkonstrukten reichen. Ein großer Engpass bei diesem Verfahren kann jedoch darin bestehen, die gewünschte Bearbeitung in der Keimbahn zu finden und zu isolieren. Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zum Screening und zur Isolierung von Keimbahnmutationen an bestimmten Loci in Danio rerio (Zebrafisch); Diese Prinzipien können jedoch in jedem Modell adaptiert werden, in dem eine In-vivo-Spermienentnahme möglich ist.
Einleitung
Das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Durchführung von Loci-spezifischer Mutagenese und präziser Genom-Editierung im Danio rerio (Zebrafisch) Modellsystem 1,2,3,4. Das Cas-Ribonukleoprotein (RNP) besteht aus zwei Hauptkomponenten: einer Cas-Endonuklease (üblicherweise Cas9 oder Cas12a) und einer locusspezifischen synthetischen Guide-RNA (sgRNA)5. Zusammen erzeugen die Cas-RNP einen doppelsträngigen Bruch (DSB) im gewünschten Loc....
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Protokoll
Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der University of Texas at Austin genehmigt (AUP-2021-00254).
1. Design der sgRNA für die CRISPR-Mutagenese
- Ermitteln Sie die Exon-Sequenz, die die Zielorte enthält.
- Entwerfen Sie eine synthetische Guide-RNA (sgRNA) mit einer Protospacer-benachbarten Motivstelle (PAM), die spezifisch für die Cas-Endonuklease ist.
- Wenn Sie ein Spenderkonstrukt koinjizieren, entwerfen Sie die sgR....
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Ergebnisse
Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Ansätze ermöglichen eine schnellere Identifizierung von Genom-Edits oder vermeintlich schädlichen Allelen, indem sie sich auf die Analyse von Tausenden von Genomen konzentrieren, die aus der Sammlung von F0-injizierten männlichen Spermien stammen. Abbildung 2 zeigt, wie die mit diesem Protokoll erzielten Ergebnisse zu interpretieren sind.
Um Mutationen im p2ry12-Locus zu erzeugen, wurden Zebrafischembryonen im .......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur schnellen Charakterisierung von mutmaßlichen Genomänderungen oder gezielten Mutationen mit Hilfe der CRISPR-Cas-Technologie durch gezielte Analyse von F0-männlichen Spermiengenomen. Dieses Protokoll sollte für andere Tiermodelle zugänglich sein, bei denen Spermien ohne Euthanasie leicht für die Probenahme zur Verfügung stehen. Diese Methode erhöht den Durchsatz beim Screening auf gewünschte Bearbeitungen und ist besonders nützlich für die Identifizierung seltener HDR-vermittel.......
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Danksagungen
Wir danken Anna Hindes von der Washington University School of Medicine für ihre anfänglichen Bemühungen, mit der Hot-Shot-Methode genomische DNA von Spermien in guter Qualität zu erhalten. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Arthritis and Muskuloskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health unter Auszeichnung (R01AR072009 an R.S.G.) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose-Pulver | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Zuchtbecken | Carolina Biological | ||
| BstNI-Restriktionsenzym | NEB | R0168S | |
| Cas9-Endonuklease | IDT | 1081060 DNA-Leiter | |
| , 100 bp | Thermo Scientific | ||
| dnah10 Spenderkonstrukt | Sigma-Aldrich DNA-Oligo | im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken. Phosphorthioatbindung auf dem Donor an den ersten drei Phosphatbrücken sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') | |
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich DNA-Oligo | im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') | |
| dnah10 Reverse Primer | Sigma-Aldrich DNA-Oligo | im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') | |
| dnah10 synthetische sgRNA | Synthego | Synthetische sgRNA, Zielsequenz: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Elektrophorese-Stromversorgung | |
| Thermo Scientific | 105ECA-115 | ||
| Filterzange | Millipore | XX6200006P | |
| Fisch (System) Wasser | Generisches | n/a | |
| Gelelektrophoresesystem (einschließlich Gießrahmen, Kamm und Elektrophoresekammer) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel Imaging Leuchtkasten | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel-Fleck, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glasschale, 250 mL | Generisch | n/a | |
| Isolationsbehälter, 0,8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap Kapillarrohr mit Kolben, 20 & Mikro; L | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minizentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Mikropipetten, verschiedene mit entsprechenden Spitzen | Generisch | n/a | |
| Mikrowelle | Generisch | n/a | |
| Nukleasefreies Wasser | Promega | P119-C | |
| Papierhandtücher | Generische | n/a | |
| PCR-Röhrchen, 0,2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Kunststofflöffel, mit gebohrten Löchern/Schlitzen | Generisches | n/a | |
| KCl-Lösung, 0,2 M RNAse freies | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 Forward Primer | Sigma-Aldrich DNA-Oligo | im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') | |
| p2ry12 Reverse-Primer | Sigma-Aldrich DNA-Oligo | im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') | |
| p2ry12 synthetische sgRNA | Synthego | Synthetische sgRNA, Zielsequenz: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Restriktionsenzym | |
| 10X Puffer | NEB | B6003SVIAL NaOH-Lösung | |
| , 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Schwamm, 1 Zoll x 1 Zoll geschnitten mit kleiner ovaler Vertiefung | Generisch | n/a | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq Polymerase Master Mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Puffer Konzentrat, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Seidenpapier | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricain-Methansulfonat-Lösung (Syncain, MS-222), 0,016% in Fischwasser (pH 7,0± 0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (gepuffert mit HCl bis ph 8,0) | Promega | H5131 |
Referenzen
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
