Adoptiver Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen in Bleomycin-induzierte Mausmodelle, um ihre Wirkung auf die idiopathische Lungenfibrose in vivo zu untersuchen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von pulmonalen interstitiellen Makrophagen (IMs) und deren adoptiven Transfer nach IL-33-Stimulation der Lungenbläschen in einem Mausmodell, was die In-vivo-Untersuchung der idiopathischen Lungenfibrose (IPF) erleichtern kann.

Zusammenfassung

Die Entzündungsreaktion, die durch eine frühe Lungenschädigung verursacht wird, ist eine der wichtigsten Ursachen für die Entwicklung einer idiopathischen Lungenfibrose (IPF), die mit der Aktivierung von Entzündungszellen wie Makrophagen und Neutrophilen sowie der Freisetzung von Entzündungsfaktoren wie TNF-α, IL-1β und IL-6 einhergeht. Es ist bekannt, dass eine frühe Entzündung, die durch aktivierte pulmonale interstitielle Makrophagen (IMs) als Reaktion auf die IL-33-Stimulation verursacht wird, eine wichtige Rolle im pathologischen Prozess der IPF spielt. Dieses Protokoll beschreibt den adoptiven Transfer von IMs, die durch IL-33 stimuliert werden, in die Lunge von Mäusen, um die IPF-Entwicklung zu untersuchen. Es beinhaltet die Isolierung und Kultivierung von primären IMs aus der Lunge der Wirtsmaus, gefolgt von der adoptiven Übertragung von stimulierten IMs in die Alveolen von Bleomycin-induzierten IPF-Empfängermäusen (die zuvor durch die Behandlung mit Clodronat-Liposomen an Alveolarmakrophagen erschöpft waren) und die pathologische Bewertung dieser Mäuse. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass der adoptive Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen die Lungenfibrose bei Mäusen verschlimmert, was darauf hindeutet, dass die Etablierung des Makrophagen-Adoptivtransfer-Experiments ein gutes technisches Mittel zur Untersuchung der IPF-Pathologie ist.

Einleitung

Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) ist eine diffuse pulmonale entzündliche Erkrankung, die durch viele Faktoren verursacht wird¹. In der Zytokin-Mikroumgebung der Th1- und Th2-Immunantwort können Makrophagen in klassisch aktivierte Makrophagen (M1) und alternativ aktivierte Makrophagen (M2) polarisiert werden. Lipopolysaccharide (LPS) oder das Zytokin IFN-γ induzieren M1-Makrophagen, um proinflammatorische Zytokine, einschließlich iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α und IL-12, zu polarisieren und zu produzieren. Im Gegensatz dazu treiben die Typ-II-Zytokine IL-4 und IL-13 die Polarisation von M2-Makrophagen an, die verschiedene wachstumsfördernde Faktoren wie TGF-β und PDGF produzieren können, die die Lungenfibrose^{fördern 2}. Der pathologische Prozess der IPF wird von der Aktivierung und Infiltration von Makrophagen begleitet. IPF vermittelt die Reparatur von Verletzungen, Entzündungen und Fibrose durch die Freisetzung von Zytokinen³. Da nur begrenzte Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen, ist die Erforschung der molekularpathologischen Mechanismen der IPF von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Strategien zur Prävention und Behandlung von IPF. Frühere Studien unserer Gruppe und anderer Forscher ^4,5 haben die erhöhte Freisetzung von IL-33 bei IPF-Patienten und in Mausmodellen mit Bleomycin (BLM)-induziertem IPF bestätigt. IL-33 wird während der Fibrose von den Epithel- und Endothelzellen freigesetzt und ist an der Aktivierung von Makrophagen beteiligt, was zu einer abnormalen Proliferation von Fibroblasten, einer Leukozyteninfiltration und schließlich zum Verlust der Lungenfunktion führt⁵. Das aktuelle Protokoll beschreibt den adoptiven Transfer von IL-33-stimulierten interstitiellen Makrophagen (IMs) in die Alveolen als Mittel zur Untersuchung der IPF-Entwicklung in Mausmodellen. Hier wurden IMs aus dem Lungengewebe von Wirtsmäusen isoliert, in vitro kultiviert, 24 h lang mit IL-33 stimuliert und dann adoptiv durch Trachealinjektion in die Alveolen der Empfängermäuse übertragen. Es wurde festgestellt, dass die direkte Entnahme von stimulierten Mausmakrophagen und deren adoptiver Transfer in die Empfängeralveolen den Grad der Lungenfibrose verschlimmert und den Einfluss stimulierender Faktoren auf die Fibrose im Vergleich zu den vorherigen Studien deutlicher veranschaulichen^{kann 6}. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik kann es Forschern ermöglichen, die Funktion von Makrophagen, die durch potenzielle Zytokine stimuliert werden, bei der Entwicklung von IPF zu untersuchen.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für experimentellen Tierschutz der Universität Jiangnan genehmigt (JN Nr. 20211,¹³⁰m1720615[501]).

