Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

معالجة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية للتطبيقات السريرية باستخدام سير عمل مغلق شبه آلي

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64707
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2, 1
1Bioprocessing Technology Institute (BTI), Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لحصاد الخلايا الملتصقة من قوارير متعددة الطبقات بطريقة مغلقة شبه آلية باستخدام نظام طرد مركزي معاكس. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لحصاد كل من الخلايا الملتصقة والمعلقة من منصات توسيع الخلايا الأخرى مع تعديلات قليلة على الخطوات الحالية.

Abstract

يتم حاليا استكشاف الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) كطريقة علاجية واعدة قائمة على الخلايا لمختلف الأمراض ، مع توقع المزيد من الموافقات في السوق للاستخدام السريري خلال السنوات القليلة المقبلة. لتسهيل هذا الانتقال ، تعد معالجة اختناقات الحجم ، وقابلية التكرار من دفعة إلى دفعة ، والتكلفة ، والامتثال التنظيمي ، ومراقبة الجودة أمرا بالغ الأهمية. يمكن معالجة هذه التحديات عن طريق إغلاق العملية واعتماد منصات التصنيع الآلي. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير عملية مغلقة وشبه آلية لتمرير وحصاد هلام وارتون (WJ) المشتق من hMSCs (WJ-hMSCs) من قوارير متعددة الطبقات باستخدام الطرد المركزي المعاكس. تم توسيع WJ-hMSCs باستخدام وسيط خال من xeno المتوافق مع اللوائح التنظيمية (SFM XF) ، وأظهرت تكاثر خلايا مماثل (مضاعفة السكان) ومورفولوجيا ل WJ-hMSCs الموسعة في الوسائط الكلاسيكية المحتوية على المصل. أظهر بروتوكول الحصاد شبه الآلي المغلق الخاص بنا استردادا عاليا للخلايا (~ 98٪) وقابلية للحياة (~ 99٪). حافظت الخلايا التي تم غسلها وتركيزها باستخدام الطرد المركزي للتدفق المعاكس على تعبير علامة سطح WJ-hMSC ، ووحدات تشكيل المستعمرات (CFU-F) ، وإمكانية تمايز النسب الثلاثي ، وملامح إفراز السيتوكين. يمكن تطبيق بروتوكول حصاد الخلايا شبه الآلي الذي تم تطويره في الدراسة بسهولة على المعالجة الصغيرة والمتوسطة الحجم لمختلف الخلايا الملتصقة والمعلقة عن طريق الاتصال المباشر بمنصات توسيع الخلايا المختلفة لأداء تقليل الحجم والغسيل والحصاد بحجم إنتاج منخفض.

Introduction

تعد الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) مرشحا رائعا للتطبيقات السريرية ، سواء في هندسة الأنسجة أو في العلاجات الخلوية ، نظرا لإمكاناتها العلاجية وقدرتها العالية على التجديد الذاتي للنمو في المختبر ، والتي تعتبر ضرورية لتوليد جرعات ذات صلة سريريا من الخلايا1،2،3. وفقا ل ClinicalTrials.gov ، هناك أكثر من 1000 تجربة سريرية قيد التحقيق حاليا لحالات مرضية مختلفة4. بالنظر إلى خلفية الاهتمام المتزايد باستخدام hMSCs ، فإن المزيد من التجارب السريرية وموافقات السوق وشيكة في المستقبلالقريب 5,6. ومع ذلك ، فإن تصنيع hMSCs لديه العديد من التحديات المتأصلة من حيث التباين من دفعة إلى أخرى ، واستخدام المواد الخام عالية الخطورة ، والمخاوف المتعلقة بالتلوث بسبب العديد من العمليات المفتوحة واليدوية ، حيث يتضمن التصنيع عمليات وحدة متعددة ، وارتفاع تكاليف العمالة ، وتكلفة التوسع أو التوسع ، والعقبات التنظيمية6،7،8،9،10 ، 11,12. ولا تزال هذه القضايا تشكل عائقا كبيرا أمام الوصول إلى الأسواق في الحاضر والمستقبل.

إن تطوير حلول التصنيع المغلقة والمعيارية والآلية واستخدام الكواشف المساعدة منخفضة المخاطر من شأنه أن يعالج هذه التحديات. سيضمن ذلك أيضا جودة المنتج المتسقة ، ويقلل من احتمالية فشل الدفعات بسبب الخطأ البشري ، ويقلل من تكاليف العمالة ، ويحسن توحيد العمليات والامتثال التنظيمي ، كما هو الحال فيما يتعلق بحفظ سجلات الدفعات الرقمية8،12،13،14. لتكون قادرا على الحصول على جرعة ذات صلة سريريا من الخلايا ، سواء كانت ذاتية أو خيفية ، فإن التصنيع المبسط الذي يتضمن توسيع الخلايا الأولية ومعالجة المصب بطريقة مغلقة وآلية أمر بالغ الأهمية.

بالنسبة لتوسيع hMSC في المنبع ، فإن طريقتي التصنيع الأكثر شيوعا المستخدمتان حاليا هما التوسع (2D أحادي الطبقة) والتوسع (نظام التعليق القائم على الناقل الصغير ثلاثي الأبعاد) 15،16،17،18. الطريقة الأكثر تقليدية والمعتمدة على نطاق واسع لتوسيع hMSC هي الثقافة أحادية الطبقة 2D بسبب انخفاض تكلفة الإنتاج وسهولة الإعداد19.

تستخدم القوارير متعددة الطبقات المكونة من صواني ذات سطح مستو مكدسة داخل وعاء استزراع بشكل شائع لتوسيع نطاق إنتاج hMSC. تأتي هذه الأنظمة عادة في أوعية استزراع من طبقة 1 إلى 40 طبقة20 ويتم التعامل معها يدويا داخل خزانات السلامة الأحيائية. تتضمن خطوات المعالجة أثناء مرور الخلايا وحصادها توزيع وصب وسائط التمدد يدويا ، وكاشف التفكك ، وغسل المخزن المؤقت عن طريق سحب الوعاء بأكمله أو إمالته جسديا. إلى جانب ذلك ، يعد التعامل مع وحدات متعددة أمرا صعبا ويستغرق وقتا طويلا نظرا لحجمها ووزنها الهائل.

