Method Article

Analyse von rohen und verarbeiteten Cyperi-Rhizom-Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie bei Ratten mit primärer Dysmenorrhoe

DOI:

10.3791/64691

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December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird eine vergleichende Analyse von rohen und verarbeiteten Cyperi-Rhizom (CR)-Proben mittels ultrahochleistungsfähiger Flüssigkeitschromatographie-hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) bei Ratten mit primärer Dysmenorrhoe vorgestellt. Die Veränderungen der Blutspiegel der Metaboliten und der Probenbestandteile wurden zwischen Ratten, die mit CR behandelt wurden, und CR, die mit Essig (CRV) verarbeitet wurden, untersucht.

Abstract

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Das Cyperi-Rhizom (CR) ist in der Gynäkologie weit verbreitet und ist ein allgemeines Arzneimittel zur Behandlung von Frauenkrankheiten in China. Da die analgetische Wirkung von CR nach der Verarbeitung mit Essig verstärkt wird, wird CR, das mit Essig (CRV) verarbeitet wird, im Allgemeinen klinisch verwendet. Der Mechanismus, durch den die analgetische Wirkung durch die Essigverarbeitung verstärkt wird, ist jedoch unklar. In dieser Studie wurde die Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) Technik verwendet, um Veränderungen der Blutspiegel der exogenen Bestandteile und Metaboliten zwischen CR-behandelten und CRV-behandelten Ratten mit Dysmenorrhoe zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten unterschiedliche Konzentrationen von 15 Bestandteilen und zwei Metaboliten im Blut dieser Ratten. Unter ihnen waren die Gehalte an (-)-Myrtenol und [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]essigsäure in der CRV-Gruppe deutlich höher als in der CR-Gruppe. CRV reduzierte den Gehalt an Prostanoiden der 2-Serie und Leukotrienen der 4-Serie mit proinflammatorischen, Thrombozytenaggregations- und Vasokonstriktionsaktivitäten und lieferte analgetische Wirkungen durch Modulation des Arachidonsäure- und Linolsäurestoffwechsels und der Biosynthese ungesättigter Fettsäuren. Diese Studie ergab, dass die Essigverarbeitung die analgetische Wirkung von CR verstärkt und zu unserem Verständnis des Wirkmechanismus von CRV beiträgt.

Introduction

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Primäre Dysmenorrhoe (PD) ist die häufigste Erkrankung in der klinischen Gynäkologie. Es ist gekennzeichnet durch Rückenschmerzen, Schwellungen, Bauchschmerzen oder Beschwerden vor oder während der Menstruation ohne Beckenpathologie im Fortpflanzungssystem1. Ein Bericht über die Prävalenz zeigte, dass 85,7% der Schüler an PD2 leiden. Niedrig dosierte orale Kontrazeptiva sind die Standardtherapie, aber ihre unerwünschten Nebenwirkungen, wie z. B. tiefe Venenthrombosen, haben zunehmend Aufmerksamkeit erregt3. Die Prävalenz tiefer Venenthrombosen bei Anwendern oraler Kontrazeptiva beträgt >1 pro 1.000 Frauen, und das Risiko ist in den ersten 6-12 Monaten und bei Anwendern, die älter als 40 Jahre sind, am höchsten4.