HINWEIS: Insgesamt wurden in dieser Studie 10 männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Die drei Versuchsgruppen in der Studie umfassten jeweils drei Empfängermäuse, und eine Wirtsmaus wurde für die IM-Isolierung verwendet.

1. Erschöpfung der Lungenmakrophagen der Maus

1. Nehmen Sie die Durchstechflasche mit Clodronat-Liposomen (siehe Materialtabelle) 30 Minuten vorher aus dem Kühlschrank, erwärmen Sie sie auf Raumtemperatur und drehen Sie sie mehrmals um, um eine gleichmäßige Durchmischung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Clodronat-Liposomen verkapseln die hydrophilen Dichlormethylenbisphosphonat-Moleküle. Wenn diese Liposomen von den Makrophagen verbraucht werden, wird das Clodronat allmählich durch die Wirkung der Lysosomenphosphatase freigesetzt, und seine Akkumulation löst folglich die Zellapoptose und die Erschöpfung der Makrophagen^{aus 7}.
2. Mäuse mit 3% Isofluran anästhesieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie einen Fuß kneifen, um das Bewusstsein zu überprüfen. Tragen Sie Veterinärsalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
3. Aspirieren Sie 60 μl Clodronat-Liposomen mit einer Pipette mit steriler Saugspitze. Verabreichen Sie das Medikament tropfenweise in die Nasenhöhle der anästhesierten Maus, so dass das Medikament beim Einatmen der Maus in die Luftröhre eingeatmet wird. Stellen Sie nach jedem Tropfen sicher, dass die Maus das Medikament vollständig einatmet und gleichmäßig atmet. Verabreichen Sie Liposomen, die PBS allein als Kontrolle enthalten⁸ (Abbildung 2).
4. Legen Sie die Mäuse zum Aufwärmen auf einen 38 °C Konstanttemperaturtisch, um ihre Genesung zu beschleunigen. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie aufwachen. Nachdem sich die Mäuse gut erholt und eine sternale Liegeposition erreicht haben, übertragen Sie sie in den Käfig.
5. Verwenden Sie Mäuse mit erschöpften Alveolarmakrophagen 2 Tage nach der Behandlung mit Clodronat-Liposomen als Empfängermäuse für das Transferexperiment.
   ANMERKUNG: In dieser Studie wurde die Depletion von Alveolarmakrophagen bestätigt, indem die Expression von Makrophagenmarkern, wie zuvor beschrieben ^8,9, nach der Verabreichung von Clodronat-Liposomen durch Inhalation überprüft wurde (siehe ergänzende Abbildung 1).

2. Isolation und Kultur von IMs

1. Anästhesieren Sie die Wirtsmaus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (120 mg/kg) und Xylazin (16 mg/kg). Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie über den Verlust des Zehenklemmreflexes. Tragen Sie Veterinärsalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern. Desinfizieren Sie dann die Haut der anästhesierten Maus mit 75% Alkohol und Jod. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut zu durchschneiden und das Herz-Lungen-Gewebe freizulegen
2. Aspirieren Sie 10 ml 1x PBS in einer Spritze mit einer 20-G-Nadel und führen Sie die Nadelspitze in den rechten Vorhof der Maus ein (Abbildung 3A). Schneiden Sie die untere Hohlvene der Maus mit einer chirurgischen Schere ab und perfundieren Sie die Maus dann manuell mit PBS bei konstanter Geschwindigkeit (10-20 ml / min), bis das Lungengewebe weiß wird. Das Lungengewebe wird entfernt und in einer Kulturschale in eiskaltes PBS überführt (Abbildung 3B).
3. Schneiden Sie das Lungengewebe in Fragmente von ca. 2 mm x 2 mm x 2 mm. Geben Sie dann 15 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, das 1% Kollagenase A enthält, in das Lungengewebe, um die Makrophagen zu isolieren. Bei 100 U/min 30 min auf einem 37 °C heißen Schütteltisch inkubieren.
4. Saugen Sie die Lungengewebesuspension mindestens 20x durch eine 10-ml-Spritze ab, um sie so fein wie möglich zu machen. Filtern Sie diese Suspension durch ein 40-μm-Zellsieb. Das Filtrat wird bei 400 x g 10 min zentrifugiert und der Überstand verworfen.
5. Lysieren Sie die roten Blutkörperchen im Pellet, indem Sie 3 ml Erythrozyten-Lysepuffer (siehe Materialtabelle) 2-3 Minuten lang auf Eis geben.
6. Nach Zentrifugation bei 150 x g für 5 min wird das Zellpellet mit 10 ml DMEM (mit 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) resuspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
7. Die Zellen werden in 10 cm adhärente Zellkulturschalen mit 2 x 10^{7 Zellen/} Schale gesät und 1 h bei 37 °C und 5% CO₂ inkubiert. Dadurch können die Lungen-IMs an der Schale⁵ haften. Nach 1 h aspirieren Sie den Überstand und die schwimmenden Zellen und fügen Sie 10 ml frisches vollständiges Kulturmedium hinzu (DMEM mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin). Inkubieren Sie länger als 8 Stunden oder über Nacht.
8. Bestimmen Sie die Reinheit der erhaltenen IMs mittels Durchflusszytometrie mit Färbung für F4/80- und CD11c-Marker, wie zuvor^{beschrieben 5} (siehe ergänzende Abbildung 1).

3. Adoptive Übertragung von IMs in die Lungenbläschen

1. Ersetzen Sie das Nährmedium von der Platte, die die isolierten Lungen-IMs enthält (Schritt 2.7), durch ein vollständiges Kulturmedium, das 10 ng/ml IL-33 enthält, um die IMs zu stimulieren. 24 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren. Verwenden Sie 1x PBS anstelle von IL-33 als Kontrolle.
2. Dissoziieren Sie die pulmonalen IMs, indem Sie sie 5 Minuten lang mit 1 ml 0,25% Trypsin behandeln. Dann wird die Verdauung durch Zugabe von 3 ml Frischkulturmedium gelöscht und die Lungenmakrophagen geerntet, indem die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 150 x g und 4 °C zentrifugiert wird. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren Sie die Zellen in PBS auf eine Endkonzentration von 5 x 10⁵ Zellen/50 μl.
3. Betäuben Sie die Empfängermäuse mit 3% Isoflurangas. Warten Sie, bis die Maus bewusstlos geworden ist (wie in Schritt 1.2), und befestigen Sie dann die Gliedmaßen der anästhesierten Maus mit medizinischem Klebeband auf einer vertikalen Platte. Ziehen Sie die Zunge der Maus vorsichtig mit einem Wattestäbchen zur Seite.
4. Schalten Sie die Intubationslampe ein und leuchten Sie sie auf den Hals der Maus, so dass die Luftröhre zu sehen ist. Überprüfen Sie, ob sich die Luftröhre in der Nähe der Zungenbasis befindet, die Speiseröhre sich in der Nähe des Nackens befindet, die Öffnung der Speiseröhre jedoch während der Operation nicht sichtbar ist.
5. Verwenden Sie die Intubationslampe (22 G), um die Maus zu intubieren. Führen Sie die Verweilnadelkanüle mit einem Führungsdraht (0,4 mm Durchmesser) in die Luftröhre. Entfernen Sie den Führungsdraht und schieben Sie die Kanüle in die Luftröhre der Maus, um die Intubation abzuschließen.
6. Nachdem beobachtet wurde, dass die Kanüle in die Luftröhre gelangt, injizieren Sie 50 μl der Zellsuspension (mit 5 x 10⁵ IMs) durch die Luftröhre in die Empfängermaus.
7. Legen Sie die Mäuse zum Aufwärmen auf ein 38°C warmes Warmwarmkissen, um die Erholung zu beschleunigen. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie aufwachen. Nachdem sie sich gut erholt und eine sternale Liegeposition erreicht haben, bringen Sie sie in den Käfig.
8. Nach 24 h wird Bleomycin (BLM) über die Luftröhre (unter Verwendung des Verfahrens in den Schritten 3.3-3.5) in einer Dosis von 1,4 E/kg Körpergewicht verabreicht, um IPF zu induzieren. Verabreichen Sie der Kontrollgruppe eine gleiche Menge Kochsalzlösung.
9. Bestimmen Sie nach 21 Tagen den Schweregrad der Lungenfibrose für die verschiedenen Gruppen von Mäusen, die adoptiv mit PBS oder der IL-33-stimulierten IM-Suspension übertragen wurden, indem Sie die Expression von Markern für Fibrose und die Ashcroft-Scores¹⁰ bewerten.
   1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus dem Lungengewebe mit einem RNA-Extraktionsreagenz (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die quantitative Analyse wurde mit einem Mikroplatten-Reader durchgeführt. Wenn das OD260/OD280-Verhältnis 1,8-2,0 beträgt, ist die RNA-Reinheit hoch. Alle Proben wurden bei -80 ° C gelagert.
   2. Führen Sie eine quantitative Fluoreszenz-PCR durch, um die Expression von α-glattem Muskelaktin (SMA) und Fibronektin unter Verwendung spezifischer Primer zu bewerten.
      HINWEIS: Die für α-SMA verwendeten Primer waren vorwärts 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' und rückwärts 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCAAT-3', und die für Fibronektin verwendeten Primer waren vorwärts 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' und rückwärts 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
10. Führen Sie die Immunhistochemie wie unten beschrieben durch.
    1. Dehydrieren Sie die linke Lunge, betten Sie sie ein und schneiden Sie sie mit einem Paraffinschneider auf eine Dicke von 4 μm.
    2. Legen Sie die Gewebeschnitte auf Objektträger und backen Sie die Objektträger in einem Ofen bei 65-70 ° C für 30 min bis 1 h. Entwachen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit einem abnehmenden Alkoholgehalt (d. h. 100 %, 95 %, 90 %, 80 % und 70 % Alkohol).
    3. Färben Sie die Objektträger 5 Minuten lang in Hämatoxylin-Farbstofflösung (analytisch rein). Waschen Sie dann die Folien mit Leitungswasser. Die Objektträger 3 s in 1% Salzsäurealkohol einweichen, die schwimmende Farbe abwaschen und 5 Minuten in fließendem Wasser einweichen. Die Abschnitte werden blau.
    4. 10 s bis 1 Minute in Eosinlösung eintauchen (Färbezeit entsprechend der Farbe bestimmen), mit Leitungswasser waschen und jeweils 5 Minuten lang 70 %, 80 %, 95 %, 100 % bzw. 100 % Alkohol einfüllen. Dann legen Sie die Objektträger für 3 Minuten in Xylol I- und Xylol II-Lösungen. Beobachten und fotografieren Sie nach dem Trocknen unter dem vertikalen Mikroskop mit neutraler Klebefolie.
    5. Führen Sie eine Ashcroft-Bewertung in den Abschnitten durch, um den Schweregrad der Lungenfibrose^{anzuzeigen 10}. Führen Sie eine statistische Analyse der Daten mit einem t-Test von zwei unabhängigen Stichproben durch.