بعد ذلك ، يعد ما بعد الحصاد من القوارير متعددة الطبقات ، والطرد المركزي لتبادل الوسائط ، وغسل الخلايا ، وتقليل الحجم خطوات أساسية عبر سير عمل تصنيع الخلايا بالكامل21. الطرد المركزي التقليدي على الطاولة هو عملية مفتوحة ويدوية في الغالب تتضمن العديد من الخطوات ، مثل نقل تعليق الخلية إلى أنابيب أو زجاجات مغطاة داخل خزانة السلامة البيولوجية ، وتدوير الخلايا ، واستنشاق المادة الطافية يدويا ، وإعادة تعليق الخلية مع المخزن المؤقت ، وغسل الخلايا المتكرر. هذا يزيد بشكل كبير من خطر التلوث بسبب فتح وإغلاق الأغطية وفرص فقدان حبيبات الخلية أثناء عملية الشفط / السحب اليدوي22. في سياق التعامل مع أنظمة الاستزراع متعددة الطبقات للخلايا القائمة على الالتصاق مثل hMSCs ، سيحتاج المشغل إلى المرور بعملية شاقة من التنقل بين أجهزة الطرد المركزي وخزانة السلامة البيولوجية بشكل متكرر والتعامل مع وحدة ثقيلة في نفس الوقت. هذه الخطوات اليدوية شاقة ، وتشكل مخاطر من حيث الأخطاء البشرية والتلوث ، ويجب إجراؤها في بيئة غرفة نظيفة من الفئة ب ، وهي مكلفة23. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عملية الطرد المركزي اليدوية التقليدية غير قابلة للتطوير ويمكن أن تسبب القص الخلوي والإجهاد ؛ وبالتالي ، فإن تعظيم استعادة الخلايا ، والقدرة على البقاء ، وكفاءة غسل الشوائب المتبقية هي تحديات رئيسية أخرى22. يتطلب التصنيع التجاري على نطاق cGMP للعلاجات الخلوية حلول أتمتة معيارية مغلقة لتقليل مخاطر التلوث ، وضمان جودة المنتج المتسقة ، وتقليل تكاليف العمالة والإنتاج ، وزيادة موثوقية العملية24,25. يمكن التعامل مع القوارير متعددة الطبقات كنظام مغلق من خلال وجود مرشح معقم 0.2 ميكرومتر في أحد المنافذ لتسهيل تبادل الغازات المعقمة ومنفذ ثان متصل بشكل معقم عبر موصلات أو أنبوب ملحوم مباشرة بأداة معالجة الخلايا الآلية لحصاد الخلايا. لقد عملنا على إغلاق وأتمتة معظم خطوات تمرير وحصاد WJ-hMSC من خلال تقييم جهاز طرد مركزي مغلق مبتكر للتدفق المعاكس مخصص لتصنيع المنتجات القائمة على الخلايا أو الجينات أو الأنسجة. يتمتع جهاز الطرد المركزي ذو التدفق المعاكس أيضا بالمرونة اللازمة لأداء مجموعة متنوعة من تطبيقات معالجة الخلايا ، مثل فصل الخلايا بناء على الحجم ، والتبادل المتوسط / العازل ، والتركيز ، والحصاد لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا8،26،27،28. تستخدم الأداة مجموعة مغلقة للاستخدام مرة واحدة يمكن توصيلها بشكل معقم باستخدام لحام الأنبوب أو الموصلات المعقمة لنقل الأكياس أو يمكن توصيلها مباشرة بأي منصة تمدد من اختيارك.

في هذه الدراسة ، قمنا بتصميم مجموعة أنابيب مخصصة للسماح بالوصلات المعقمة المغلقة بين مجموعة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس ذات الاستخدام الواحد والقارورة متعددة الطبقات. لقد قمنا بتحسين بروتوكول لفصل وغسل وحصاد WJ-MSCs إنزيميا من القارورة متعددة الطبقات بطريقة مغلقة تماما وشبه آلية خلال جولة واحدة. تم تمييز WJ-hMSCs المحصودة من حيث النقاء (تحليل علامات السطح) والفعالية (CFU-F ، والتمايز ثلاثي النسب ، وملامح إفراز السيتوكينات) لضمان أن المنتج النهائي يلبي سمات الجودة الحرجة (CQAs) لإطلاق الكثير.

Protocol

1. إعداد وسائط الاستزراع وطلاء أوعية الاستزراع

  1. الإعداد الإعلامي
    1. تكوين الوسط الكلاسيكي المحتوي على المصل: تحضير الوسط الكلاسيكي المحتوي على المصل عن طريق خلط αMEM (445 مل) ، مصل الجنين البقري (FBS) (50 مل) ، و 100x البنسلين والستربتومايسين (5 مل).
    2. قم بإعداد وسيط SFM XF الكامل.
      1. اصنع زجاجة سعة 500 مل عن طريق إضافة 5 مل من مكمل SFM XF (100x) و 5 مل من 100x L-alanyl-L-glutamine (انظر جداول المواد) إلى الوسط القاعدي SFM XF (500 مل).
      2. اصنع حقيبة وسائط سعة 2 لتر عن طريق إضافة 20 مل من مكمل MSC SFM XF المخصص (100x) و20 مل من 100x L-alanyl-L-glutamine (انظر جداول المواد) إلى الكيس المتوسط القاعدي SFM XF (2 لتر) عن طريق توصيل حقنة سعة 50 مل بالمنفذ المناسب للحقيبة.
        ملاحظة: قبل الاستخدام في المستزرع، أضف عوامل النمو أو السيتوكينات (غير المزودة مع الوسط) إلى وسط SF XF الكامل: PDGF-BB (20 نانوغرام/مل)، FGF Basic (4 نانوغرام/مل)، وTGFβ (0.5 نانوغرام/مل).
  2. طلاء أوعية زراعة الخلايا بالفيترونيكتين للاستخدام مع الوسائط الخالية من المصل
    1. قم بإذابة مخزون من الفيترونيكتين (VTN-N ؛ 0.9 مجم / مل) عند 4 درجات مئوية.
    2. استخدم محلول ملحي مخزن من Dulbecco المعقم بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS) لتخفيف VTN-N المذاب إلى تركيز عمل يبلغ 5 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: قم بتخفيف VTN-N مباشرة قبل الاستخدام ، ولا تقم بتخزين محلول الفيترونيكتين المخفف.
    3. أضف 1 مل / 10 سم2 من محلول VTN-N المخفف إلى وعاء الاستزراع المقابل ؛ التركيز النهائي هو 0.5 ميكروغرام / سم2. على سبيل المثال ، أضف 7.5 مل من محلول VTN-N المخفف إلى قارورة T-75 (75 سم2) ؛ إضافة 17.5 مل من محلول VTN-N المخفف إلى قارورة T-175 (175 سم2) ؛ إضافة 250 مل من محلول VTN-N المخفف إلى دورق قياسي متعدد الطبقات رباعي الطبقات (2528 سم2) ؛ وأضف 630 مل من محلول VTN-N المخفف إلى دورق متعدد الطبقات من 10 طبقات (6320 سم2).
    4. في ظل ظروف معقمة ، احتضان الأوعية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: يمكن تخزين وعاء الاستزراع المطلي في 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع. لف وعاء الاستزراع بغشاء مختبري لمنعه من الجفاف. قبل الاستخدام ، قم بتسخين وعاء الاستزراع مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
    5. قم بنضح محلول VTN-N ، وتخلص منه ، وأضف على الفور حجما كافيا من وسط الاستزراع لمنع سطح الوعاء المطلي من الجفاف.
      ملاحظة: ليس من الضروري شطف وعاء الاستزراع بعد إزالة VTN-N.