Das Cyperi-Rhizom (CR) wird seit langem in der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) verwendet und stammt aus dem getrockneten Rhizom des Cyperus rotundus L. aus der Familie der Cyperaceae. CR reguliert Menstruationsstörungen und lindert Depressionen und Schmerzen5. CR ist in der Gynäkologie weit verbreitet und gilt als Allgemeinmedizin zur Behandlung von Frauenkrankheiten6. CR, das mit Essig (CRV) verarbeitet wird, wird typischerweise klinisch verwendet. Im Vergleich zu CR zeigt CRV eine verbesserte Regulierung der Menstruation und Schmerzlinderung. Moderne Studien haben gezeigt, dass CR die Cyclooxygenase-2 (COX-2) und die anschließende Synthese von Prostaglandinen (PGs) hemmt und so eine entzündungshemmende Wirkung erzielt. In der Zwischenzeit zeigt CR eine analgetische Wirkung ohne Nebenwirkungen7, was CR zu einer guten Wahl für Dysmenorrhoe-Patienten macht. Der Mechanismus, der der Regulation der Menstruation und der Schmerzlinderung durch CRV zugrunde liegt, ist jedoch unklar. Die CR-Forschung konzentrierte sich hauptsächlich auf Veränderungen ihrer aktiven chemischen Komponenten und pharmakologischen Aktivitäten, wie z. B. ihre entzündungshemmenden, antidepressiven und analgetischen Wirkungen 8,9,10,11,12.

Obwohl die Inhaltsstoffe der TCM komplex sind, werden sie in das Blut aufgenommen und müssen eine bestimmte Blutkonzentration erreichen, um wirksam zu sein13. Der Umfang des Screenings der Wirkstoffe der TCM kann durch die Anwendung der Strategie der Bestandteilbestimmung im Blut eingegrenzt werden. Blindheit kann bei der Untersuchung der chemischen Komponenten in vitro vermieden werden, und Einseitigkeit kann bei der Untersuchung der einzelnen Bestandteile vermieden werden14. Durch den Vergleich der Zusammensetzungen von CR und CRV im Blut können Veränderungen der Wirkstoffe des verarbeiteten CR effektiv und schnell nachgewiesen werden. Arzneimittelwirksamkeit ist der Prozess, durch den ein Medikament den Körper beeinflusst. Veränderungen der Arzneimittelkomponenten aufgrund der Stoffwechselreaktion des Körpers, die mit dem Wirkmechanismus des Arzneimittels zusammenhängen können, können mit Metabonomics bestimmt werden. Metabonomics zielt darauf ab, die allgemeinen und dynamischen Stoffwechselreaktionen zu messen, was mit der Bestimmung der Gesamtwirksamkeit der traditionellen chinesischen Medizin übereinstimmt15. Darüber hinaus sind Metaboliten das Endprodukt der Genexpression, die am engsten mit den Phänotypen16 verwandt ist. Daher könnte die Metabonomik geeignet sein, um die Unterschiede in den Stoffwechselwegen zwischen CR und CRV bei der Behandlung von Parkinson zu untersuchen. Die auf Flüssigchromatographie und hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) basierende ungezielte Metabolomik zeichnet sich durch hohen Durchsatz, hohe Empfindlichkeit und hohe Auflösung aus und kann zur Messung vieler verschiedener kleiner molekularer Komponenten verwendet werden17,18 . Mit dieser Methode können gleichzeitig die endogenen Metaboliten und die in das Blut aufgenommenen exogenen Bestandteile bestimmt werden. Metabonomics wurde häufig in Studien zu TCM19, Arzneimitteltoxikologie20, Gesundheitsmanagement21, Sport22, Lebensmittel23 und anderen Bereichen eingesetzt.

In dieser Studie wurden die Unterschiede in den exogenen Bestandteilen, die in das Blut aufgenommen werden, und den endogenen Metaboliten zwischen CR-behandelten und CRV-behandelten Dysmenorrhoe-Modellratten unter Verwendung von LC-MS/MS-basierter ungezielter Metabolomik gemessen, um die Mechanismen der analgetischen Wirkungen von CRV aufzudecken.

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Protocol

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Alle tierbezogenen Experimente wurden mit Genehmigung der Experiment-Ethikkommission des Chongqing-Instituts für TCM durchgeführt. Vierundzwanzig weibliche Sprague-Dawley-Ratten (SD), die 8-10 Wochen alt waren und 200 g ± 20 g wogen, wurden in diesem Experiment verwendet.

