Einfache kontinuierliche Glukosemessung bei frei beweglichen Mäusen

Diabetes mellitus (DM) ist eine verheerende Krankheit, die durch einen hohen Blutzuckerspiegel gekennzeichnet ist. DM Typ 1 kann die Folge eines Autoimmunangriffs auf die insulinproduzierenden Betazellen in der Bauchspeicheldrüse sein. DM Typ 2 und DM in der Schwangerschaft hingegen sind dadurch gekennzeichnet, dass die Betazellen als Reaktion auf einen Anstieg des Glukosespiegels nicht genügend Insulin ausschütten^{können 1}. Die Maus ist ein häufiger Modellorganismus, der zur Untersuchung von DM verwendet wird, da sie eine ähnliche Physiologie aufweist und ihre normalen Glukosewerte denen des Menschen nahe kommen. Darüber hinaus können bestimmte Mausstämme aufgrund von Mutationen in wichtigen Signalwegen oder nach der Exposition gegenüber bestimmten Diäten DM entwickeln, was eine Krankheitsmodellierung ermöglicht ^2,3,4.

Der Blutzucker wird üblicherweise bei Mäusen mit Blutzuckermessgeräten gemessen, die für Patienten entwickelt wurden, indem ein kleiner Blutstropfen (1-2 μl) aus der Schwanzspitze der Maus entnommen wird. Diese Methode verursacht Stress und erfordert den Umgang mit der Maus, was sich auf den Glukosespiegel auswirkt und die Messung des Blutzuckerspiegels bei sich frei verhaltenden Mäusen oder wenn der Forscher nicht in der Nähe ist, verbietet⁵. Das Ausbluten der Mäuse kann bei Mäusen in der Nähe Stress verursachen, insbesondere bei Mäusen desselben Käfigs, deren Glykämie noch nicht gemessen wurde, was die Ergebnisse beeinträchtigt. Mäuse reagieren je nach Handler unterschiedlich, und die Person, die Glukose misst, kann den Glukosespiegel der Mäuse beeinflussen. Diese Fallstricke erfordern eine sorgfältige Versuchsplanung und unterliegen einigen Inkonsistenzen zwischen den Experimenten.

Es ist möglich, die Glukose in frei beweglichen Mäusen ohne Blutung zu messen, indem Glukosesensoren mit Hilfe modernster Telemetrie in den Aortenbogen der Mäuse implantiert^{werden 6}. Die daraus resultierenden Messungen sind sehr gut und können über einen langen Zeitraum aufrechterhalten werden, aber es ist eine Herausforderung, diese Sensoren zu implantieren, und das Telemetriesystem ist teuer, was zu einer moderaten Einführung dieser Methodik und keiner Akzeptanz in nicht spezialisierten Labors führt. In den letzten Jahren wurden subkutane oder andere Glukosesensoren entwickelt, die auf die Abmessungen der Mäuse und ihre Physiologie zugeschnitten sind, aber auch diese erfordern hochqualifizierte Experten und sind in einigen Fällen kostspielig 6,7,8,9,10.

Kommerzielle kontinuierliche Glukosemessgeräte (CGMs), die ursprünglich zur Überwachung des Glukosespiegels von DM-Patienten entwickelt wurden, bieten eine weitere Möglichkeit, die Glukose in frei beweglichen Mäusen zu messen, und zwar mit geringeren Kosten und technischem Know-how als implantierte Sonden. Solche Sonden wurden in der Grundlagenforschung von einigen Labors^{verwendet 5,11,12,13,14,15}, einschließlich unserer Kollegen^, die dieses Protokoll verwendeten ¹⁶. Diese Geräte umfassen in der Regel einen Sensor, eine Montagevorrichtung, einen Empfänger und eine Softwareanwendung. Der Sensor verfügt über eine Kanüle, die den enzymatischen Glukosesensor führt, Klebeband, eine Energiequelle, ein Kurzzeitgedächtnis und ein drahtloses Kommunikationsmodul, das die Daten speichert und an den Empfänger sendet. Der Empfänger kann den aktuellen Glukosespiegel anzeigen und sendet die Daten an einen Server. Bei diesem Empfänger kann es sich um ein Mobiltelefon handeln. Die Softwareanwendung liefert dem Patienten und dem medizinischen Versorgungsteam Daten über den Blutzucker des Patienten. Bei Patienten wird der Sensor einfach über die Halterung befestigt. Die Kanüle wird subkutan eingeführt, indem die Halterung gegen die Haut gedrückt wird, und der Sensor bleibt mit Hilfe von Klebeband an Ort und Stelle.

