Visualisierung und Quantifizierung endogener intraorganeller Proteininteraktionen an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen durch Proximity-Ligation-Assays

Vera Filipa Monteiro-Cardoso; Romain Le Bars; Francesca Giordano

doi:10.3791/64750

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Methodenartikel

Visualisierung und Quantifizierung endogener intraorganeller Proteininteraktionen an ER-Mitochondrien-Kontaktstellen durch Proximity-Ligation-Assays

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DOI:

10.3791/64750

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20. Oktober 2023

Vera Filipa Monteiro-Cardoso¹^,² , Romain Le Bars¹^,³ , Francesca Giordano¹^,²

¹Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay, ²Inserm U1280, ³Imagerie-Gif, Light Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Bedarf an neuen Ansätzen zur Untersuchung von Membrankontaktstellen (MCS) ist aufgrund des zunehmenden Interesses an der Untersuchung dieser zellulären Strukturen und ihrer Komponenten gestiegen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das bisher verfügbare Mikroskopietechnologien integriert, um intra- und interorganelle Proteinkomplexe, die sich an MCS befinden, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Membrankontaktstellen (MCS) sind Bereiche mit enger Membrannähe, die den dynamischen Austausch verschiedener Biomoleküle (d. h. Kalzium und Lipide) zwischen den nebeneinander liegenden Organellen ermöglichen und regulieren, ohne dass eine Membranfusion erforderlich ist. MCS sind essentiell für die zelluläre Homöostase, und ihre Funktionen werden durch die residenten Komponenten sichergestellt, die oft als multimere Proteinkomplexe vorliegen. MCS betreffen häufig das endoplasmatische Retikulum (ER), einen wichtigen Ort der Lipidsynthese und der zellulären Kalziumspeicherung, und sind besonders wichtig für Organellen wie die Mitochondrien, die von den klassischen vesikulären Transportwegen ausgeschlossen sind. In den letzten Jahren wurden MCS zwischen dem ER und den Mitochondrien ausgiebig untersucht, da ihre Funktionen den zellulären Stoffwechsel/die Bioenergetik stark beeinflussen. An diesen Kontaktstellen wurden mehrere Proteine identifiziert, darunter Membrankabel, Kalziumkanäle und Lipidtransferproteine, was den Bedarf an neuen Methoden und technischen Ansätzen zur Untersuchung dieser MCS-Komponenten erhöht. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das aus kombinierten technischen Ansätzen besteht, die Proximity-Ligations-Assay (PLA), Mitochondrien-Färbung und 3D-Imaging-Segmentierung umfassen, die den Nachweis von Proteinen ermöglicht, die physikalisch nahe beieinander (>40 nm) sind und sich auf derselben Membran an ER-Mitochondrien-MCS befinden. Zum Beispiel haben wir zwei ER-verankerte Lipidtransferproteine, ORP5 und ORP8, verwendet, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie an ER-Mitochondrien und ER-Plasmamembran-MCS interagieren und lokalisieren. Durch die Assoziation des ORP5-ORP8 PLA mit der Analyse der Zellbildgebungssoftware war es möglich, den Abstand des ORP5-ORP8-Komplexes von der mitochondrialen Oberfläche abzuschätzen und festzustellen, dass etwa 50% der ORP5-ORP8 PLA-Interaktion an ER-Subdomänen in unmittelbarer Nähe der Mitochondrien stattfindet.

Einleitung

Die Kommunikation zwischen den Organellen ist ein wesentliches Merkmal eukaryotischer Zellen. Eine Art und Weise, wie Organellen kommunizieren, ist die Bildung von Membrankontaktstellen (MCSs), bei denen es sich um enge Membranoppositionen zwischen zwei Organellen handelt, die durch strukturelle und funktionelle Proteine wie Haltegurte, Lipidtransferproteine und Kalziumkanäle aufrechterhalten werden¹. MCS können zwischen ähnlichen oder unterschiedlichen Organellen etabliert werden und vermitteln den Austausch zellulärer Komponenten, was für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase wichtig ist. Bisher wurden mehrere MCS identifiziert, dar....