1. Vorbereitung der Extraktion

  1. Berechnung
    1. Planen Sie, den CR- oder CRV-Extrakt einer Behandlungsgruppe von sechs Sprague-Dawley-Ratten (10 g/[kg∙Tag]) 3 Tage lang zu verabreichen. Verwenden Sie eine CR- oder CRV-Extraktkonzentration von 1 g/ml (1 ml des Extrakts wird aus 1 g Kräutern gewonnen).
      HINWEIS: Die Dosierung von CR beträgt 6-10 g. In dieser Studie wurde die maximale Dosis von 10 g als Dosierung verwendet. Da das Durchschnittsgewicht einer erwachsenen Person 60 kg beträgt, beträgt die Erwachsenendosis 0,1667 g/kg. Gemäß dem Gewichtsumrechnungsalgorithmus24 beträgt die Dosierung für Ratten 1,05 g/kg, da der Dosisumrechnungskoeffizient zwischen Menschen und Ratten 6,3 beträgt. Die Medikamentendosis wurde bei Ratten um das 10-fache auf 10,5 g/kg erhöht. Die Dosierung wurde auf 10 g/kg festgelegt, um die Berechnung und das eigentliche Experiment zu erleichtern. Wenn beispielsweise insgesamt 36 g CR oder CRV benötigt werden, sollte die chinesische Kräutermedizin mindestens zweimal zubereitet werden. So wurden 200 g CR benötigt - 100 g CR wurden als CR verwendet und 100 g CR wurden zu CRV verarbeitet.
    2. Berechnen Sie das Volumen von CR oder CRV, das pro Ratte angewendet werden soll, mit Gleichung (1):
      V = 10 g/(kg∙Tag) × 200 g/(1 g/ml) = 2 ml (1)
  2. Abwicklung des CRV
    1. 100 g CR und 20 g Essig (>5,5 g Essigsäure/100 ml) gründlich mischen und 12 h inkubieren.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das Innere des CR nach 12 h mit Essig angefeuchtet wurde, wurden CR und Essig gemischt, gut gerührt und dann erneut gerührt, bis der innere Teil feucht war.
    2. Die Mischung in einer Eisenpfanne 10 min bei 110-120 °C anbraten. Nehmen Sie dann die Mischung heraus und lassen Sie sie bei Raumtemperatur abkühlen.
      HINWEIS: Um ein Anbrennen des CR zu verhindern, muss während des Erhitzens kontinuierlich gerührt werden. Wenn das verarbeitete CRV zu nass ist, kann es bei 60 °C getrocknet werden. Wenn die Oberfläche des CR Sepia ist, kann das Braten gestoppt werden.
  3. Extraktion
    1. CR-Extrakt
      1. Fügen Sie dem CR das 10-fache (die Menge an CR) reines Wasser hinzu und lassen Sie es 2 Stunden einweichen. Stellen Sie sicher, dass sich die medizinischen Materialien beim Einweichen unter dem Flüssigkeitsspiegel befinden.
        HINWEIS: Der CR muss vor der Extraktion nur halbiert werden. Der Zweck des Einweichens besteht darin, die aktiven Bestandteile effektiver zu extrahieren. Der Prozess des Einweichens ist unerlässlich.
      2. Bringen Sie die Mischung aus Wasser und Medizin bei starker Hitze zum Kochen und lassen Sie sie 20 Minuten bei schwacher Hitze kochen. Mit einem Filtertuch (100 Mesh) filtrieren und das Filtrat auffangen.
        HINWEIS: Beim Abkochen wurde vor dem Kochen eine hohe Hitze verwendet, und eine niedrige Hitze wurde verwendet, um das Kochen aufrechtzuerhalten.
      3. Wiederholen Sie Schritt 1.3.1.2 einmal und kombinieren Sie die Filtrate.
      4. Der Extrakt wird mit einem Rotationsverdampfer auf 1 g/ml eingeengt (basierend auf dem Originalarzneimittel muss die Konzentrationstemperatur unter 60 °C liegen).
        HINWEIS: Die aktiven Komponenten in CR sind flüchtig, daher sollte die Konzentrationstemperatur nicht höher als 60 °C sein.
    2. CRV-Extrakt
      1. Führen Sie die gleichen Schritte (1.3.1.1-1.3.1.3) wie bei der CR-Extraktionsmethode durch.
    3. CR-Extrakt zum Testen
      1. Pipettieren Sie 500 μl des CR-Extrakts und 500 μl Methanol in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und wirbeln Sie 30 s lang, um es zu mischen.
        HINWEIS: Eine Mischung aus Methanol und Wasser extrahiert die Wirkstoffe besser. Der Extrakt sollte zum Testen nicht direkt gefiltert werden.
      2. Zentrifugieren Sie jede Probe für 15 min bei 1,6502 × g bei 4 °C. Filtern Sie den Überstand und geben Sie ihn dann zum Testen in das Probenfläschchen.
        HINWEIS: Nach der Hochgeschwindigkeitszentrifugation des Gemisches aus Methanol und Extrakt kann der Überstand zur Bestimmung ohne Filtration direkt in die Probenflasche überführt werden. Aufgrund der durch den Zentrifugationsprozess erzeugten Wärme ist es vorzuziehen, eine kryogene Zentrifuge zu verwenden.
    4. CRV-Extrakt zum Testen
      1. Führen Sie die Schritte 1.3.3.1 bis 1.3.3.2 aus, um den CRV-Extrakt für den Test vorzubereiten.

