Methodenartikel

Einstufige CRISPR-basierte Strategie zur endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/64729

⸱

26. Januar 2024

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, 3Michigan Neuroscience Institute Affiliate, University of Michigan

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein vereinfachtes endogenes Gen-Tagging-Protokoll für Drosophila vor, das eine PCR-basierte Technik zur markerfreien Identifizierung erfolgreicher genetischer Veränderungen verwendet und die Entwicklung stabiler Knock-in-Linien erleichtert.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der subzellulären Lokalisierung, Dynamik und Regulation von Proteinen in lebenden Zellen hat sich durch das Aufkommen von Techniken, die die Markierung endogener Gene zur Herstellung fluoreszierender Fusionsproteine ermöglichen, grundlegend verändert. Diese Methoden ermöglichen es Forschern, das Verhalten von Proteinen in Echtzeit zu visualisieren und wertvolle Einblicke in ihre Funktionen und Wechselwirkungen in der zellulären Umgebung zu erhalten. Viele aktuelle Genmarkierungsstudien verwenden einen zweistufigen Prozess, bei dem sichtbare Marker, wie z. B. Veränderungen der Augenfarbe, verwendet werden, um genetisch veränderte Organismen im ersten Schritt zu identifizieren, und der sichtbare Marker im zweiten Schritt herausgeschnitten wird. Hier stellen wir ein einstufiges Protokoll zur präzisen und schnellen endogenen Genmarkierung in Drosophila melanogaster vor, das ein Screening auf manipulierte Linien ohne sichtbaren Augenmarker ermöglicht und einen erheblichen Vorteil gegenüber früheren Methoden bietet. Um nach erfolgreichen Gen-Tagging-Ereignissen zu suchen, verwenden wir eine PCR-basierte Technik, um einzelne Fliegen zu genotypisieren, indem wir ein kleines Segment ihres Mittelbeins analysieren. Fliegen, die die Screening-Kriterien bestehen, werden dann verwendet, um stabile Bestände zu produzieren. Hier beschreiben wir das Design und den Bau von CRISPR-Editing-Plasmiden und Methoden zum Screening und zur Bestätigung von technischen Linien. Zusammen verbessert dieses Protokoll die Effizienz der endogenen Genmarkierung in Drosophila erheblich und ermöglicht die Untersuchung zellulärer Prozesse in vivo.

Einleitung

Fluoreszierende Proteine haben sich als leistungsfähige Werkzeuge zur Visualisierung von Proteinlokalisierung, Dynamik und Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen in lebenden Organismen erwiesen 1,2. Die Markierung endogener Gene mit fluoreszierenden Proteinen ermöglicht die Langzeit-Live-Bildgebung zellulärer Prozesse mit subzellulärer Auflösung. Darüber hinaus haben diese endogenen Genmarkierungstechniken mehrere Vorteile gegenüber Überexpressions- und Immunfärbeansätzen. Beispielsweise kann eine Überexpression von Proteinen zu Proteinfehlfaltung, unspezifischen Protein-Protein-Wechselwirkungen und Fehllokalisierung führen3. Bisher konnten Forscher umfangreiche Bibliotheken endogener Gene erstellen, die mit fluoreszierenden Proteinen für einige Modellorganismen fusioniert sind, wie z. B. knospende Hefe, die eine effiziente homologe Rekombination durchlaufen können4. Im Fall von Drosophila melanogaster wurden verschiedene Werkzeuge wie MiMICs5, Transposon-basierte Enhancer-Fallen6 und Fosmide7 entwickelt, um Gene fluoreszierend zu markieren.

Die Entwicklung von CRISPR-Cas9-basierten Werkzeugen hat es ermöglicht, Genome Editing, einschließlich der Markierung endogener Proteine, in einer Vielzahl von Modellorganismen effizient durchzuführen 8,9. Cas9 ist ein RNA-gesteuertes Enzym, das doppelsträngige DNA auf hocheffiziente und spezifische Weise spaltet8, die dann durch einen nicht-homologen Endverbindungsweg (NHEJ) repariert werden kann, der zu Punktmutationen oder Deletionen führt. Alternativ ermöglicht der homologiegesteuerte Reparaturweg (HDR) die Integration heterologer DNA in das Chromosom.