Dabei handelt es sich um ein detailliertes Protokoll zur Anpassung eines kommerziellen CGM-Geräts zur Messung des Glukosespiegels bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt, wie der Glukosesensor chirurgisch eingeführt und an der Maus befestigt wird. Skripte für die grundlegende Datenanalyse und Datenvisualisierung werden bereitgestellt. Die potenziellen Fallstricke, die Fehlerbehebung und Beispiele für Standardergebnisse werden bereitgestellt. Das folgende Protokoll ist spezifisch für ein bestimmtes CGM, kann aber leicht an andere Arten von kommerziellen CGMs angepasst werden, sobald diese verfügbar sind.

Die Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Hebräischen Universität genehmigt.

Anmerkungen: Alle Werkzeuge müssen sterilisiert sein und die Handhabung der Kanüle muss steril erfolgen. Das folgende Protokoll ist auf ein bestimmtes CGM abgestimmt. Das Protokoll kann an andere CGMs angepasst werden.

1. Verabreichung von Analgetika vor dem Eingriff

1. Verabreichen Sie 5 % Dextrose und 0,45 % Kochsalzlösung mit Meloxicam in einer Dosis von 5 mg/kg Körpergewicht subkutan.

2. Verabreichung der Anästhesie

1. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und schließen Sie den Deckel fest. Stellen Sie die Anästhesieeinleitung in der Induktionskammer auf 3 % Isofluran bei einer Flussrate von 500 ml/min ein.
2. Sobald die Maus nicht mehr reagiert, nehmen Sie die Maus aus der Kammer und setzen Sie den Nasenkegel auf die Maus ein. Bestätigen Sie die Anästhesiestufe mit einer interdigitalen Pinch. Stellen Sie die Konzentration auf 1%-1,5% Isofluran und die Flussrate auf 100 ml/min in einer Maus mit einem Gewicht von 30 g ein.
3. Tragen Sie Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.

3. Vorbereitung des Sensors

1. Montieren Sie den Sensor an der Sensorhalterung, um das Klebeband und die Kanülenseite des Sensors freizulegen (Abbildung 1A). Seien Sie vorsichtig, da die Nadel in die Kanüle eingeführt und freigelegt wird.
2. Nähen Sie zwei 5-0-Nähte mit konischem Punkt auf beiden Seiten der Kanüle an das Band (Abbildung 1A).

4. Haarentfernung und Desinfektion

1. Rasieren Sie einen Bereich von ca. 4 cm x 4 cm auf der Mittellinie der Rückseite der Maus.
2. Tragen Sie eine Enthaarungscreme auf die rasierte Stelle auf, um eine vollständige Haarentfernung zu gewährleisten.
3. Wischen Sie die Haut ab und desinfizieren Sie sie mit einer antiseptischen Lösung, die 2 % Chlorhexidingluconat und 70 % Isopropylalkohol enthält.

5. Vorbereitung der dorsalen Haut

1. Machen Sie mit einer scharfen Schere einen 2 mm großen Schnitt in der Mitte des rasierten Bereichs über der Wirbelsäule (Abbildung 1B).
2. Führen Sie kurz eine kleine Pinzette mit stumpfer Kante unter die Haut ein, um eine kleine Unterhauttasche zu bilden, so dass die Kanüle leicht in die Unterhauttasche eingeführt werden kann (Abbildung 1B).
3. Führen Sie eine Naht aus Schritt 3.2 durch die Haut auf jeder Seite des Einschnitts (Abbildung 1C).

6. Einsetzen des Sensors

1. Entfernen Sie den Sensor vollständig von der Sensorhalterung (die Kanüle ist von der Nadel leer) und halten Sie den Sensor mit einer Pinzette fest, um zu verhindern, dass das umgebende Klebeband an sich selbst klebt.
2. Führen Sie die Kanüle vorsichtig in die Unterhauttasche ein.
3. Ziehen Sie die Nähte auf jeder Seite und ziehen Sie sie fest und binden Sie sie, um den Sensor fest zu befestigen und so zu verhindern, dass die Kanüle aus der Unterhauttasche rutscht, wenn sich das Klebeband mit der Zeit löst.