2. Tiere

  1. Berechnung
    1. Nehmen Sie 50 mg Estradiolbenzoat und fügen Sie es zu 50 ml Olivenöl hinzu, um eine 1 mg / ml-Lösung herzustellen. Nehmen Sie 50 mg Oxytocin und fügen Sie es zu 50 ml normaler Kochsalzlösung hinzu, um eine 1 mg / ml-Lösung herzustellen.
      HINWEIS: Die Dosis der intraperitonealen Injektion von Estradiolbenzoat und Oxytocin beträgt 10 mg/(kg∙Tag). Estradiolbenzoat wird in Olivenöl gelöst und Oxytocin wird in normaler Kochsalzlösung gelöst. Estradiolbenzoat ist nicht leicht in Olivenöl aufzulösen und kann mit Ultraschall behandelt werden, um die Auflösung zu beschleunigen. Sowohl die Estradiolbenzoat- als auch die Oxytocinlösung müssen täglich hergestellt werden.
    2. Berechnen Sie das Volumen der Östradiolbenzoatlösung, die pro Ratte aufgetragen werden soll (d. h. V = 10 mg/[kg∙Tag] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Berechnen Sie das Volumen der pro Ratte anzuwendenden Oxytocinlösung (d. h. V = 10 mg/[kg∙Tag] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Gruppierung und Verabreichung von Tieren
    ANMERKUNG: Für die Verabreichung waren zehn Tage vorgesehen25,26. Während der Behandlung hatten die Ratten uneingeschränkten Zugang zu normalem Futter und Wasser. Innerhalb von 30 Minuten nach der Verabreichung von Oxytocin wurde die sich windende Aktivität jeder Ratte verfolgt. Das PD-Rattenmodell wurde erfolgreich entwickelt, wie die Verdrehungsreaktionen der Modellratten belegen, die eine Uteruskontraktion, eine Gliedmaßenrotation, eine Streckung der Hinterbeine, einen hohlen Rumpf und eine abdominale Kontraktionumfassten 26.
    1. Ordnen Sie 24 weibliche Sprague-Dawley-Ratten (SD-Ratten, 8-10 Wochen alt, mit einem Gewicht von 200 g ± 20 g) in vier Gruppen nach Zufallskontrolle, Modell, CR und CRV ein und füttern Sie sie 7 Tage lang.
    2. Tierverabreichung
      1. Intraperitoneal injizieren Ratten in den Modell-, CR- und CRV-Gruppen täglich 2 ml Estradiolbenzoatlösung. Intraperitoneal injizieren Sie den Ratten in der Kontrollgruppe 2 ml normale Kochsalzlösung.
      2. Führen Sie ab Tag 8 Schritt 2.2.2.1 aus. Verabreichen Sie dann intragastrisch 2 ml CRV-Extrakt an die Ratten in der CRV-Gruppe, 2 ml CR-Extrakt an die Ratten in der CR-Gruppe und 2 ml normale Kochsalzlösung an die Ratten in der Kontroll- und Modellgruppe.
      3. Führen Sie an Tag 10 Schritt 2.2.2.2 aus. Dann injizieren Sie den Ratten in den Modell-, CR- und CRV-Gruppen intraperitoneal 2 ml Oxytocinlösung und den Ratten in der Kontrollgruppe 2 ml normale Kochsalzlösung.
    3. Notieren Sie die Krümmungszeiten der Ratten innerhalb von 30 Minuten nach der Oxytocin-Injektion.
  3. Musterkollektion
    1. Sammeln Sie Blutproben aus der Bauchaorta, entfernen Sie die Gebärmutter schnell und vollständig und trennen Sie sorgfältig das Bindegewebe und das Fett, das an der Gebärmutterwand haftet.
      HINWEIS: Das Blut wurde innerhalb von 1 Stunde nach der letzten Dosis entnommen.
    2. Verwenden Sie Mikrozentrifugenröhrchen, um das Uterusgewebe zu konservieren und auf flüssigen Stickstoff zu übertragen. Lagern Sie die Gewebeproben bei −80 °C.
    3. Zentrifugieren Sie die Blutproben für 10 min bei 4.125 × g. Den serumhaltigen Überstand entfernen und bei 16.502 × g 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Zentrifugieren Sie das Serum und bewahren Sie es dann zur Lagerung bei -80 °C im Röhrchen auf.