Bisherige Methoden zur CRISPR-basierten Genmarkierung im Modellorganismus Drosophila melanogaster beruhten auf einem zweistufigen Prozess 10,11,12. Dazu wird ein erkennbarer Augenfarbenmarker, Dsred, verwendet, um erfolgreiche HDR-Ereignisse zu erkennen. Anschließend würde der Dsred-Marker mit dem Cre/loxP-Rekombinationssystem herausgeschnitten. Um diesen Prozess zu rationalisieren und zu beschleunigen, stellen wir Ihnen hier eine einfachere und effizientere Methode vor. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit einer tödlichen Genotypisierung und ermöglicht das direkte Screening einzelner Fliegen. Insbesondere verwenden wir einen PCR-basierten Ansatz, um DNA aus einem kleinen Segment des Mittelbeins der Fliege zu extrahieren, was es uns ermöglicht, einzelne Fliegen zu genotypisieren. Bemerkenswert ist, dass dieses Verfahren die Vitalität, Bewegung oder Fortpflanzungsfähigkeit der beprobten Fliege nicht beeinträchtigt. Nur die geeigneten Individuen, die durch diese Methode identifiziert werden, werden zu stabilen Beständen weiterentwickelt.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von fluoreszierenden Protein-markierten Fliegen vor, in denen endogene Gene mit fluoreszierenden Reportern markiert sind. Diese Technik verwendet CRISPR-Cas9-Genom-Editierung, um jede gewünschte Fluorophormarkierung mit dem N- oder C-Terminus eines endogenen Gens zu fusionieren. Im Folgenden beschreiben wir das Design und die Konstruktion von gRNA-Plasmiden und eines Spenderplasmids, die einstufige Screening-Strategie zur Auswahl von CRISPR-positiven Fliegen und die Schritte zur Etablierung stabiler Linien. Insbesondere beschreiben wir Strategien, um ein endogenes Drosophila-Gen mit einem Fluorophor am C-Terminal zu markieren. Wir beschreiben auch kurz die Kontrollexperimente, die durchgeführt werden müssen, um zu bestätigen, dass das markierte Protein funktionsfähig ist, und Live-Imaging-Techniken zur Visualisierung des Periodenproteins in lebenden Uhrenneuronen in intakten Drosophila-Gehirnen 13. Das hier beschriebene Protokoll ist auch allgemein anwendbar, um Kandidaten auf Deletionen und Insertionen bestimmter DNA-Bits durch CRISPR-Cas9-Genom-Editierung zu untersuchen.

Protokoll

1. Design und Bau von Gen-Editing-Reagenzien

HINWEIS: Um eine endogene Markierung durchzuführen, ist es wichtig, die verschiedenen Isoformen des gewünschten Gens zu identifizieren. Abhängig von den spezifischen Zielen des Experiments kann ein Fluoreszenztag entweder intern oder an den N- oder C-Termini der ausgewählten Proteinisoform(en) eingebaut werden. Für eine optimale CRISPR-vermittelte Editierung ist es entscheidend, die beiden sgRNAs in geeigneter Nähe der vorgesehenen Knock-in-Stelle zu positionieren. Um anschließend eine Editierung durch homologe Rekombination zu ermöglichen, sollte ein Donorvektor hergestellt werden, der Sequenzen umfasst, die homolog zum Zielgen sind, zusammen mit der Fluoreszenzmarkierung. Im Folgenden finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zu diesen Prozessen (Abbildung 1).