2. توسيع WJ-hMSC

  1. قم بإذابة WJ-hMSCs (p2) بسرعة عن طريق وضع cryovial في حمام مائي 37 درجة مئوية ؛ قم بتدوير القارورة ببطء حتى تبدأ المحتويات في التذويب.
  2. عند الذوبان ، قم بزرع WJ-hMSCs عند 5000 خلية / سم 2 في دورق T-175 (بدون طلاء VTN-N) ، واحتضانها في الوسط الكلاسيكي المحتوي على المصل عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 لتوسيع الخلايا. بعد مقطعين (p4) ، قم بتخزين الخلايا الموسعة في وسط الحفظ بالتبريد المطلوب كبنك خلايا عامل (WCB).
  3. قم بإجراء عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي باتباع طريقة الجدوى وعدد الخلايا لتحديد إجمالي عدد الخلايا وصلاحية الخليةوحجم الخلية 29.
  4. من p4 ، قم بزراعة WJ-hMSCs عند 5000 خلية / سم2 في قوارير T-75 إما في وسط كلاسيكي يحتوي على مصل أو وسط SFM XF (استخدم قوارير مغلفة ب VTN-N مع وسط SFM XF).
  5. الحفاظ على الخلايا في كلا الوسطين المستزرعين لما مجموعه ثلاثة ممرات (12 يوما) ، وقياس تمدد الخلية (زيادة الطي) في كل ممر بقسمة عدد الخلايا القابلة للحياة التي تم عدها في نهاية مزرعة كل ممر على عدد الخلايا القابلة للحياة في بداية المزرعة (يوم بذر الخلية).

3. توسيع نطاق قطار البذور

  1. توسيع WJ-hMSC في قارورة T-175
    1. قم بإذابة WJ-hMSCs عند p4 بسرعة عن طريق وضع cryovial في حمام مائي 37 درجة مئوية ؛ قم بتدوير القارورة ببطء حتى يبدأ المحلول في التذويب.
    2. بذر 5000 خلية / سم2 في دورق T-175 المطلي ب VTN-N. اسمح للخلايا بالنمو في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    3. استبدل وسط الاستزراع المستهلك كل 2-3 أيام بوسط SFM XF كامل تم تسخينه مسبقا طازجا للحصول على الأداء الأمثل ونمو الخلايا.
  2. التعامل مع القوارير متعددة الطبقات (الشكل 1 أ ، ب)
    1. يجب إجراء جميع الوصلات المعقمة في بيئة معقمة.
    2. قم بفك القارورة متعددة الطبقات داخل خزانة السلامة البيولوجية.
    3. قم بتوصيل مرشح الهواء المعقم مسبقا (0.2 ميكرومتر) بمنفذ واحد للسماح بتحرير الضغط أثناء نقل السوائل باستخدام جهاز الطرد المركزي للتدفق المعاكس.
    4. قم بتركيب موصل القارورة متعدد الطبقات من مجموعة الأنابيب المخصصة في المنفذ الآخر (الشكل 1B).
    5. قم بلحام خط PVC للأنابيب المخصصة التي تم ضبطها على كيس نقل PVC سعة 2 لتر يحتوي على وسيط SFM XF كامل.
      ملاحظة: امزج الكيس المتوسط تماما قبل إضافته إلى النظام متعدد الطبقات عن طريق تدفق الجاذبية. تأكد من أن كيس النقل PVC معلق أعلى من القارورة متعددة الطبقات.
    6. ضع القارورة متعددة الطبقات على جانبها الطويل ، مع وجود مرشح الهواء في الأعلى (الشكل 1 ب).
    7. افتح المشبك الموجود على أنبوب PVC لبدء ملء القارورة متعددة الطبقات. تأكد من أن الوسيط مستو بين الصواني أثناء التعبئة.
    8. بمجرد تسوية الوسط بالكامل في جميع الصواني ، أدر القارورة متعددة الطبقات على جانبها القصير مع وضع المنافذ في وضع مستقيم.
    9. أغلق المشبك الموجود على خط PVC ، وقم بإزالة كيس النقل عن طريق استبدال وصلة الأنبوب بغطاء الإغلاق الأزرق MPC.
      ملاحظة: لا تقم بإزالة مرشح الهواء ، لأن هذا يسمح بتبادل الغازات أثناء تمدد الخلية.
    10. تحويل قارورة متعددة الطبقات إلى موقف الحضانة.
      ملاحظة: يجب أن يكون الفلتر ووصلة الأنبوب متجهين لأعلى.
    11. إفراغ القارورة متعددة الطبقات عن طريق توصيلها بزجاجة شفاط ؛ ضعه فوق زجاجة الشافطة ، وسوف يتدفق السائل.
      ملاحظة: قم بإمالة القارورة متعددة الطبقات على جانبها لتصريف الوسط المستهلك تماما عن طريق الجاذبية. بدلا من ذلك ، يمكن سكب الوسيط المستهلك في زجاجة نفايات باستخدام مجموعة أنابيب مخصصة.
    12. كرر الخطوات 3.2.5-3.2.11 لتجديد الوسط الجديد.
  3. الاستزراع الفرعي ل WJ-hMSCs في القارورة متعددة الطبقات (T-175 > 4 طبقات > 10 طبقات)
    1. كاشف تفكك الخلايا قبل التسخين (TrypLE) ووسط SFM XF الكامل داخل حاضنة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. نضح الوسط المستهلك من قارورة T-175 وتجاهلها.
    3. اغسل الطبقة الأحادية للخلية باستخدام DPBS الذي تم تسخينه مسبقا ، ونضح ، وتخلص منه.
    4. أضف TrypLE إلى كل قارورة ، وتأكد من التغطية الكاملة للطبقة الأحادية للخلية ، واحتضانها لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    5. انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.
    6. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 100-200 × جم لمدة 5 دقائق في RT. نضح وتجاهل DPBS ، واحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في الحد الأدنى من الحجم (10 مل) من وسيط SFM XF الكامل قبل التسخين لعد الخلايا.
    8. املأ وعاء استزراع رباعي الطبقات مطلي ب VTN-N بحوالي 800 مل من وسط SFM XF الكامل ، كما هو مذكور في القسم 2 أعلاه. أضف 5000 خلية / سم2 (أي 1.26 × 107 خلايا / قارورة قابلة للحياة). قم بتدوير تعليق الخلية برفق لضمان التوزيع المتساوي.
    9. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 في جو مرطب.
    10. استبدل وسط الاستزراع المستهلك كل 2-3 أيام بوسط SFM XF كامل جديد تم تسخينه مسبقا لتحقيق النمو الأمثل للخلايا حتى تصل الخلايا إلى التقاء 60٪ -80٪ أو تكون جاهزة للاستزراع الفرعي في دورق متعدد الطبقات مكون من 10 طبقات.
    11. املأ دورقا متعدد الطبقات متعدد الطبقات مطلي ب VTN-N بحوالي 2 لتر من وسيط SFM XF الكامل ، كما هو مذكور في القسم 2. أضف 5000 خلية / سم2 (أي 3.1 × 107 خلايا / قارورة). قم بتدوير تعليق الخلية برفق لضمان التوزيع المتساوي.
    12. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 في جو مرطب.
    13. استبدل وسط الاستزراع المستهلك كل 2-3 أيام بوسط SFM XF كامل جديد تم تسخينه مسبقا لنمو الخلايا الأمثل حتى تصل الخلايا إلى التقاء 60٪ -80٪ أو تكون جاهزة للحصاد.