      HINWEIS: Die Blutproben müssen zur Wiederaufbereitung 1 h bei Raumtemperatur belassen werden.
  4. Probenverarbeitung
    1. Serumproben
      1. Geben Sie 400 μl Methanol und 200 μl Serum in ein Mikrozentrifugenröhrchen und wirbeln Sie 30 s lang, um sich zu mischen. Jede Probe wird 15 min lang bei 16.502 × g bei 4 °C zentrifugiert. Probenflaschen nach der Entnahme und Filtration mit dem Überstand füllen. Mischen Sie alle Überstände jeder Probe mit dem gleichen Volumen, um Qualitätskontrollproben für die Prüfung vorzubereiten.
    2. Uterusgewebeproben
      1. Nehmen Sie 100 mg Uterusgewebe aus dem ipsilateralen Segment und mahlen Sie es mit einem neunfachen Volumen normaler Kochsalzlösung. Das Homogenisat wird 10 Minuten lang bei 4.125 × g zentrifugiert und der Überstand aufgefangen. Stellen Sie den Überstand zum Testen bei 4 °C oder bei -80 °C in einen Kühlschrank, wenn er nicht am selben Tag getestet werden soll.
      2. Legen Sie normale Kochsalzlösung, Gewebe und Stahlkugeln in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen für 3-5 s in flüssigen Stickstoff und geben Sie das Gewebe dann zum Schleifen in eine Gewebemühle.
  5. Stichprobenprüfung
    1. Verwenden Sie einen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), um den PGF2α - und PGE2-Gehalt im Uterusgewebe der Rattenproben zu messen.
      HINWEIS: Das Ratten-PGE-2-ELISA-Kit wurde verwendet, um den PGE 2-Gehalt zu messen, und das Ratten-PGF-2α-ELISA-Kit wurde verwendet, um den PGF 2α-Spiegel zu messen. Die detaillierten Schritte finden Sie in der Anleitung des Herstellers. Die Details des Kits sind in der Materialtabelle angegeben.
    2. Beurteilen Sie die Serumprobe, den CR-Extrakt und den CRV-Extrakt mit UPLC-MS/MS.
      1. Verwenden Sie für UPLC eine C18-Säule (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) und eine binäre Gradientenmethode mit mobiler Phase A mit 0,1 % Ameisensäure und mobiler Phase B mit Acetonitril. Stellen Sie den Elutionsgradienten wie folgt ein: von 0 min bis 1 min, 15% B; von 1 min bis 8,5 min, 15% bis 85% B; von 8,5 min bis 11,5 min, 85% B; von 11,5 min bis 11,6 min, 99% bis 1% B; und von 11,6 min bis 15 min, 15% B. Stellen Sie die Flussrate auf 0,35 ml/min und das Injektionsvolumen auf 2 μl ein.
      2. Stellen Sie für MS die Temperatur auf 600 °C, den Vorhanggasdurchsatz (CUR) auf 0,17 MPa und sowohl den Mantel- als auch den Hilfsgasdurchsatz auf 0,38 MPa ein. Stellen Sie die Ionensprühspannung des positiven Ionenmodus und des negativen Ionenmodus auf 5,5 kV bzw. -4,5 kV, die Declustering-Potential-Spannung (DP) auf 80 V oder -80 V, die Kollisionsenergie (CE) auf 40 eV oder -25 eV und die Kollisionsenergieüberlagerung (CES) auf 35 eV ± 15 eV ein.
      3. Führen Sie den Test gemäß dem Protokoll des Herstellers mit UPLC-MS/MS durch. Führen Sie MS für einen Massenbereich von 50-1.000 m/z durch.
      4. Ermitteln Sie die UPLC-MS/MS-Ergebnisse mit dem passenden Workstation-Programm in Verbindung mit der informationsabhängigen Erfassung des Erkennungsmodus, dem Mehrfach-Massenfehlerfilter und der dynamischen Hintergrundableitung. Verwenden Sie die Qualitätskontrollproben von gepooltem Serum, um die Wiederholbarkeit und Stabilität der UPLC-MS/MS-Geräte zu testen und den konventionellen Ansatz zu verifizieren. Injizieren Sie die Qualitätskontrollproben vor den Forschungsproben für vier aufeinanderfolgende Durchläufe und injizieren Sie sie dann nach jeweils fünf Serumproben.