7. Sensorbefestigung und Naht

1. Befestigen Sie den Sensor fest an der Rückseite, indem Sie die inneren Nähte zusammenbinden und das Klebeband verwenden, das den Sensor umgibt.
2. Machen Sie acht diskontinuierliche Nähte um den Sensor herum und befestigen Sie den Rand des Klebebandes des Sensors an der Haut (Abbildung 1D).

8. Freischaltung des Readers

1. Aktivieren Sie nach dem Einsetzen des Sensors das Lesegerät, indem Sie das Lesegerät einschalten, auf Neuen Sensor starten drücken und den Sensor gemäß den Anweisungen des Herstellers durchziehen.
2. Die erste Messung kann nur wenige Minuten nach der Installation des CGM erfolgen. Bei diesem CGM kann die erste Messung nach 60 min erfolgen.

9. Leseergebnisse

1. Platzieren Sie das Lesegerät in der Nähe der Maus (es ist nicht erforderlich, es zu berühren). Alle im Sensor gespeicherten Daten werden an das Lesegerät übertragen.
   HINWEIS: Verschiedene CGM-Geräte können sich im Zeitraum der historischen Datenspeicherkapazität unterscheiden. Bei diesem CGM können zwischen zwei Messwerten maximal 8 h gespeichert werden.

10. Entfernen des Sensors

1. Betäuben Sie die Maus (siehe Abschnitt 2).
2. Schneiden Sie die Nähte, die den Sensor mit der Rückseite der Maus verbinden, mit einer scharfen Schere durch.
3. Entfernen und durchtrennen Sie die Nähte am Einschnitt, indem Sie den Sensor vorsichtig entfernen.
4. Verwenden Sie bei Bedarf eine einzelne Naht, um den Schnitt auf der Rückseite der Maus zu verschließen.

11. Datenanalyse

1. Daten-Download: Laden Sie die Daten gemäß den Anweisungen des CGM-Herstellers herunter.
   HINWEIS: Jedes CGM hat ein anderes Format, das für den Benutzer leicht zugänglich sein kann oder auch nicht. Dies ist ein wichtiger Aspekt bei der Auswahl des CGM.
2. Für die Analyse mit der mitgelieferten Software formatieren Sie die Daten gemäß den Anweisungen in der Readme-Datei auf Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).

Abbildung 1: Befestigung des Sensors an der Maus. (A) Zwei mit roten Pfeilen markierte Nähte werden auf beiden Seiten der Kanüle auf der Unterseite des CGM-Sensors, die durch einen weißen Pfeil gekennzeichnet ist, durch das Sensorband geführt. (B) Ein kleiner 2 mm Schnitt wird in der Mitte des rasierten Bereichs entlang der Wirbelsäule mit einer scharfen Schere gemacht. Kleine Pinzetten mit stumpfem Rand werden kurz unter die Haut eingeführt, um eine kleine Unterhauttasche zu bilden, so dass die Kanüle subkutan eingeführt werden kann. (C) Die gleichen Nähte von A werden subkutan auf jeder Seite des Einschnitts eingeführt. Die roten Pfeile markieren die Nähte, die wie in A am Sensor befestigt sind, die blauen Pfeile markieren die Stelle, an der die Nähte bis zur Haut im Rücken der Maus verlaufen sind, und der schwarze Pfeil zeigt den Schnitt. (D) Nach dem Einsetzen der Kanüle werden die inneren Nähte festgezogen und in der Nähe des Einschnitts gebunden, um das CGM zu sichern. Anschließend wird der Sensor mit der Haut vernäht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Chirurgisches Ergebnis
Es werden Ergebnisse von acht HSD:ICR-Mäusen (im Alter von 8 Wochen) gezeigt, die 18 Wochen lang mit einer fettreichen High-Saccharose-Diät (HFHS) gefüttert wurden, und von fünf mageren HSD:ICR-Mäusen (im Alter von 12 Wochen). Das von uns verwendete Gerät speichert Daten bis zu 8 h. Der Zugang zur örtlichen Tieranlage war auf 07:00-19:00 Uhr beschränkt, so dass die Datenerfassung in den späten Nachmittagsstunden, wenn die Mäuse aktiv sind, verboten war. Die Mäuse wurden daher 7 Tage vor dem chirurgischen Eingriff in einen Raum mit Rückwärtsbeleuchtung gebracht, mit dunklen Stunden zwischen 8:30 und 20:30 Uhr. Dies ist nicht für alle Geräte oder Tiereinrichtungen erforderlich, und wir empfehlen die Verwendung von Geräten, die Informationen länger als 12 Stunden speichern können.