  1. Entwerfen Sie sgRNA wie unten beschrieben.
    1. Entwerfen Sie sgRNAs für Drosophila mit diesen Websites: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ oder http://www.flyrnai.org/crispr2/.
    2. Geben Sie für die flycrispr-Website die Sequenz ±100 bp ein, die die gewünschte Knock-in-Stelle umgibt (N-Terminal, C-Terminal oder ein beliebiger genomischer Locus). Wenn Sie das nos-Cas9 attP2 als Injektionshintergrund verwenden, wählen Sie die Genomoption Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). Das Nos-Cas9-System sorgt für eine keimbahnspezifische Cas9-Expression.
    3. Um die Effizienz der sgRNA-Expression zu verbessern, wählen Sie die Option CRISPR-Ziele mit 5' G , da sgRNAs, die mit einem Guanin beginnen, die Editierungsaktivität verbessern. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche CRISPR-Ziele suchen . Eine Liste möglicher sgRNA-Sequenzen wird angezeigt.
    4. Klicken Sie für jede Sequenz auf die Schaltfläche Auswerten . Diese Aktion prüft auf potenzielle Off-Targets für jede Sequenz basierend auf dem zuvor ausgewählten Genom. Wählen Sie aus der bereitgestellten Liste 2 sgRNAs aus, die 0 Off-Targets haben. Stellen Sie sicher, dass sich eine sgRNA stromaufwärts und die andere stromabwärts relativ zur Knock-in-Stelle befindet. Idealerweise sollten ihre Positionen so nah wie möglich an der Knock-in-Stelle liegen (<200 bp), aber sie dürfen sich nicht überlappen (Abbildung 2).
      HINWEIS: Es kann manchmal schwierig sein, geeignete sgRNAs für ein bestimmtes Zielgen zu finden. Der Abstand zwischen sgRNAs und der Knock-in-Stelle kann auf ± 200 bp vergrößert werden. Die Verwendung von sgRNAs, die nicht mit G beginnen, kann die Positivrate leicht verringern.
  2. Führen Sie die Auswahl der Fluoreszenz-Tags wie unten beschrieben durch.
    1. Fluoreszierende Tags bieten eine Vielzahl von Eigenschaften, von denen jedes seine einzigartigen Vor- und Nachteile hat 1,2. Berücksichtigen Sie bei der Bestimmung der idealen Fluoreszenzmarkierung für die Markierung eines bestimmten Proteins die wichtigsten Überlegungen, die in den folgenden Schritten beschrieben werden.
    2. Da die natürlichen Proteinexpressionsniveaus typischerweise viel niedriger sind als in Überexpressionsexperimenten 1,2, beginnen Sie mit den Tags, die hell und photostabil sind und zum Versuchsaufbau passen. Einige fluoreszierende Tags, insbesondere bestimmte RFPs wie tdTomato und DsRed, neigen dazu, Multimere14 zu bilden und können zu einer Proteinaggregation führen.
    3. Für mehr Vielseitigkeit können Sie Epitop-Tags (z. B. FLAG oder V5) mit einem flexiblen Linker mit dem Fluoreszenzmarker verknüpfen, der biochemische Analysen wie Western Blot oder Co-Immunpräzipitation ermöglicht.
  3. Führen Sie für den Linkerentwurf die unten beschriebenen Schritte aus.
    1. Stellen Sie für eine optimale Funktionalität sicher, dass sowohl das endogene Protein von Interesse als auch die fluoreszierende Markierung separat in ihre jeweiligen funktionellen Formen falten. Um dies zu erreichen, verwenden Sie ein Linkerpeptid mit einer Länge von 2 bis 20 Aminosäuren. Platzieren Sie beispielsweise zwei Glycinreste zwischen der letzten Aminosäure des Periodenproteins und der ersten Aminosäure des Knock-in-Fluoreszenzproteins mNeonGreen.
    2. Stellen Sie sicher, dass diese Linkerpeptidsequenzen Aminosäuren wie Glycin und Serin enthalten, die der Struktur Flexibilität verleihen15. Dadurch wird sichergestellt, dass das natürliche Verhalten und die Lage des körpereigenen Proteins unverändert bleiben.
  4. Entwerfen Sie den Spendervektor wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Der Spendervektor führt die Fluoreszenzmarkierung durch den Prozess der homologiegerichteten Reparatur, der durch die CRISPR-Spaltung eingeleitet wird, an die gewünschte endogene Stelle ein. Daher muss der Donorvektor neben der Fluoreszenzmarkierung Sequenzen besitzen, die auf beiden Seiten der Markierung homolog sind.
    1. Beginnen Sie mit dem Donorvektordesign, indem Sie die DNA-Sequenz des Linkerpeptids und der Fluoreszenzmarkierung organisieren und sicherstellen, dass homologe Sequenzen vorhanden sind, die beide Enden flankieren (Homologiearme). Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass die Homologiearme mindestens 800 Nukleotide auf jeder Seite der vorgesehenen Knock-in-Stelle umfassen (Abbildung 2).