3. Datenverarbeitung

  1. Datenaufbereitung
    1. Verwenden Sie eine Konvertierungssoftware, um die Rohdaten in das mzXML-Format zu konvertieren. Normalisieren Sie die Gesamtionenstromdaten (TIC) jeder Probe.
      ANMERKUNG: Eine interne R-basierte Anwendung (www.lims2.com), die auf XCMS basiert, wurde verwendet, um die Informationen für die Integration, Ausrichtung, Extraktion und Peak-Erkennungzu analysieren 27.
    2. Führen Sie eine Metabolitenannotation mit einer proprietären MS2-Datenbank durch (www.lims2.com). Legen Sie den Schwellenwert für Anmerkungen auf 0,328 fest.
      HINWEIS: Die endogenen Metaboliten wurden in jeder Gruppe identifiziert.
  2. Hauptkomponentenanalyse und orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate
    1. Verwenden Sie eine Analysesoftware, um die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die Modellierung durchzuführen. Importieren Sie die standardisierten Daten der Metaboliten in die Analysesoftware. Verwenden Sie dann die automatische Anpassung , um das Analysemodell zu erstellen. Verwenden Sie schließlich die Punktzahl , um das Punktzahl-Streudiagramm der PCA zu erhalten.
      HINWEIS: Die Clusterung jeder Gruppe wurde mit dem Score-Scatter-Diagramm des PCA erhalten. PCA ist ein unbeaufsichtigter Analysemodus, der die Proben hauptsächlich durch Dimensionsreduktion ohne Eingriff gruppiert.
    2. Verwenden Sie die Analysesoftware, um die orthogonale partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (OPLS-DA) durchzuführen.
      1. Importieren Sie die standardisierten Daten zu den Metaboliten in den CR- und CRV-Gruppen in die Analysesoftware.
      2. Importieren Sie die Daten aus der CR-Gruppe in die erstellte CRV-Gruppe und importieren Sie die Daten aus der CRV-Gruppe in die erstellte CRV-Gruppe.
        HINWEIS: OPLS-DA ist ein überwachter Analysemodus, und eine Gruppierung der Proben ist erforderlich.
      3. Verwenden Sie dann die automatische Anpassung , um das Analysemodell zu erstellen, und verwenden Sie die Punktzahl , um das Bewertungsstreudiagramm des OPLS-DA zu erhalten. Verwenden Sie schließlich VIP, um die variable Signifikanz im Projektionswert ( VIP ) im OPLS-DA zu erhalten.
        ANMERKUNG: Die variable Signifikanz der Metaboliten in den CR- und CRV-Gruppen in den Projektionswerten (VIP) wurde durch die OPLS-DA ermittelt.
  3. Identifizierung der potentiellen differentiellen Metaboliten
    1. In Schritt 3.2.2.3 werden die Metaboliten mit VIP-Werten größer als 1 herausgefiltert.
    2. Verwenden Sie statistische Software, um den P-Wert der Metaboliten zu berechnen, die in Schritt 3.3.1 durch den Student's t-Test herausgefiltert wurden.