4. تفكك وحصاد WJ-hMSC شبه الآلي المغلق باستخدام الطرد المركزي المغلق للتدفق المعاكس

  1. مجموعة أدوات الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس للاستخدام مرة واحدة
    1. قم بتوصيل المجموعة ذات الاستخدام الواحد بأكياس النقل البلاستيكية ذات الاستخدام الواحد عبر لحام الأنبوب ، على غرار التكوين الموضح في الشكل 1A.
      ملاحظة: معدل التدفق الافتراضي للمجموعة ذات الاستخدام الواحد هو 30-165 مل / دقيقة.
    2. قم بتوصيل دورق متعدد الطبقات من 10 طبقات يحتوي على WJ-hMSCs متقاربة بمجموعة الأنابيب المخصصة داخل خزانة السلامة البيولوجية.
    3. انقل وعاء الاستزراع المكون من 10 طبقات المرفق مع مجموعة الأنابيب المخصصة إلى مقعد ، وقم باللحام بالخط E (3/32 في ID PVC) للمجموعة ذات الاستخدام الواحد ، كما هو موضح في الشكل 1B.
    4. تأكد من لحام منفذ عينة معقمة بالخط G من المجموعة ذات الاستخدام الواحد عالية التدفق.
    5. بعد ذلك ، قم بتوصيل خط الحصاد H ب Luer معقم مزود بحقنة سعة 50 مل.
      ملاحظة: في جميع الخطوات المذكورة أعلاه ، تأكد من إغلاق المشابك اليدوية لتأمين السائل في كل كيس عدة.
  2. إعداد تشغيل الآلة
    1. قم بتشغيل الجهاز " ON" عن طريق تشغيل مفتاح التبديل في الجزء الخلفي من الجهاز.
    2. قم بتوصيل الكمبيوتر المحمول بمنفذ USB-C على الجهاز باستخدام كابل USB-C المرفق (الشكل 1B).
    3. قم بتشغيل برنامج واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لأجهزة الطرد المركزي المعاكسة من سطح المكتب أو قائمة ابدأ.
    4. بعد تسجيل الدخول ، قم بتحميل البروتوكول بالنقر فوق الزر تحديد بروتوكول في صفحة الترحيب الرئيسية.
      ملاحظة: تم إنشاء بروتوكول حصاد الطرد المركزي للتدفق المعاكس (الجدول 1) باستخدام برنامج Protocol Builder وتخزينه محليا.
    5. اضغط على زر إلغاء القفل الأزرق على الجهاز ، وافتح الباب الزجاجي.
    6. قم بتحميل المجموعة المجمعة ذات الاستخدام الواحد على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس.
    7. ابدأ بتعليق الأكياس المعلقة على خطافات الشماعات بترتيب يصطفها بشكل أفضل مع منافذ الأنبوب الموجودة على شرائط مستشعر الفقاعات ، مع وضع الدورق متعدد الطبقات المكون من 10 طبقات بزاوية ، كما هو موضح في الشكل 1 ب.
    8. قم بمحاذاة المجموعة باستخدام زري موقع المجموعة ، وقم بتمديد أنبوب المضخة حول المضخة التمعجية ، واضغط على الموصل الأبيض على شكل لمبة في مكانه.
      ملاحظة: تأكد من وضع الأنبوب الموجود فوق مستشعر الضغط بشكل صحيح في مسار الأنبوب.
    9. قم بتوصيل غرفة الطرد المركزي عن طريق رفع الرافعة الفضية لحامل غرفة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس وتأمينها عن طريق إعادة الرافعة إلى وضعها الرأسي.
    10. اضغط على الأنبوب من كل منفذ على المجموعة إلى المسارات على طول شرائط مستشعر الفقاعة.
      ملاحظة: تأكد من عدم تشابك الأكياس حتى يمكن اتباع عملية البروتوكول بسهولة.
    11. أغلق الباب بالضغط لأسفل على مزلاج الباب.
      ملاحظة: سيتم إغلاق ذراع مشبك المضخة ، وستدور غرفة الطرد المركزي ، وستغلق الصمامات. بدون إغلاق الباب ، لن يتمكن النظام من بدء البروتوكول وتشغيله.
    12. ضرب زر البدء في واجهة المستخدم الرسومية. ستظهر قائمة مرجعية ؛ العناصر الأربعة الأولى هي فحوصات الأدوات ، والعنصران الأخيران هما فحوصات المستخدم (تأكد من تطابق الحقائب والوصلات مع صورة المجموعة ، وتأكد من فتح المشابك اليدوية).
      ملاحظة: بالنسبة لفحوصات الجهاز، تظهر علامة X الحمراء بدلا من علامات الاختيار الزرقاء إذا كان هناك شيء غير صحيح.
    13. اضغط على تأكيد لإظهار شاشة مدخلات البروتوكول.
    14. قم بتعيين قيمة مربع الحوار إدخال البيانات (حجم الحصاد) على أنها 45 مل ، واضغط على تأكيد.
      ملاحظة: ستتم مطالبة شاشة إدخال البروتوكول إذا تم تعيين أي إدخالات بيانات متغيرة في البروتوكول الذي أنشأه المستخدم. يتم تعيين حجم الحصاد كمتغير في هذا البروتوكول ، ويمكن للمستخدم اختيار اختبار أحجام مختلفة اعتمادا على متطلبات كثافة الخلية النهائية. الحد الأدنى لحجم الحصاد الذي يسمح به النظام هو 5 مل. يسمح النظام بتعيين أربعة متغيرات بيانات فقط كحد أقصى لكل بروتوكول.
  3. تشغيل البروتوكول
    1. انقر فوق بدء في واجهة المستخدم الرسومية ، واضغط على زر البدء الأخضر على الجهاز لبدء تشغيل البروتوكول (راجع الجدول 1).
      ملاحظة: سيبدأ النظام الخطوات وفقا للبروتوكول بدءا من تسلسل التحضير عن طريق استبدال الهواء في النظام بمخزن مؤقت.
    2. بمجرد اكتمال التحضير (الجدول 1 ، الخطوة 8) تأكد من ضخ الوسيط المستهلك بالكامل في كيس النفايات.
      ملاحظة: بمجرد أن تكون القارورة متعددة الطبقات المكونة من 10 طبقات فارغة ، سيطلب النظام من المستخدم في واجهة المستخدم الرسومية تأكيد ما إذا كانت السفينة فارغة. اضغط على زر "تخطي" على الجهاز إذا كان الوعاء فارغا ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضغط على الزر الأخضر "تشغيل / إيقاف مؤقت" لمواصلة تصريف أي سوائل متبقية من الوعاء.
    3. في خطوات الإيقاف المؤقت 15 و 19 و 22 (الجدول 1) ، تأكد من رفع القارورة متعددة الطبقات ورجها لتوزيع المخزن المؤقت بالتساوي على جميع الأدراج. بمجرد الانتهاء ، ضع القارورة متعددة الطبقات المكونة من 10 طبقات مرة أخرى في موضع السحب الأصلي للخطوات التالية.
      ملاحظة: بالنسبة للخطوة 19 في الجدول 1 فقط ، بعد الهز ، تأكد من وضع القارورة متعددة الطبقات بشكل مسطح ، واحتضانها لمدة 10-15 دقيقة في RT لفصل الخلايا.
    4. في الخطوة 20 والخطوة 23 (الجدول 1) ، تأكد من نقل الخلايا التربسينية بالكامل إلى الكيس الوسيط.
    5. امزج الكيس الوسيط جيدا يدويا في الخطوة 25 (الجدول 1).
    6. في الخطوة 26 (الجدول 1) ، استخدم حقنة Luer سعة 2 مل لأخذ عينات من خلال منفذ أخذ العينات.
      ملاحظة: يوصى بأخذ عينات ثلاث مرات على الأقل للحصول على عدد دقيق للخلايا.
    7. في الخطوة 29 والخطوة 30 (الجدول 1) ، تحقق من التكوين المستقر لطبقة الخلية المميعة ؛ يجب أن يكون مشابها لطبقة الخلية المميعة كما هو موضح في الشكل 1C.
      ملاحظة: إذا لم يتم تشكيل طبقة الخلية المميعة المستقرة بشكل مشابه لتلك الموضحة في الشكل 1C ، فإن تحسين نسبة قوة g إلى معدل التدفق (G / F) أمر بالغ الأهمية لتحقيق طبقة خلية مميعة مستقرة (استرداد خلية عالية) في الغرفة أثناء تحميل الخلية وخطوات الغسيل. تعتمد نسبة G / F على حجم الخلايا وكثافة الوسط. هناك حاجة إلى نسبة G/F عالية للعينة عالية الكثافة / المخزن المؤقت للغسيل ، بينما يمكن استخدام نسبة G / F منخفضة لعينة منخفضة الكثافة / مخزن مؤقت للغسيل.
    8. يكتمل التشغيل عند خطوة المنحدر إلى التوقف (الخطوة 35 في الجدول 1) ، وسيتم إغلاق جميع قيم الضغط على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس تلقائيا.
      ملاحظة: أخيرا ، تأكد من إغلاق المشابك اليدوية لتأمين السائل في كل كيس عدة قبل فتح الباب.
    9. بعد اكتمال تشغيل البروتوكول ، اضغط على زر إلغاء القفل الأزرق على الجهاز ، وافتح الباب الزجاجي. خذ المجموعة ذات الاستخدام الواحد مع التركيز المحصود من الجهاز.
    10. قم بإغلاق خط الحصاد بشكل معقم باستخدام سدادة أنبوب محمولة يدويا. انقل بعناية المحقنة المختومة المملوءة بحصاد الخلايا المركزة إلى خزانة السلامة البيولوجية لعد الخلايا وحفظها بالتبريد.
    11. افصل الحجرة مرة أخرى باستخدام الرافعة ، واسحب موصل المصباح من تركيبته وارفع المجموعة بعناية بعيدا ، وتخلص منها في كيس بيولوجي.
    12. نظف الأداة باستخدام مناديل الإيثانول ، وتأكد من إغلاق الباب.
    13. أغلق تطبيق واجهة المستخدم الرسومية أولا قبل إيقاف تشغيل المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز.
      ملاحظة: تم اختبار بروتوكول حصاد الخلايا في ثلاث نسخ بيولوجية (ن = 3).