      HINWEIS: Jüngste Berichte deuten darauf hin, dass Homologiearme kürzer sein können (100-200 bp)16.
    2. Stellen Sie sicher, dass alle PAM-Sequenzen innerhalb des Spenderplasmids so modifiziert werden, dass die Aminosäuresequenz des resultierenden Proteins unverändert bleibt. Wenn sich die PAM-Sequenz in der UTR befindet, entfernen Sie sie vollständig.
    3. Die Positionierung des START- und STOP-Codons hängt von der Position des Tags ab. Stellen Sie für die interne Markierung sicher, dass sich die Fluoreszenzmarkierung im Rahmen der kodierenden Sequenz des Zielgens befindet. Positionieren Sie für die N-Terminus-Markierung die Fluoreszenzmarkierung vor dem endogenen Startcodon. Platzieren Sie beim C-Terminus-Tagging das fluoreszierende Tag vor dem natürlichen Stoppcodon und stellen Sie sicher, dass nur ein einziges Startcodon beibehalten wird, um mögliche Übersetzungsprobleme zu vermeiden.
  5. Synthetisieren Sie sgRNA und Spenderplasmide wie unten beschrieben.
    1. Befolgen Sie für die Erstellung von sgRNA-Plasmiden die Richtlinien für die U6-gRNA-Klonierung, die unter flycrispr.org/protocols/grna/ zu finden sind. Verwenden Sie den alternativen Restriktionsenzym-basierten Klonierungsansatz (in der bereitgestellten Ressource als Strategie C bezeichnet), um gRNA-Sequenz in das pU6-BbsI-chiRNA-Plasmid (Addgene, #45946) einzufügen.
    2. Transformieren Sie in DH5a E. coli (NEB, C2987H) nach den vom Hersteller bereitgestellten Standardtransformationsprotokollen. Führen Sie zur Überprüfung eine Sanger-Sequenzierung an den resultierenden Klonen mit T3- oder T7-Standard-Sequenzierungsprimern durch.
    3. Für die Herstellung von Spenderplasmid erwerben Sie doppelsträngige DNA mit der gewünschten Spendersequenz von kommerziellen Anbietern (z. B. IDT). Integrieren Sie es in die pBlueScriptII SK(-) Mehrfachklonierungsstelle. Sequenzieren Sie das Spenderplasmid, um sicherzustellen, dass sgRNA- oder PAM-Sequenzen korrekt modifiziert sind und keine SNPs im Plasmid vorhanden sind.
      HINWEIS: Eine Alternative zur Integration mit pBlueScriptII besteht darin, die Homologiearme und die fluoreszierenden Tag-Segmente separat zu PCR durchzuführen und sie mit Techniken wie Golden Gate Assembly oder Gibson Assembly zum Rückgrat zu konsolidieren.
  6. Verwenden Sie das folgende Einspritz- und Kreuzungsschema.
    1. Um keimbahneditierte Fliegen zu erhalten, injizieren Sie gRNA-Plasmide und das Spenderplasmid in den entsprechenden Cas9-Hintergrund (z. B. nos-Cas9 III, BDSC 78782). Wenn Sie kommerzielle Injektionsdienste in Anspruch nehmen, befolgen Sie die Anweisungen des Anbieters, um die Plasmidvorbereitung durchzuführen.
      HINWEIS: In der Regel sollte die gRNA-Plasmidkonzentration 0,5 μg/μl und die Spenderplasmidkonzentration über 1,0 μg/μl liegen. Ein üblicher Zeitrahmen vom Versand von Plasmidproben bis zum Erhalt der injizierten Embryonen beträgt etwa 2 Wochen. Eine Strategie zum Screening auf Gen-Editing-Ereignisse auf dem X-Chromosom unter Verwendung des FM7/L-Balancer-Stammes wird hier vorgestellt. Verwenden Sie für Gene auf dem zweiten oder dritten Chromosom die entsprechenden Balancer-Stämme.
    2. Für das Sammeln von injizierten Fliegen (G0) mit Kohlendioxid betäuben und männliche Fliegen und jungfräuliche Weibchen trennen. Stellen Sie Fliegenkreuzungen her, indem Sie jedes G0-Männchen mit mindestens zwei jungfräulichen FM7/L-Weibchen in einzelnen schmalen CT-Futterfläschchen paaren. Stellen Sie gekreuzte Fläschchen in einen belüfteten Inkubator, der bei 25 °C und ~60 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird, bis F1 fliegt (FM7/L ist der am häufigsten verwendete X-Chromosomen-Balancer). Kombinieren Sie in ähnlicher Weise jedes G0-Weibchen mit FM7/Y-Männchen.
    3. Betäuben und sammeln Sie mindestens 10 jungfräuliche weibliche Nachkommen (F1) aus G0-Männchen- und -Weibchenkreuzungen. Sammeln Sie aus G0-Weibchenkreuzungen mindestens 10 männliche F1-Fliegen (Abbildung 3A). Stellen Sie sicher, dass jede F1-Fliege mit den Details ihrer Abstammung gekennzeichnet und separat aufbewahrt wird. Fahren Sie mit dem Screening-Schritt fort.
