Anwendung von AlDeSense zur Stratifizierung von Eierstockkrebszellen basierend auf der Aktivität der Aldehyddehydrogenase 1A1

Zusammenfassung

Methoden zur Messung der Aktivität von ALDH1A1 in lebenden Zellen sind in der Krebsforschung von entscheidender Bedeutung, da es ein Biomarker für die Stammzellbildung ist. In dieser Studie verwendeten wir eine isoformselektive fluorogene Sonde, um die relativen Konzentrationen der ALDH1A1-Aktivität in einem Panel von fünf Eierstockkrebszelllinien zu bestimmen.

Zusammenfassung

Ein Rückfall nach einer Krebsbehandlung wird oft auf die Persistenz einer Subpopulation von Tumorzellen zurückgeführt, die als Krebsstammzellen (CSCs) bekannt sind und sich durch ihre bemerkenswerte Fähigkeit zur Tumorinitiierung und Selbsterneuerung auszeichnen. Abhängig von der Herkunft des Tumors (z. B. Eierstöcke) kann das Profil des CSC-Oberflächen-Biomarkers stark variieren, was die Identifizierung solcher Zellen durch immunhistochemische Färbung zu einem schwierigen Unterfangen macht. Im Gegensatz dazu hat sich die Aldehyddehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) aufgrund ihres konservierten Expressionsprofils in fast allen Vorläuferzellen, einschließlich CSCs, als hervorragender Marker zur Identifizierung von CSCs erwiesen. Die Isoform ALDH1A1 gehört zu einer Superfamilie von 19 Enzymen, die für die Oxidation verschiedener endogener und xenobiotischer Aldehyde zu den entsprechenden Carbonsäureprodukten verantwortlich sind. Chan et al. haben kürzlich AlDeSense entwickelt, eine isoformselektive "Einschaltsonde" zum Nachweis der ALDH1A1-Aktivität, sowie ein nicht-reaktives Matching-Kontrollreagenz (Ctrl-AlDeSense), um Off-Target-Färbungen zu berücksichtigen. Dieses isoformselektive Werkzeug hat sich bereits durch den Nachweis der ALDH1A1-Aktivität in myeloischen K562-Leukämiezellen, Mammosphären und aus Melanomen gewonnenen CSC-Xenotransplantaten als vielseitiges chemisches Werkzeug erwiesen. In diesem Artikel wurde der Nutzen der Sonde durch zusätzliche Fluorimetrie-, konfokale Mikroskopie- und Durchflusszytometrie-Experimente demonstriert, bei denen die relative ALDH1A1-Aktivität in einem Panel von fünf Eierstockkrebszelllinien bestimmt wurde.

Einleitung

Krebsstammzellen (CSCs) sind eine Subpopulation von Tumorzellen, die stammzellähnliche Eigenschaften aufweisen¹. Ähnlich wie ihre nicht-krebsartigen Gegenstücke besitzen CSCs die außergewöhnliche Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und zu vermehren. Zusammen mit anderen eingebauten Mechanismen, wie z.B. der Hochregulierung von ATP-bindenden Kassettentransportern, bleiben CSCs oft von anfänglichen chirurgischen Debulking-Anstrengungen sowie einer anschließenden adjuvanten Therapie verschont². Aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei der Behandlung^{von Resistenz 3}, Rezidiv⁴ und ....

Protokoll

1. Messung der Gesamtaktivität von ALDH1A1 in Homogenaten von Eierstockkrebszellen mittels Fluorimetrie

1. Tauen Sie 1 × 10⁶ Zellen in einem T25-Zellkulturkolben in 5 ml der folgenden Zellkulturmedien auf:
   1. IGROV-1 und PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S).
   2. BG-1 und Caov-3: Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) mit 10% FBS und 1% P/S.
   3. OVCAR-3: RPMI 1640 mit 20 % FBS, 1 % P/S und 0,01 mg/ml Insulin.
2. Halten Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ für zwei bi....

Ergebnisse

Gesamtaktivität von ALDH1A1 in Homogenaten von Eierstockkrebszellen
Die durchschnittlichen Fold Turn-Ons für jede Zelllinie, die aus diesem Assay erhalten wurden, sind: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); und OVCAR-3 (10,25 ± 1,46) (Abbildung 2).

Abbildung

Diskussion

Die Pan-Selektivität ist eine wesentliche Einschränkung vieler ALDH-Sonden. In jüngster Zeit wurden jedoch mehrere isoformselektive Beispiele berichtet (32,33,34,35,36,37,38,39,40,41). Di.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin, 0,1 % EDTA in HBSS ohne Kalzium-, Magnesium- und Natriumbicarbonat		25-050-CI
1x Phosphate Buffer Kochsalzlösung	Corning	21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
AlDeSense			Synthetisiert im Haus
BG-1			Ein Geschenk zur Verfügung gestellt vom Prof. Paul Hergenrother Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
BioLite 25cm2 Trinkflasche	Thermo Fisher Scientific
Biosicherheitswerkbank 1300 Serie A2	Thermo Fisher Scientsp;
Caov-3			Ein Geschenk zur Verfügung gestellt von Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Zellhomogenisator	Fisher Scientific
Centrifuge 5180R	Eppendorf	22627040
Contrl-AlDeSense			Synthetisiertes
hauseigenes DMEM, 10% FBS, 1% P/S			Hergestellt von UIUC-Zelle Medieneinrichtung
Falcon Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden und Schnappkappe für das Zellsieb, 5 ml	Corning	352003
FCS Express 6			Zur Verfügung gestellt von UIUC CMtO
FL Mikroskop	EVOS
Fluorometer	Photon Technology International
Forma Series II wasserummantelt CO2  Inkubator	Fisher Scientific	3110
IGROV-1			Ein Geschenk zur Verfügung gestellt vom Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
ImageJ	NIH
Innova 42R Inkubationsschüttler
LSM 700	Zeiss
LSR II	BD
Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilat-Deckglassystem	Thermo Fisher Scientific
OVCAR-3	ATCC	HTB-161
PEO4			Ein Geschenk zur Verfügung gestellt vom Prof. Erik Nelson Lab, University of Illinois Urbana-Champaign
Pierce Proteasehemmer Tabletten	Thermo Scientific	A32963
Poly-L-Lysin	Cultrex	3438-100-01
Rocker	VWR
RPMI, 10 % FBS, 1 % P/S			Hergestellt von der UIUC-Zellmedieneinrichtung
RPMI, 20 % FBS, 1 % P/S, 0,01 mg/ml Insulin			Hergestellt von der UIUC-Zellmedieneinrichtung

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