5. تقييم سمات الجودة الحرجة (CQA)

  1. علامات سطح هوية الخلية (CD73 و CD90 و CD105) وعلامات غير انسجة (CD34 و CD45)
    1. قم بتخفيف معلق خلية WJ-hMSC المحصود إلى تركيز 1 × 106 خلايا قابلة للحياة / مل عن طريق إضافة حجم مناسب من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي (DPBS مع 1٪ BSA أو 2٪ FBS).
    2. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق أو لوحة 96 بئرا. تأكد من وجود ما لا يقل عن 0.1 × 106 خلايا لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية.
    3. أضف جسما مضادا مقترنا بالفلوروفور إلى العينة بتخفيف مناسب ، على النحو الموصى به من قبل بائع الأجسام المضادة.
    4. احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام.
    5. بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي لغسل العينات عن طريق الطرد المركزي عند 380 × جم لمدة 3 دقائق.
    6. تخلص من المادة الطافية ، واترك الحبيبات خلفك.
    7. إعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي ، وتخضع لتحليل قياس التدفقالخلوي 30.
  2. وحدات تشكيل المستعمرة مقايسة الخلايا الليفية (CFU-F)
    1. خفف معلق الخلية إلى تركيز 1000 خلية قابلة للحياة / مل من وسط الاستزراع الكامل.
    2. لوحة ~ 500 خلية لكل بئر في لوحة زراعة الأنسجة 6 آبار في وسط زراعة كاملة.
    3. احتضان لمدة 10-14 يوما عند 37 درجة مئوية في CO2 مرطب بنسبة 5٪ ، واغسله باستخدام PBS ، وصبغه بنسبة 0.5٪ كريستال بنفسجي في الميثانول لمدة 30 دقيقة في RT.
    4. تعداد المستعمرات في كل بئر.
    5. احسب كفاءة CFU-F: قسم عدد المستعمرات المكونة من رقم البذر الأصلي للحصول على النسبة المئوية لكفاءة تكوين المستعمرة ، والتعبير عنها كنسبة مئوية.
  3. إمكانية التمايز الثلاثي
    1. بذرة 5 × 103 خلايا / سم2 في وسط تمايز تكون العظم وتكوين الشحم في 12 لوحة جيدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بالنسبة للتكوين الغضروفي ، قم بإعداد 1.6 × 107 خلايا قابلة للحياة / مل ، وقم بتوليد ثقافات الكتلة الدقيقة عن طريق زرع قطرات 5 ميكرولتر من محلول الخلية في مراكز آبار 96 لوحة بئر ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. أثناء التمايز ، قم بإجراء تغييرات متوسطة كاملة كل 3-4 أيام.
    3. بعد 14 يوما (لتكوين الشحم) أو 21 يوما (لتكوين العظم وتكوين الغضروف) ، راقب الثقافات للتمايز باستخدام البقع البيولوجية الخاصة بالنسب وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. للتمايز الدهني ، قم بتلطيخ الثقافات بمحلول Oil Red O بنسبة 0.5٪. لتكوين العظم ، قم بإجراء تلطيخ باستخدام محلول Alizarin Red S بنسبة 2٪. للتمايز الغضروفي ، قم بتلطيخ كريات الكتلة الدقيقة بنسبة 1٪ Alcian Blue.
  4. ملامح إفراز السيتوكين
    1. قم بإذابة الخلايا المحفوظة بالتبريد التي يتم حصادها يدويا أو باستخدام نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس ، وزرع 5000 خلية / سم2 في دورق T-175 مع وسائط SFM XF.
    2. بعد 4 أيام ، اجمع وسط الاستزراع المستهلك ، وقم بتخزينه في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
    3. حدد تعبير السيتوكينات باستخدام مجموعة لوحات تعريف السيتوكين ذات 19-plex على قارئ متعدد الإرسال.
    4. قم بإجراء المقايسات المناعية المتعددة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.