  7. Verwenden Sie das folgende PCR-Protokoll für einen Bein.
    1. Primer-Erstellung: Entwerfen Sie ein Primerpaar, das die Bearbeitungsstelle des Zielgens umfasst. Idealerweise sollten die Schmelztemperaturen der Primer ähnlich sein, etwa 55 °C.
    2. Vorbereitung des Lysepuffers: Bereiten Sie 10 μl Lysepuffer für jede Fliegenprobe vor. Der Puffer besteht aus 10 mM Tris (pH 8,2), 1 mM EDTA (pH 8,0), 25 mM NaCl und 400 μg/ml Proteinase K. Bereiten Sie den Lysepuffer als Mastermix vor und verteilen Sie dann 10 μl in jeder Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. Stellen Sie sicher, dass der Puffer während des gesamten Beindissektionsprozesses kalt bleibt (Abbildung 3B).
    3. Röhrchenaufstellung: Bereiten Sie Glaskapillarröhrchen vor, füllen Sie ein Ende mit Saccharose-Agar-Nahrung (2 % Agar und 4 % Saccharose) und legen Sie diese in eine 96-Well-Deep-Well-Platte, die als Fliegenhotel bezeichnet wird (Abbildung 3C).
    4. Beindissektion: Legen Sie das Kohlendioxid-Anästhesiepad unter ein Stereomikroskop, betäuben Sie eine mögliche Fliege und trennen Sie eines der Mittelbeine ab. Legen Sie das Bein in den Lysepuffer und sorgen Sie für ein vollständiges Eintauchen. Es ist nicht erforderlich, das Bein zu mazerieren, sondern direkt mit dem Lyseprotokollschritt fortzufahren (Abbildung 3B). Halten Sie den Fliegenflügel mit einer feinen Metallzange fest, bewegen Sie die Fliege zum Fliegenhotel und verschließen Sie den Schlauch sofort mit Garn.
    5. Kontrollproben: Zwei Wildtyp-Fliegen können nach dem gleichen Beindissektionsverfahren als Negativkontrollen verwendet werden. Ein verdünntes Spenderplasmid dient als Positivkontrolle.
    6. Pflege nach der Sektion: Bringen Sie das Fliegenhotel in einem belüfteten Inkubator unter, der bei 25 °C und ~60 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Während Fliegen über Nacht überleben können, wird empfohlen, die nachfolgenden Schritte und die Paarung noch am selben Tag abzuschließen.
    7. Lyseprotokoll: Legen Sie die abgetrennten Beine in die Lysepufferlösung in einen Thermocycler, der 90 Minuten lang auf 37 °C eingestellt ist, gefolgt von 95 °C für 5 Minuten und schließlich bei 4 °C. Dadurch wird genügend DNA aus dem einzelnen Bein jeder Fliege extrahiert (Abbildung 3B).
    8. PCR-Reaktion: Organisieren Sie die PCR-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers und verwenden Sie 1,5 μl des Fliegenschenkellysats als DNA-Quelle.
    9. Gelelektrophorese: Die PCR-Produkte einer Agarose-Gelelektrophorese unterziehen. Interpretieren Sie die Ergebnisse des Gels basierend auf der Bandgröße. Typischerweise weisen Fliegen mit negativer Kontrolle eine niedrigere Bande und Kontrollen mit positiver Plasmid eine höhere Bande auf. Stellen Sie sicher, dass bestimmte Bandengrößen mit dem ursprünglichen Spenderplasmiddesign übereinstimmen. Weibliche positive Fliegen weisen zwei Banden auf, da sie heterozygot sind, und männliche positive Fliegen weisen eine einzelne Bande auf (Abbildung 3B).
      HINWEIS: Normalerweise ist das Screening von 70 Fliegen an einem einzigen Tag möglich. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 10 positive F1-Fliegen über 4 bis 5 verschiedene G0-Kreuzungen identifizieren, da bestimmte F1-Fliegen aufgrund von Off-Target-Mutationen steril sein können.
  8. Führen Sie das folgende Post-PCR-Cross-Setup durch.
    1. Wählen Sie basierend auf den Gelergebnissen die positiven Fliegen aus dem Fliegenhotel aus und kreuzen Sie sie einzeln mit Balancer-Fliegen (FM7/L zur Markierung von X-Chromosomengenen), um die F2-Generation zu erzeugen. Sobald die F2-Generation auftaucht, etablieren Sie Geschwisterkreuzungen, um homozygote stabile Stämme zu schaffen (Abbildung 3D).
    2. Verwenden Sie homozygote Bestände für die Sanger-Sequenzierung der Bearbeitungsstelle, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Rückkreuzung validierter Fliegenlinien mit Wildtyp-Fliegen, um Hintergrundmutationen zu entfernen. Screenen Sie jede Generation mit dem einsträngigen PCR-Protokoll.

