Auf der Suche nach der Dynamik struktureller Varianten in experimentell entwickelten Populationen

Summary

Wir haben eine kostengünstige Methode entwickelt, um die Alleldynamik von Nicht-Einzelnukleotid-Polymorphismen zu verfolgen, die leicht an experimentelle Evolutionsarchive angepasst werden kann. Eine Triplett-PCR-Technik wurde mit einer automatisierten parallelen Kapillarelektrophorese gekoppelt, um die relative Häufigkeit eines Insertionsallels im Verlauf der experimentellen Evolution zu quantifizieren.

Abstract

Es ist heute bekannt, dass strukturelle Varianten (SVs) (d. h. Deletionen, Insertionen, Duplikationen und Inversionen) eine wichtige Rolle bei der phänotypischen Variation und damit bei Prozessen wie der Bestimmung von Krankheiten oder der Anpassung an eine neue Umgebung spielen. Einzelnukleotidvarianten erhalten jedoch viel mehr Aufmerksamkeit als SVs, wahrscheinlich weil sie leichter zu erkennen sind und ihre phänotypischen Wirkungen leichter vorherzusagen sind. Die Entwicklung von Short- und Long-Read-Deep-Sequencing-Technologien hat die Detektion von SVs stark verbessert, aber die Quantifizierung ihrer Häufigkeit aus gepoolten Sequenzierungsdaten (Pooleq) ist immer noch technisch komplex und teuer.

Hier stellen wir eine recht einfache und kostengünstige Methode vor, die es Forschern ermöglicht, die Dynamik der SV-Allelfrequenz zu verfolgen. Als Anwendungsbeispiel verfolgen wir die Häufigkeit der Insertion einer Insertionssequenz (IS) in experimentellen Evolutionspopulationen von Bakterien. Diese Methode basiert auf dem Design von Tripletts von Primern um die strukturellen Variantengrenzen, so dass sich die durch Amplifikation des Wildtyps (WT) und der abgeleiteten Allele erzeugten Amplikons in der Größe um mindestens 5% unterscheiden und dass ihre Amplifikationseffizienz ähnlich ist. Die Menge jedes Amplikons wird dann durch parallele Kapillarelektrophorese bestimmt und auf eine Kalibrierkurve normiert. Diese Methode kann leicht auf die Quantifizierung der Häufigkeit anderer Strukturvarianten (Deletionen, Duplikationen und Inversionen) und auf Pool-Seq-Ansätze natürlicher Populationen, einschließlich patienteninterner Erregerpopulationen, ausgeweitet werden.

Introduction

Strukturvarianten (SVs) sind Veränderungen der genomischen Sequenz, die im Allgemeinen 50 bp oder mehr betreffen. Die vier Kategorien der beschriebenen SVs sind große Einfügungen, große Deletionen, Inversionen und Duplikationen. Bis vor kurzem wurde Einzelnukleotidvarianten (SNVs) mehr Aufmerksamkeit geschenkt als strukturellen Varianten, was ihre phänotypischen Auswirkungen und ihre Rolle als genetische Determinanten von Krankheiten oder ihren Beitrag zur Anpassung betrifft. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass es einfacher ist, SNVs zu erkennen und ihre phänotypischen Auswirkungen vorherzusagen. Kurz- und Langzeit-Deep-Sequencing-Technologien haben jedoch den Nachw....

Protocol

Das Einrichten dieses Protokolls erfordert eine genaue Kenntnis des Einfüge-, Lösch-, Inversions- oder Duplizierungspunkts innerhalb der Ahnensequenz. Diese Informationen werden in der Regel durch die Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) der End- oder Zwischenpunktproben gewonnen. Im folgenden Protokoll wird das allgemeine Prinzip für den Fall einer Insertionsmutation für jeden Schritt angegeben, zusammen mit einem repräsentativen Fall, in dem die Häufigkeit einer IS10-Insertion in das mutS-Gen in einer experimentellen Evolutionspopulation von E. coli verfolgt wird. In dieser Population identifizierte WGS der Endpunktpopulation die Insertion eines....

Results

Unter Verwendung von DNA, die aus einem angestammten Klon extrahiert wurde, und einem Hypermutator-Klon, der aus der S2.11-Population der Generation 1.000 isoliert wurde, haben wir die in Abbildung 2 gezeigte Kalibrierungskurve erstellt. Die tatsächlichen Mutantenanteile aus im Labor hergestellten DNA-Mischungen, die mit dem parallelen Kapillarelektrophorese-Instrument gemessen wurden, wurden durch eine lineare Beziehung der Steigung 1,0706 mit einem R² von 0,9705 verknüpft. Darüb.......

Discussion

Hier haben wir eine kostengünstige Methode vorgeschlagen, die es ermöglicht, die Dynamik neuer adaptiver SV-Allele in experimentellen Evolutionspopulationen zu verfolgen. Diese Methode koppelt klassische PCR-Techniken mit automatisierter paralleler Kapillarelektrophorese, so dass die relativen Mengen zweier Allele bestimmt werden können. Einmal eingerichtet, ermöglicht es die Quantifizierung von Allelanteilen in vielen Proben parallel und ist viel kostengünstiger als WGS. Diese Methode kann als Äquivalent zur Amplikon-Se.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 PCR-Platte mit gutem Rand	4titude 4Ti	- 0740	PCR
Agarose-Molekularbiologie-Qualität	Eurogentec	EP-0010-05	Agarose-Gelelektrophorese
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Kurzanleitung für die Fragment Analyzer Systeme	Agilent		PDF Bedienungsanleitung
Puffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Agarose Gelelektrophorese
Kalibrierte Einweg-Impfösen und -nadeln	LABELIANS	8175CSR40H	Bakterienkultur
Dneasy Blut- und Gewebe-Kit	Qiagen	69506	DNA-Extraktion
Elektrophorese-Netzteil	Amilabo	ST606T	Agarose-Gelelektrophorese
Fragment-Analysator Automatisiertes CE-System	Agilent		Parallele Kapillarelektrophorese
Fragment-DNA-Leiter	Agilent	DNF-396, Bereich 1-6000bp	Parallele Kapillarelektrophorese
GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENZ	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Bakterienkultur
Hochempfindlicher Verdünnungsmittelmarker	Agilent	DNF-373	Parallele Kapillare Elektrophorese
Hohe Empfindlichkeit NGS quantitatives Analysekit	Agilent	DNF-474	Parallele Kapillarelektrophorese
Leiter Schnellladung 1 kb plus DNA-Leiter	NEB	N0469S	Agarose-Gelelektrophorese
LB Brühe, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Bakterienkultur
Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
Primer	Eurogentec		PCR
Prosize Datenanalysesoftware v.4	Agilent	V.4	Parallele Kapillarelektrophorese
Qubit-Assays	Invitrogen	MAN0010876	DNA-Quantifizierung
Qubit dsDNA HS Assay Kit	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	DNA-Quantifizierung
Thermocycler	Eppendorf	Ep Gradienten	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Agarose Gelelektrophorese Visualisierung
Wasser für die injizierbare Zubereitung	Aguettant	PROAMP	PCR