Representative Results

تم الحفاظ على بنك الخلايا الرئيسية WJ-hMSC (MCB) بعد الذوبان لثلاثة مقاطع متتالية (p1-p4) في وسط كلاسيكي يحتوي على مصل لإنتاج ما يكفي من بنوك الخلايا العاملة (WCBs) للتجارب. تم إذابة وتوسيع p4 WCBs في كل من الوسط المحتوي على المصل ووسط SFM XF لثلاثة ممرات أخرى (p4-p7) في قوارير T-175. تكيفت WJ-MSCs بشكل جيد عند توسيعها في وسط SFM XF وتمكنت من الحفاظ على انتشار مستقر مماثل لذلك الموجود في الوسط المحتوي على المصل (الشكل 2A). ومع ذلك ، أظهرت الخلايا الموسعة في وسط SFM XF مورفولوجيا أطول قليلا على شكل مغزل يشبه الخلايا الليفية ، مما أدى إلى حجم خلية أكبر قليلا (الشكل 2B) بمتوسط ~ 17 ميكرومتر مقارنة ب ~ 15 ميكرومتر في وسط يحتوي على المصل. في كلتا الحالتين المتوسطتين عبر الممرات الثلاثة ، وصلت WJ-hMSCs باستمرار إلى أقصى كثافة خلوية لها تبلغ ~ 2.3 × 104 خلايا / سم2 ووقت مضاعفة السكان ~ 34 ساعة (الشكل 2C ، D).

لتوسيع WJ-hMSC على نطاق واسع في نظام مغلق ، قمنا بتوسيع قطار البذور ل WJ-hMSCs أولا في دورق من 4 طبقات ، وبعد ذلك ، في دورق متعدد الطبقات من 10 طبقات. عند التقاء حوالي 80٪ -90٪ بعد 4 أيام من الاستزراع ، حصدنا 9.6 × 10 7 ± 0.9 × 107 و 2.3 × 10 8 ± 0.2 × 108 خلايا للمكدسات المكونة من 4 طبقات و 10 طبقات ، على التوالي. تم الوصول إلى كثافة خلايا أعلى تبلغ 3.6 × 10 4-3.8 × 104 خلايا / سم2 مقارنة بقوارير T-175 ، مما يعني أن المداخن سمحت بتوسع أفضل للخلايا بما يصل إلى سبعة أضعاف.

علاوة على ذلك ، تم حصاد WJ-hMSCs الموسعة في أوعية الاستزراع المكونة من 10 طبقات مباشرة باستخدام الطرد المركزي المعاكس. كان من السهل إنشاء الاتصال المعقم بالمجموعة ذات الاستخدام الواحد لنقل السوائل المباشر بمعدل تدفق أقصى يبلغ 165 مل / دقيقة باستخدام المضخة التمعجية للأداة. تم تحقيق عملية حصاد الخلايا شبه الآلية عن طريق حصاد الخلايا أولا باستخدام التفكك الأنزيمي ، وتحميل الخلايا في غرفة التدفق المعاكس لتقليل الحجم والتركيز ، ثم الغسيل باستخدام مخزن الغسيل المؤقت ، والذي كان حوالي 3 أضعاف حجم غرفة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس. علاوة على ذلك ، تم بعد ذلك تركيز الخلايا المغسولة وحصادها إلى حجم الحصاد المطلوب المحدد مسبقا في البروتوكول. تم تصميم خطوات المعالجة المستخدمة لمعالجة الخلايا شبه الآلية لمحاكاة سير عمل الحصاد اليدوي. لقد حققنا انخفاضا في الحجم بمقدار 10 أضعاف ، مما أدى إلى توليد تركيزات خلايا تصل إلى 5.3 مليون خلية / مل. كان البروتوكول قادرا على تحقيق استرداد عالي للخلايا عند ~ 98٪ وقابلية عالية للخلية عند ~ 99٪ باستمرار لجميع عمليات التشغيل المستقلة الثلاثة (الشكل 3A-C).

أجرينا فحوصات واسعة لتوصيف الخلايا لتحديد سمات الجودة الحرجة لحصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي المعاكس مقارنة بالطرد المركزي اليدوي. لاختبار هوية WJ-hMSCs ، تم تحليل علامات سطح الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. كما هو موضح في الشكل 4A ، أظهرت WJ-hMSCs التي تم حصادها باستخدام كلتا الطريقتين ملامح علامات السطح المميزة وفقا للوائح ISCT ، والتعبير الإيجابي عن CD73 و CD90 و CD105 ، بالإضافة إلى التعبير السلبي عن CD34 و CD45. بعد ذلك ، لتقييم الإمكانات المستنسخة ل WJ-hMSCs ، تم إجراء فحوصات CFU-F. كما هو موضح في الشكل 4B ، أظهرت الخلايا التي تم حصادها من الطرد المركزي عكس التدفق إمكانات CFU-F مماثلة مقارنة بالخلايا التي يتم حصادها بواسطة الطرد المركزي اليدوي (21٪ ± 1٪ مقابل 20٪ ± 1٪ على التوالي). علاوة على ذلك ، كما هو موضح في الشكل 4C ، احتفظت الخلايا التي تم حصادها بالطرد المركزي بعد التدفق المعاكس بالقدرة على التمايز إلى خلايا دهنية وبانيات عظمية وخلايا غضروفية مشابهة للخلايا في طريقة الطرد المركزي اليدوي. أخيرا ، قمنا بالتحقيق في 18 ملفا مختلفا لإفراز السيتوكين للخلايا باستخدام المقايسات المناعية المتعددة. كما هو موضح في الشكل 4D ، حافظت الخلايا التي تم غسلها وتركيزها باستخدام الطرد المركزي بعد التدفق المعاكس على ملامح إفراز السيتوكين ، وكانت الملامح قابلة للمقارنة مع تلك الموجودة في العينة المأخوذة قبل غسل / تركيز الخلايا (الطرد المركزي قبل التدفق المعاكس).