      HINWEIS: Signifikante Unterschiede in den potentiellen differentiellen Metaboliten in den CR- und CRV-Gruppen wurden durch einen Student's t-Test bestimmt. Die potentiellen differentiellen Metaboliten waren solche mit einem Student's t-Test p-Wert < 0,05 und einer variablen Signifikanz in der Projektion (VIP) größer als 1. Die Darstellung wurde mit einem vulkanischen Grundstück durchgeführt.
  4. Identifizierung der differentiellen Metaboliten
    1. Sieben Sie die potentiellen differentiellen Metaboliten in Schritt 3.3 aus. Verwenden Sie die Ergebnisse von Schritt 3.1.2, um diese differentiellen Metaboliten zu identifizieren.
      ANMERKUNG: Es wurde eine kleine Anzahl potenzieller differentieller Metaboliten identifiziert, die zu den Kandidaten-Differentialmetaboliten wurden.
    2. Filtern Sie die Differentialmetaboliten aus, die in der KEGG-Datenbank abgeglichen werden sollen. Zeigen Sie die Veränderungen der differentiellen Metaboliten in den CR- und CRV-Gruppen, indem Sie eine Heatmap zeichnen.
      ANMERKUNG: Eine kleine Anzahl von Kandidaten-Differentialmetaboliten wurde abgeglichen, und sie wurden zu den Differentialmetaboliten.
  5. Untersuchung der potentiellen Stoffwechselwege
    1. Laden Sie die verschiedenen Metaboliten in die Datenbank von Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca) hoch.
    2. Verwenden Sie die Pfadanalyse , um die potenziellen Stoffwechselwege zu erhalten.
      HINWEIS: Die potentiellen Stoffwechselwege wurden in den CR- und CRV-Gruppen ermittelt. Der P-Wert und der Wirkungswert waren zwei sehr wichtige Indikatoren bei der Auswahl der kritischen Pfade. Der P-Wert war wichtiger als der Aufprallwert. Die Signifikanz wurde durch einen P-Wert < 0,05 definiert; Größere Impact-Werte waren mit besseren Korrelationen verbunden.
    3. Analysieren Sie die potenziellen Stoffwechselwege, indem Sie die verschiedenen Metaboliten in die KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)-Datenbank hochladen.
      HINWEIS: Der Zusammenhang zwischen der Funktion des Stoffwechselweges und der Parkinson-Krankheit sollte ebenfalls berücksichtigt werden. Die kritischen Stoffwechselwege wurden erhalten.
  6. Identifizierung der in das Blut aufgenommenen Bestandteile
    1. Identifizieren Sie die chemischen Bestandteile in den CR- und CRV-Extrakten mithilfe der hauseigenen MS2-Datenbank (www.lims2.com), der Human Metabolome Database (HMDB) und der Massbank- und Chemspider-Datenbanken.
    2. Bestimmen Sie die Bestandteile, die in den CR- und CRV-Gruppen in das Blut aufgenommen werden, und vergleichen Sie die Bestandteile zwischen den CR- und CRV-Gruppen.
      ANMERKUNG: Die in das Blut aufgenommenen Bestandteile müssen in der CR- oder CRV-Gruppe nachgewiesen werden, können jedoch nicht in der Kontrollgruppe nachgewiesen werden.
  7. Statistische Analyse
    1. Analysieren Sie die Daten mit univariater Analyse (UVA) und multivariaten statistischen Methoden, einschließlich der Varianzanalyse (ANOVA) und des Student's t-Test.