Ergebnisse

In unseren Experimenten fanden wir typischerweise eine Erfolgsrate von ~20%-30% beim Screening auf verschiedene endogene markierte Gene auf allen Chromosomen (X, II, III). Die Effizienz dieses Prozesses kann von mehreren Faktoren abhängen, wie z. B. der gRNA-Auswahl, der Art des Gens und der Injektionsqualität. Hier veranschaulichen wir die Ergebnisse unserer Strategie, das endogene Periodengen mit dem mNeonGreen Fluorophor13 zu markieren. Das Periodengen , das auf dem X-Chromosom von D. melanogaster positioniert ist, spielt eine zentrale Rolle in der zirkadianen Uhr. Drosophila hat ein gut charakterisiertes Uhrennetzwerk, das aus etwa 150 Uhrenneuronen besteht, die Uhrenproteineexprimieren 17.

Wir markierten das Periodenprotein mit dem grün fluoreszierenden Protein mNeonGreen an seinem C-terminalen Ende, das durch einen Dual-Glycin-Linker13 verbunden ist. Nach der Plasmidinjektion kreuzten wir die G0-Fliegen mit dem FM7/L-Balancer und ernteten anschließend die F1-Generation. Von 126 F1-Fliegen, die mit speziellen PCR-Primern untersucht wurden (Tabelle 1), identifizierten wir 47 positive Fälle, was einer Erfolgsquote von 37,3 % entspricht. Aus diesen wählten wir 5 F1-Personen aus, um zusätzliche Kreuzungen zu errichten, um stabile Bestände zu produzieren. Das Geschlecht hatte keinen Einfluss auf die positive Ergebnisrate während dieses Screenings. Nachdem wir die Sequenzgenauigkeit des markierten Gens überprüft hatten, führten wir Kontrolltests durch, einschließlich Verhaltensbewertungen und qPCR-Auswertungen, um mRNA-Oszillationen sicherzustellen, um die Funktionalität des markierten Proteins (PERIOD-mNeonGreen) zu bestätigen13.

Um Live-Imaging-Experimente durchzuführen, kreuzten wir diese PERIOD-mNeonGreen-Fliegen mit Clock856-GAL4; UAS-CD4-tdTomatenfliegen , wobei Clock856-GAL4 alle Uhrenneuronen19 markiert und CD4 ein Transmembranprotein ist, das Zellmembranen markiert. Für Live-Imaging-Experimente sezierten wir 3-4 erwachsene Gehirne mit eiskaltem Schneider's Drosophila-Medium. Die Gehirne wurden montiert und mit einem konfokalen Airyscan-Mikroskop abgebildet. Abbildung 4 zeigt die repräsentativen Bilder, die das PERIOD-Protein in Uhrenneuronen in Drosophila-Gehirnen zeigen.