بشكل عام ، لقد أظهرنا توسعا فعالا في hMSC في نظام زراعة SFM XF ، وأسفرت الخلايا التي تم غسلها وتركيزها باستخدام نظام الطرد المركزي المغلق والآلي للتدفق المعاكس عن استعادة عالية للخلايا وصلاحيتها بعد الغسيل ويمكنها الحفاظ على نمطها الظاهري ووظائفها. يمكن للعملية شبه الآلية المغلقة التي تم تطويرها في هذه الدراسة أن توفر اتساقا في جودة المنتج من حيث الاسترداد النهائي ل WJ-MSC ، كما يتضح من ثلاث عمليات تشغيل مستقلة.

Figure 1
الشكل 1: تكوين وتجميع مجموعة أدوات عالية التدفق للاستخدام مرة واحدة لحصاد وغسل وتركيز hMSCs . (أ) مخطط المجموعة بعد توصيل الأكياس بما يتماشى مع الأنبوب المعني. (ب) الدورق متعدد الطبقات المكون من 10 طبقات المتصل بمجموعة الاستخدام الفردي عالية التدفق مع مجموعة الأنابيب المخصصة. (ج) تصور لطبقة الخلية المميعة المستقرة المتكونة في غرفة التدفق المعاكس عبر وظيفة الكاميرا الممكنة في واجهة المستخدم الرسومية لبرنامج الطرد المركزي للتدفق المعاكس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة بين مورفولوجيا الخلية وتمدد hMSCs في الوسط المحتوي على المصل ووسط SFM XF. (أ) مورفولوجيا الخلية التمثيلية ل hMSCs في وسط المصل الكلاسيكي ووسط SFM XF. أظهرت الخلايا الموسعة SFM XF مورفولوجيا أطول على شكل مغزل تشبه الخلايا الليفية المميزة ، في حين أن الخلايا المزروعة في وسط يحتوي على مصل أظهرت مورفولوجيا أكثر تسطحا. (ب) متوسط حجم MSC بين الوسط المحتوي على المصل ووسط SFM XF ، مقاسا بواسطة عداد خلية آلي (n = 3). من الواضح أن الخلايا الموسعة SFM XF كانت بشكل عام أكبر من الخلايا الموسعة في المصل عبر مقاطع مختلفة. إجمالي إنتاج الخلية في مقاطع مختلفة (ن = 3) (ج) من حيث الخلايا لكل مساحة سطح مزرعة و (د) مستويات مضاعفة السكان. تم الحصول على مستويات مماثلة من إنتاجية الخلايا بين وسط SFM XF والوسط المحتوي على المصل عبر ممرات مختلفة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توصيف الخلايا المعالجة باستخدام نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس. أ: مجموع الخلايا القابلة للحياة قبل الغسيل والتركيز وبعدهما. (ب) تم تخفيض الحجم بمقدار 10 أضعاف معالجة الطرد المركزي بعد التدفق المعاكس. (ج) التعافي التام للخلايا وصلاحيتها. يتم حساب متوسط البيانات على مدى ثلاث مكررات بيولوجية (ن = 3) من عمليات الغسيل والتركيز. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل سمات الجودة الحرجة. أ: البيانات التمثيلية من قياس التدفق الخلوي. (ب) صور تمثيلية توضح إجمالي CFU. (ج) صور مجهرية تمثيلية لتمايز النسب الثلاثي. (د) نتائج تحليل تعبير السيتوكين قبل وبعد معالجة الخلايا على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس (ن = 3). يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تسلسل حصاد hMSC بواسطة بروتوكول التربسين والغسيل والتركيز على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس ، بما في ذلك خطوات التحضير الأولية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

في هذا العمل ، أظهرنا القدرة على إغلاق وشبه أتمتة تفكك hMSC والغسيل والحصاد على مقاعد البدلاء باستخدام أداة طرد مركزي معاكسة. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في سير العمل بأكمله في التأكد من توصيل الأنابيب وفقا للبروتوكول المحدد مسبقا المحدد في منشئ بروتوكول نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس. الإعداد والتشغيل بسيطان ، وكان الوقت المستغرق لمعالجة حوالي 2 لتر من الثقافة من قارورة من 10 طبقات من تجميع المجموعة إلى حصاد الخلايا حوالي 60 دقيقة. تتمثل إحدى الخطوات المحددة في سير العمل هذا في نقل السوائل من القارورة متعددة الطبقات إلى أكياس النقل المتصلة بأداة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس. لا يمكن تشغيل المجموعة ذات الاستخدام الواحد عالية التدفق إلا بمعدل تدفق أقصى يبلغ 165 مل / دقيقة ، وقد يكون هذا تحديا للمعالجة ، على سبيل المثال ، قارورة من 40 طبقة. لتسريع عملية نقل السوائل ، يمكن استخدام مضخات خارجية ذات معدل تدفق مرتفع لنقل محتويات التربسين إلى كيس نقل أولا ، يليها غسل / تركيز وحصاد الخلايا من كيس النقل باستخدام نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على تمرير الخلايا من 4 طبقات إلى 10 طبقات متعددة الطبقات. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تحسين نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس لغسل hMSCs المذابة والحصاد المباشر والتركيب المتوسط في قوارير متعددة الطبقات لبدء قطار البذور. وتجدر الإشارة إلى أن الحد الأدنى لعدد الخلايا المطلوبة لتشكيل الطبقة المميعة في غرفة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس هو حوالي 30 مليون خلية ، والحد الأقصى الموصى به للمعالجة لكل دفعة هو 20 لترا.

في الوقت الحالي ، لا ينصح بربط مجموعة الأنابيب المخصصة بالقارورة متعددة الطبقات في خزانة السلامة البيولوجية وتعقيم أجزاء المكونات في إعداد cGMP. كبديل ، يمكن الاستعانة بمصادر خارجية لمجموعة أنابيب معقمة بأشعة غاما مخصصة للموردين. يوفر الموردون الذين يقدمون قوارير متعددة الطبقات أيضا خيار التركيب المسبق للقوارير مع مجموعات الأنابيب المرغوبة ، بما في ذلك مرشح 0.2 ميكرومتر ، وتعقيم جاما للزي بأكمله. سيضمن ذلك إغلاق القوارير متعددة الطبقات والأنابيب المرفقة حقا ، مما يعني أنه يمكن إكمال العملية على المقعد في إعداد غرفة نظيفة من الفئة C.