Ergebnisse

Das hier verwendete Protokoll ist im Flussdiagramm in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Inhalation von Clodronat-Liposomen durch die Nase (Abbildung 2) wurde verwendet, um die Lungenmakrophagen von erwachsenen C57BL/6-Mäusen zu erschöpfen, und dies führte zu einem guten Empfänger-Mausmodell. Pulmonale IMs wurden von einer anderen unbehandelten (Wirts-)Maus isoliert (Abbildung 3A, B) und in vitro kultiviert....

Diskussion

Diese Studie bietet eine effektive Methode zum Abbauen, Isolieren, Kultivieren und Übertragen von Makrophagen, die bei der Untersuchung der Mechanismen der Lungenfibrose bei Mäusen helfen kann. Es gibt viele Methoden zur Verarmung von Mausmakrophagen, wie z. B. die Verabreichung von Trachealgefäßen, die Injektion von Schwanzvenen und die Naseninhalation¹¹. Diese Studie optimierte die nasale Inhalationsmethode, die einfach zu bedienen ist und Lungenmakrophagen effektiv abbauen kann

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterielle Verweilnadel	B Braun Melsingen AG,Deutschland	21G15G8393
BD  Accuri  C6 Plus	Becton Dickinson, USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Kohlendioxid-Inkubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R& D Systems, USA	1124F
CD11c	F& T & D Systems, USA	N418
Zellkulturschale	Thermo Forma, USA	174926
Clodronat-Liposomen	Clodronat-Liposomen, Niederlande	CI-150-150
Kollagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R& D Systems, USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton, Dickinson and Company, USA	352340
Fötales Rinderserum (FBS)	Life technologies, USA	1047571
Hämatoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology, China	06-570
LightCycler 480 PCR-Nachweissystem	Roche, USA
Rekombinanter Mausfaktor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon Mikroskop	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, Streptomycin	Life Technologies, USA	877113
Phosphat Puffer (PBS)	Guangdong Huankai Mikrobielle Technologie, China	1535882 RBC-Lysepuffer
	Beyotime Biotechnology Company, China	C3702
RNA-Isolator	Vazyme Unternehmen, China	R401-01-AA	Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz
RWD Inhalationsanästhesiemaschine	Shenzhen Rayward Life Technology, China	R500
Halbautomatisches Paraffin Allesschneider	Leica, Deutschland	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0,25%	Life Technologies, USA	1627172