Flussdiagramm für die Klonierung von sgRNA- und Spenderplasmiden, in dem die Injektion von CRISPR-Embryonen und das genetische Screening detailliert beschrieben sind.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des CRISPR/Cas9-basierten Gen-Editing-Protokolls. Das Protokoll beschreibt eine Reihe von Schritten zum Design und zur Assemblierung von sgRNA- und Spenderplasmiden, gefolgt von einem Screening durch die einsträngige PCR-Methode und der Herstellung stabiler technischer Linien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

CRISPR-Cas9-Gen-Editing-Diagramm; zeigt sgRNA, Cas9, DNA-Reparatur, homologiegerichtete Reparatur.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der CRISPR/Cas9-Genomeditierung zur Erzeugung perioden-mNeonGreen-Fliegen . (A) Schema, das die Hinzufügung eines fluoreszierenden Proteintags zum C-Terminus eines endogenen Gens veranschaulicht. (B) Das endogene Periodengen (per) ist mit mNeonGreen markiert, einem hellen, monomeren grün fluoreszierenden Protein am Carboxylterminus. Zwei sgRNAs befinden sich im letzten Exon bzw. in der 3'UTR. Der Donorvektor enthält zwei ~1 kb Homologiesequenzen, die den mNeonGreen-Tag flankieren. Stoppcodon wird am Ende des Tags hinzugefügt, um die Übersetzung ordnungsgemäß zu beenden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Fliegen-Screening-Prozess: genetische Kreuzungen und PCR-Methode, Diagramm, genomische DNA-Extraktion, Elektrophorese.
Abbildung 3: Strategie zum Screening auf CRISPR-positive Fliegen. (A) Ansatz zur Einrichtung von genetischen Kreuzungen für Gene, die für die CRISPR-Markierung auf X- und II-Chromosomen vorgesehen sind. G0 bezeichnet die anfänglich injizierten Fliegen, während F1 für ihre Nachkommen der ersten Generation steht, die gescreent werden müssen. (B) Die einsträngige PCR-Screening-Methode und die Dauer für jeden Verfahrensschritt werden beschrieben. (C) Hier ist ein Bild des Fly Hotels zu sehen. Glasröhrchen werden mit Fliegenfutter gefüllt und an einem Ende verschlossen. Einzelne Fliegen werden in einzelne Röhren geladen. Nachdem die DNA, die aus der mittleren Leine einzelner Fliegen extrahiert wurde, getestet wurde, werden die entsprechenden Fliegen aus dem Fliegenhotel entnommen und die stabilen Linien festgelegt. (D) Ansatz zum Aufstellen von Fliegenkreuzungen nach dem Screening (hier in blau), die den Screening-Test bestanden haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zellfluoreszenzmikroskopie-Bild; ZT0-ZT2; Lokalisierung von Proteinen; Vergleich zellulärer Prozesse.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder des PERIOD-mNeonGreen-Proteins in Uhrenneuronen. Repräsentative Bilder von period-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdTomato-Fliegen , die in Hell-Dunkel-Zyklen verschleppt wurden. ZT bezieht sich auf Zeitgeber Time und ZT0 bezieht sich auf die Zeit des Einschaltens der Lichter und ZT12 bezieht sich auf die Zeit des Ausschaltens der Lichter. Die Kernhülle des Uhrenneurons ist mit tdTomato markiert, hier rot dargestellt, und das PERIOD-Protein ist mit mNeonGreen markiert und grün dargestellt. Das PERIOD-Protein ist während der späten Nacht und des frühen Morgens in diskreten Kernherden organisiert. Maßstabsleisten, 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

NameDNA-Sequenz (5' bis 3')
Perioden-Screening-Primer vorwärtsATACTCGTCCATAGACCACG
Perioden-Screening-Primer RückseiteACATTATCCTCGGCTTGCAT
pro gRNA1-SinncttcACCAGACACAGCACGGGGAT
per-gRNA1-AntisenseaaacATCCCCGTGCTGTGTCTGGT
pro gRNA2-SinncttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG
per-gRNA2-AntisenseaaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC
Periodenhomologiearme und mNeonGreen-EinsatzGAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA
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GAAGCTGCTCTGGGCCATGGCCGTGTGCGTGGAG
TGAACGGGCGGTGTGTGATGCCCACCGAGAACGGTG
GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA

Tabelle 1: Liste der sgRNA-Sequenzen zur Markierung des endogenen Periodengens am C-Terminal und Primer, die zur Durchführung eines einsträngigen PCR-Screenings verwendet werden.