لا تقتصر هذه العملية التي تستخدم نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس على الخلايا المستزرعة القائمة على الالتصاق في وعاء متعدد الطبقات ويمكن تكييفها مع منصات توسيع الخلايا الديناميكية (الخزان المقلوب أو المفاعلات الحيوية الموجية) ومنصات توسيع الخلايا الثابتة (المنفذة للغاز). على وجه التحديد ، بالنسبة ل hMSCs الموسعة في ثقافات الناقلات الدقيقة 3D ، يمكن تحسين البروتوكولات على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس لحصاد وغسل وصياغة hMSCs المنفصلة عن الناقلات الدقيقة.

بشكل عام ، أدى الاهتمام المتزايد بتطوير العلاجات الخلوية الانتقالية مع تحسين قوة العملية وموثوقيتها إلى تطوير منصات معالجة الخلايا الآلية المغلقة. هذه الأنظمة ضرورية ، لأنها تقلل من عدد خطوات المناولة ، وتمنع التلوث المحتمل عن طريق التوصيلات المعقمة ، وتقلل من تكاليف التصنيع عن طريق تقليل العمالة وتعزيز الاستخدام الفعال لمساحة الغرفة النظيفة21. تماشيا مع هذا ، يدرك العديد من مطوري منتجات العلاج بالخلايا الذين يسعون للحصول على موافقة تنظيمية لترجمة علاجاتهم أهمية إغلاق العملية وتنفيذ الأتمتة الكاملة أو شبه الأتمتة في وقت مبكر من مرحلة تطوير العملية14،31،32.

مع استخدام وسيط SFM XF الصديق للتنظيم ، جنبا إلى جنب مع الكواشف المساعدة المتوافقة مع 21 CFR GMP Part 11 وإرشادات الجودة الدولية ، ستكون هذه العملية شبه الآلية مناسبة بسهولة للتصنيع السريري. لقد أظهرنا قابلية استنساخ العملية المغلقة والحفاظ على جودة WJ-MSCs. إن تحسين كفاءة وسلامة زراعة الخلايا القائمة على الالتصاق في قوارير متعددة الطبقات لن يفيد مجال علاج hMSC فحسب ، بل يفيد أيضا الشركات في مجال تخزين خط الخلايا وإنتاج الفيروسات الملتصقة.

Disclosures

P.J. ، A.B. ، R.L. ، و JN هم موظفون في Thermo Fisher Scientific. ليس لدى A.L. و S.O. أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا الدعم المقدم من تمويل التخزين المسبق لصندوق محاذاة الصناعة (IAF-PP) (H18 / 01 / a0/021 و H18 / AH / a0 / 001) من A * STAR ، سنغافورة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2L PVC transfer bag TerumoBCT BB*B200TM
Alcian blue solution, pH 2.5 Merck 101647
Alizarin-Red Staining Solution Merck TMS-008-C
APC anti-human CD73 Antibody Biolegend 344015
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400121
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader Bio-Rad
Counterflow Centrifugation System Thermo Fisher Scientific A47679 Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System
Crystal Violet Sigma-aldrich C0775
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific A1285601 no calcium, no magnesium
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) Thermo Fisher Scientific A27940
CTS TrypLE Select Enzyme Thermo Fisher Scientific A1285901
Custom tubing assembly Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) N/A Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet
Emflon II capsule (0.2um filter) Pall KM5V002P2G100
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12662029 Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions
FGF-basic Thermo Fisher Scientific PHG0024
FITC anti-human CD105 Antibody Biolegend 323203
FITC anti-human CD45 Antibody Biolegend 304005
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody Biolegend 328107
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400109
Hi-Flow Single Use Kit Thermo Fisher Scientific A46575 Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min
Multi-layered systems  Thermo Fisher Scientific 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) Nunc Standard Cell Factory Systems
NucleoCounter NC-3000 Chemometec NC-3000
Oil red O staining solution Merck 102419
PDGF-BB Thermo Fisher Scientific PHG0045
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
PerCP anti-human CD34 Antibody Biolegend 343519
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400147
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays Thermo Fisher Scientific Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A 
Sample port Thermo Fisher Scientific A50111 Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10070-01
StemPro Chondrocyte Differentiation Thermo Fisher Scientific A10071-01
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) Thermo Fisher Scientific ME20236L1 Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10072-01
T175 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 159910
T75 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 156472
TGFβ1 Thermo Fisher Scientific PHG9204
WJ MSCs  PromoCell (#C12971; Germany) Human mesenchymal stem cells
αMEM media Thermo Fisher Scientific 12571063 With nucleosides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 24 (2021).
  2. García-Bernal, D., et al. The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).
  3. Mastrolia, I., et al. Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review. Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).
  4. Jovic, D., et al. A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).
  5. Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process. Cells. 10, 1320 (2021).
  6. Fernández-Santos, M. E., et al. Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome. Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).
  7. Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).
  8. Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).
  9. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), (2020).
  10. Fričová, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease. npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).
  11. Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products. Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).
  12. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  13. Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).
  14. Doulgkeroglou, M. N., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
  15. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).
  16. Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A. Engineering Strategies for Regenerative Medicine. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. , Academic Press. Cambridge, MA. 33-71 (2020).
  17. Tsai, A. -C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
  18. Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing. Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).
  19. Mizukami, A., Swiech, K. Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization. Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).
  20. Hassan, M., et al. Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).
  21. Li, A., et al. Advances in automated cell washing and concentration. Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).
  22. Mehta, S. Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing. Cytotherapy. 16, Supplement 101 (2014).
  23. Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing. Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).
  24. Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  25. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  26. Li, A., James, D., Lim, R. The Gibco™ CTS™ Rotea™ system story-A case study of industry-academia collaboration. Gene Therapy. , (2021).
  27. Li, A., et al. Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation. Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).
  28. Li, A., et al. Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing. Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).
  29. Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).
  30. Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells. Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).
  31. Smith, D., et al. Towards automated manufacturing for cell therapies. Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).
  32. Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ، الخلايا الجذعية الوسيطة ، وسائط خالية من xeno خالية من المصل ، قارورة متعددة الطبقات ، نظام مغلق ، أتمتة ، حصاد الخلايا ، طرد مركزي عكس التدفق
معالجة الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية للتطبيقات السريرية باستخدام سير عمل مغلق شبه آلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, A. T. L., Jayaraman, P.,… More

Lam, A. T. L., Jayaraman, P., Becker, A., Lim, R., Teo, K. L., Ng, J., Oh, S. Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow. J. Vis. Exp. (193), e64707, doi:10.3791/64707 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter