Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von pulmonalen interstitiellen Makrophagen (IMs) und deren adoptiven Transfer nach IL-33-Stimulation der Lungenbläschen in einem Mausmodell, was die In-vivo-Untersuchung der idiopathischen Lungenfibrose (IPF) erleichtern kann.
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Methodenartikel
Adoptiver Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen in Bleomycin-induzierte Mausmodelle, um ihre Wirkung auf die idiopathische Lungenfibrose in vivo zu untersuchen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Entzündungsreaktion, die durch eine frühe Lungenschädigung verursacht wird, ist eine der wichtigsten Ursachen für die Entwicklung einer idiopathischen Lungenfibrose (IPF), die mit der Aktivierung von Entzündungszellen wie Makrophagen und Neutrophilen sowie der Freisetzung von Entzündungsfaktoren wie TNF-α, IL-1β und IL-6 einhergeht. Es ist bekannt, dass eine frühe Entzündung, die durch aktivierte pulmonale interstitielle Makrophagen (IMs) als Reaktion auf die IL-33-Stimulation verursacht wird, eine wichtige Rolle im pathologischen Prozess der IPF spielt. Dieses Protokoll beschreibt den adoptiven Transfer von IMs, die durch IL-33 stimuliert werden, in die Lunge von Mäusen, um die IPF-Entwicklung zu untersuchen. Es beinhaltet die Isolierung und Kultivierung von primären IMs aus der Lunge der Wirtsmaus, gefolgt von der adoptiven Übertragung von stimulierten IMs in die Alveolen von Bleomycin-induzierten IPF-Empfängermäusen (die zuvor durch die Behandlung mit Clodronat-Liposomen an Alveolarmakrophagen erschöpft waren) und die pathologische Bewertung dieser Mäuse. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass der adoptive Transfer von IL-33-stimulierten Makrophagen die Lungenfibrose bei Mäusen verschlimmert, was darauf hindeutet, dass die Etablierung des Makrophagen-Adoptivtransfer-Experiments ein gutes technisches Mittel zur Untersuchung der IPF-Pathologie ist.
Einleitung
Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) ist eine diffuse pulmonale entzündliche Erkrankung, die durch viele Faktoren verursacht wird1. In der Zytokin-Mikroumgebung der Th1- und Th2-Immunantwort können Makrophagen in klassisch aktivierte Makrophagen (M1) und alternativ aktivierte Makrophagen (M2) polarisiert werden. Lipopolysaccharide (LPS) oder das Zytokin IFN-γ induzieren M1-Makrophagen, um proinflammatorische Zytokine, einschließlich iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α und IL-12, zu polarisieren und zu produzieren. Im Gegensatz dazu treiben die Typ-II-Zytokine IL-4 und IL-13 die Polarisation von M2-Makrophagen an, die verschiedene wachstumsfördernde Faktor....
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Protokoll
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission für experimentellen Tierschutz der Universität Jiangnan genehmigt (JN Nr. 20211,130m1720615[501]).
HINWEIS: Insgesamt wurden in dieser Studie 10 männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht von 20-25 g verwendet. Die drei Versuchsgruppen in der Studie umfassten jeweils drei Empfängermäuse, und eine Wirtsmaus wurde für die IM-Isolierung verwendet.
1. Erschöpfung der Lungenmakrophagen der Maus
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Ergebnisse
Das hier verwendete Protokoll ist im Flussdiagramm in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Inhalation von Clodronat-Liposomen durch die Nase (Abbildung 2) wurde verwendet, um die Lungenmakrophagen von erwachsenen C57BL/6-Mäusen zu erschöpfen, und dies führte zu einem guten Empfänger-Mausmodell. Pulmonale IMs wurden von einer anderen unbehandelten (Wirts-)Maus isoliert (Abbildung 3A, B) und in vitro kultiviert........
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Diskussion
Diese Studie bietet eine effektive Methode zum Abbauen, Isolieren, Kultivieren und Übertragen von Makrophagen, die bei der Untersuchung der Mechanismen der Lungenfibrose bei Mäusen helfen kann. Es gibt viele Methoden zur Verarmung von Mausmakrophagen, wie z. B. die Verabreichung von Trachealgefäßen, die Injektion von Schwanzvenen und die Naseninhalation11. Diese Studie optimierte die nasale Inhalationsmethode, die einfach zu bedienen ist und Lungenmakrophagen effektiv abbauen kann
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Die Autoren würdigen das Special Topic of Laboratory Management der Jiangnan University: Construction of Digital Slice Library Based on Pathological Specimens (JDSYS202223) und der National Natural Science Foundation of China (81800065).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterielle Verweilnadel | B Braun Melsingen AG,Deutschland | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson, USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Kohlendioxid-Inkubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R& D Systems, USA | 1124F | |
| CD11c | F& T & D Systems, USA | N418 | |
| Zellkulturschale | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronat-Liposomen | Clodronat-Liposomen, Niederlande | CI-150-150 | |
| Kollagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R& D Systems, USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton, Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Life technologies, USA | 1047571 | |
| Hämatoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology, China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR-Nachweissystem | Roche, USA | ||
| Rekombinanter Mausfaktor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon Mikroskop | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, Streptomycin | Life Technologies, USA | 877113 | |
| Phosphat Puffer (PBS) | Guangdong Huankai Mikrobielle Technologie, China | 1535882 RBC-Lysepuffer | |
| Beyotime Biotechnology Company, China | C3702 | ||
| RNA-Isolator | Vazyme Unternehmen, China | R401-01-AA | Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz |
| RWD Inhalationsanästhesiemaschine | Shenzhen Rayward Life Technology, China | R500 | |
| Halbautomatisches Paraffin Allesschneider | Leica, Deutschland | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
Referenzen
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray an....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