      ANMERKUNG: Die experimentellen Informationen wurden unter Verwendung statistischer Software als Mittelwert ± Standardabweichung (±SD) dargestellt. P < 0,01 wurde als hochsignifikanter Unterschied angesehen, und P < 0,05 stellte einen signifikanten Unterschied dar28.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse des Dysmenorrhoe-Modellversuchs
In der Kontrollgruppe gab es innerhalb von 30 Minuten keine sich windende Reaktion, da diesen Ratten nicht intraperitoneal Oxytocin und Estradiolbenzoat injiziert wurden, um Schmerzen zu verursachen. Die Ratten in den Modell-, CR- und CRV-Gruppen zeigten nach der Oxytocin-Injektion erhebliche Krümmungsreaktionen. Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit der Kombination aus Estradiolbenzoat und Oxytocin bei der Induktion von Dysmenorrhoe. Die Unterschiede in den P...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aufgrund der großen Vielfalt und der unterschiedlichen Natur von TCMs funktionieren diese Kräuter manchmal nicht in der klinischen Praxis, und dies kann auf die unsachgemäße Verarbeitung und Abkochung von TCMs zurückzuführen sein. Die Mechanismen der TCM werden mit dem Einsatz zeitgenössischer Wissenschaft und Technologie deutlicher29,30. Diese Studie zeigt, dass sowohl CR als auch CRV therapeutische Wirkungen bei Parkinson-Modellratten haben und dass die therape...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Chongqing Municipal Health and Family Planning Commission Chinese Medicine Science and Technology Project (Projektnummer: ZY201802297), das allgemeine Projekt der Chongqing Natural Science Foundation (Projektnummer: cstc2019jcyj-msxmX065), das Chongqing Modern Mountain Area Characteristic High-efficiency Agricultural Technology System Innovation Team Building Plan 2022 [10] und das Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project of Chinese Materia Medica-Verarbeitung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitril Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20Beckman  Coulter, Inc.
EstradiolbenzoatShanghai Macklin Biochemical Co., LtdC10042616
AmeisensäureFisher Scientific, Pittsburg, PA, USA177799
LC 30A SystemShimadzu, Kyoto, Japan228-45162-46
OlivenölShanghai Yuanye Biotechnology Co., LtdH25A11P111909
Oxytocin synthetischVerifizierter Lieferant - Zhejiang Peptide Biology Co., Ltd 
Ratte PGF2α ELISA-KitShanghai lmai Bioengineering Co., Ltd202101
Ratte PGFE2 ELISA-KitShanghai lmai Bioengineering Co., LtdEDL202006217
SPF Sprague-Dawley RattenHunan SJA Laboratory Animal Co., LtdZertifikatsnummer SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Österreich1510002987
Triple TOF 4600 SystemSCIEX, Framingham, MA, USABK20641402
WasserFisher Scientific, Pittsburg, PA, USA152720
MRZ15K0472019092001

References

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