Diskussion

Die Ergebnisse zeigen eine schlanke, einfache, einstufige CRISPR-basierte Strategie zur Markierung endogener Gene in Drosophila. In dem Protokoll verwenden wir zwei gRNAs, um DNA-Doppelstrangbruch und homologe Rekombination effizienter zu induzieren. Die gRNAs und das Spenderplasmid werden in Fruchtfliegenembryonen injiziert, die in ihrer Keimbahn das Cas9-Enzym exprimieren. Diese Embryonen werden anschließend unter Standardbedingungen bis zum Erwachsenenalter kultiviert, dann werden sie mit Balancierfliegen gekreuzt, um die Nachkommen der ersten Generation (F1) zu erzeugen. Die PCR-Genotypisierung wird am Mittelschenkel jeder F1-Probe durchgeführt, um nach genetisch veränderten Fliegen zu suchen. Diese Methode bietet einen wesentlichen Vorteil gegenüber den derzeitigen Screening-Methoden, die zwei Screening-Schritte verwenden, wobei der erste Schritt auf der Verwendung eines sichtbaren Markers wie der Augenfarbe beruht, um den entsprechenden Genotyp zu identifizieren, und der zweite Schritt die Entfernung des Augenfarbenmarkers10 beinhaltet. Hier stellen wir eine Methode vor, die PCR an DNA verwendet, die aus einem kleinen Segment des Mittelbeins einer einzelnen Fliege extrahiert wurde und eine nicht-letale Genotypisierung einzelner Fliegen ermöglicht und eine effizientere und kostengünstigere Alternative zu bestehenden Methoden bietet. Diese Methode ermöglicht das Screening von Kandidatentieren einzeln oder in Chargen, bis der entsprechende Genotyp isoliert ist. Die Anzahl der Tiere, die gescreent werden, bevor geeignete Bestände isoliert werden, variiert von Versuch zu Versuch und hängt von vielen Faktoren ab, darunter die Effizienz der ausgewählten sgRNAs, die Effizienz der Injektion und Off-Target-Insertionen, die die Lebensfähigkeit beeinträchtigen können. Alternativ kann auch DNA von einzelnen Flügeln einzelner Fliegen für Genotypisierungszwecke verwendet werden18.

Es ist möglich, dass das Hinzufügen eines Tags zum N- oder C-Terminus eines Gens die Funktion des Gens beeinträchtigen kann, was möglicherweise die Lebensfähigkeit der Fliegen beeinträchtigen kann. Wenn Proteinstrukturinformationen verfügbar sind, können diese verwendet werden, um zu bestimmen, ob N- oder C-terminales Tagging die Funktion und Lokalisierung des nativen Proteins besser erhalten kann. Es wird immer empfohlen, Kontrollexperimente durchzuführen, einschließlich der Prüfung, ob das markierte Protein ein ähnliches Lokalisierungsmuster wie das Wildtyp-Protein durch Antikörperfärbemethoden zeigt. Die gleiche Screening-Strategie kann verwendet werden, um andere Arten von CRISPR-basierten genetischen Insertionen oder Deletionen zu screenen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die einstufige Screening-Strategie die Erzeugung von CRISPR-editierten Fliegen erheblich erleichtert und viele Möglichkeiten eröffnet, die subzelluläre Lokalisation und Dynamik endogener Gene in ihrem nativen Kontext zu untersuchen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Wir danken George Watase und Josie Clowney für die Diskussionen in der Anfangsphase der Protokollentwicklung. Die Arbeit wurde durch Mittel des NIH (Zuschuss Nr. R35GM133737 an S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (an S. Y.) und McKnight Scholar Award (an S. Y.) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0.5M EDTA pH8.0InvitrogenAM9260G
5-alpha Kompetent E. coli ( Hohe Effizienz)NEBC2987H
96-Well-Deep-Well-PlatteMARKE701354
AgarFisher ScientificBP1423-500
BbsI-HFNEBR3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo ScientificK1081
D-SaccharoseFisher ScientificBP220-1
EcoRI-HFNEBR3101S
SalzsäureFisher ScientificA142-212
Prolong Glas Antifade EindeckmediumInvitrogenP36982
Proteinase KQIAGEN19131
Schneider's Drosophila MediumGibco21720001
NatriumchloridFisher ScientificS271-500
T4 DNA-LigaseNEBM0202S
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
XbaINEBR0145S

Referenzen

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Schlagwörter

CRISPR Gen TaggingFluoreszenzprotein Knock inhomologe RekombinationsgRNA DesignDonor Plasmid KonstruktionPCR GenotypisierungSanger SequenzierungKonfokalmikroskopie

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