Nach der Operation gab es keine Mortalität. Die Operation führte zu einem Gewichtsverlust von ca. 10% während der Zeit des Experiments (Abbildung 2A). Daher sollten die Messungen, die in den ersten Tagen nach der Operation während der Gewichtsabnahme durchgeführt werden, mit Vorsicht interpretiert werden. Der Gewichtsverlust war nicht darauf zurückzuführen, dass die Mäuse nicht in der Lage waren, nach Futter und Wasser zu greifen. Der Vergleich von CGM-Messungen und Blutzuckermessungen an der Endspitze zeigte eine gute Übereinstimmung im nüchternen und nicht nüchternen Zustand (Abbildung 2B). Das CGM war durchschnittlich 11 Tage aktiv (Abbildung 2C). Die maximale Anzahl von Tagen für diesen Gerätetyp beträgt 14 Tage. Wenn das Gerät früher inaktiv wurde, lag das nicht daran, dass das CGM herunterfiel.

Abbildung 2: Allgemeine Ergebnisse der Anwendung des CGM. (A) Mittlere Gewichtsreduktion während der Zeit, in der das CGM aktiv war. n = 8 Mäuse. (B) Die mittlere Differenz zwischen den Glukosemesswerten des tragbaren Blutzuckermessgeräts und des CGM-Geräts. Der Unterschied unterschied sich nicht signifikant von 0 mg/dl. n = 10 Messwerte in sechs Mäusen. (C) Die mittlere Zeit, in der das CGM in n = 8 Mäusen aktiv war. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Rohausgabe
Die Glukosewerte eines einzelnen Tages werden in einem Diagramm angezeigt, das von der CGM-Software erstellt wurde (Abbildung 3A). Die Daten von einigen Tagen können mit dem bereitgestellten Code angezeigt werden (Abbildung 3B). Wir zeigen Daten von 3 Tagen zur Verdeutlichung.

Abbildung 3: Datenanalyse . (A) Kommerzieller Output. Zwischen 18:00 Uhr und Mitternacht wurden keine Daten erhoben. Der schattierte Bereich zeigt Normoglykämiewerte bei Patienten, die zwischen 70-100 mg/dl liegen. (B) Rohdaten von 3 Tagen mit einer einzigen Maus unter Verwendung des bereitgestellten Codes. Beachten Sie den Skalenunterschied in der y-Achse zwischen A und B. Die Achsenparameter und alle anderen Parameter können im Code moduliert werden. Zur Verdeutlichung werden Daten für 3 Tage angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Analyse
Sobald die Daten extrahiert sind, kann die Analyse mit dem bereitgestellten Code oder einer anderen benutzerdefinierten Software durchgeführt werden. Unten sehen Sie den mittleren (Abbildung 4A,C) und mittleren (Abbildung 4B,D) Glukosespiegel zu jedem Zeitpunkt für eine einzelne Maus. Ein Schiebefenster kann verwendet werden, um den Plot zu glätten. Zur Verdeutlichung werden nur zwei Mäuse gezeigt.

Abbildung 4: Ausgabe der Datenanalyse mit den bereitgestellten Skripten . (A) Mittlere und (B) mittlere Glukosewerte zu jedem Zeitpunkt in einer bestimmten Maus. Der schattierte Bereich gibt die Standardabweichung des Glukosespiegels an. (C) Mittlere und (D) mittlere Glukosespiegel von zwei Mäusen. Zur Verdeutlichung werden nur zwei Mäuse gezeigt. Eine gestrichelte Linie markiert den Übergang von hell (20:30-08:30) zu dunkel (8:30-20:30). Ein Schiebefenster von 20 min wurde genutzt, um die Kurve zu glätten. Die Größe des Fensters und alle Parameter können im Code geändert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.