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Methodenartikel

Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

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DOI:

10.3791/64760

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14. April 2023

 ,  , 
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir eine zeitspezifische Methode, um kritische Entwicklungswege in der Plazenta der Maus in vivo effektiv zu manipulieren. Dies geschieht durch die Injektion und Elektroporation von CRISPR-Plasmiden in die Plazenta trächtiger Muttertiere am Embryonaltag 12.5.

Zusammenfassung

Die Plazenta ist ein essentielles Organ, das die Entwicklung von Säugetieren im Mutterleib reguliert und aufrechterhält. Die Plazenta ist verantwortlich für den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zwischen Mutter und Fötus sowie für die Produktion und Abgabe von Wachstumsfaktoren und Hormonen. Plazentare genetische Manipulationen bei Mäusen sind entscheidend für das Verständnis der spezifischen Rolle der Plazenta in der pränatalen Entwicklung. Plazenta-spezifische Cre-exprimierende transgene Mäuse haben eine unterschiedliche Wirksamkeit, und andere Methoden zur Manipulation von Plazenta-Genen können nützliche Alternativen sein. Diese Arbeit beschreibt eine Technik zur direkten Veränderung der plazentaren Genexpression mittels CRISPR-Genmanipulation, mit der die Expression von Zielgenen modifiziert werden kann. Bei einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz werden trächtige Muttertiere am Embryonaltag 12,5 (E12,5) einer Laparotomie unterzogen und ein CRISPR-Plasmid wird durch eine Glasmikropipette in die einzelnen Plazenten eingebracht. Das Plasmid wird sofort nach jeder Injektion elektroporiert. Nach der Wiederherstellung des Muttertiers können sich die Plazenta und die Embryonen bis zur Beurteilung zu einem späteren Zeitpunkt weiterentwickeln. Die Beurteilung der Plazenta und der Nachkommen nach der Anwendung dieser Technik kann die Rolle der zeitspezifischen Plazentafunktion in der Entwicklung bestimmen. Diese Art der Manipulation ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie sich die Genetik und Funktion der Plazenta auf das Wachstum und die Entwicklung des Fötus in verschiedenen Krankheitskontexten auswirkt.

Einleitung

Die Plazenta ist ein wesentliches Organ, das an der Entwicklung des Fötus beteiligt ist. Die Hauptaufgabe der Plazenta besteht darin, wesentliche Faktoren bereitzustellen und den Transfer von Nährstoffen und Abfallstoffen zum und vom Fötus zu regulieren. Die Plazenta von Säugetieren besteht sowohl aus fötalem als auch aus mütterlichem Gewebe, die die Schnittstelle zwischen Fötus und Mutter bilden, und so wirkt sich die Genetik sowohl der Mutter als auch des Fötus auf die Funktionaus 1. Genetische Anomalien oder eine gestörte Funktion der Plazenta können die Entwicklung des Fötus drastisch verändern. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Genetik und Entwicklung der Plazenta mit der veränderten Entwicklung bestimmter Organsysteme beim Fötus verbunden ist. Insbesondere Anomalien in der Plazenta sind mit Veränderungen des fetalen Gehirns, des Herzens und des Gefäßsystems verbunden 2,3,4,5.

Der Transport von Hormonen, Wachstumsfaktoren und anderen Molekülen von der Plazenta zum Fötus spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Fötus6. Es hat sich gezeigt, dass die Veränderung der Plazentaproduktion bestimmter Moleküle die Neuroentwicklung verändern kann. Eine mütterliche Entzündung kann die Produktion von Serotonin erhöhen, indem sie die metabolische Genexpression von Tryptophan (TRP) in der Plazenta verändert, was in der Folge zu einer Anhäufung von Serotonin im fetalen Gehirn führt7. Andere Studien haben neben Herzfehlern auch Plazentaanomalien gefunden. Es wird angenommen, dass Anomalien in der Plazenta zu angeborenen Herzfehlern beitragen, dem häufigsten Geburtsfehler beim Menschen8. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat mehrere Gene identifiziert, die sowohl in der Plazenta als auch im Herzen ähnliche zelluläre Signalwege aufweisen. Wenn diese Signalwege gestört sind, können sie zu Defekten in beiden Organen führen9. Die Defekte in der Plazenta können angeborene Herzfehler verschlimmern. Die Rolle der Plazentagenetik und -funktion bei der Entwicklung spezifischer fetaler Organsysteme ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet.

Mäuse haben hämochoriale Plazenten und andere Merkmale menschlicher Plazenten, was sie zu sehr nützlichen Modellen für die Erforschung menschlicher Krankheiten macht1. Trotz der Bedeutung der Plazenta fehlt es derzeit an gezielten in vivo Genmanipulationen. Darüber hinaus stehen derzeit mehr Optionen für Knockouts oder Knockdowns zur Verfügung als für Überexpressions- oder Gain-of-Function-Manipulationen in der Plazenta10. Es gibt mehrere transgene Cre-exprimierende Linien für plazentaspezifische Manipulationen, jede in verschiedenen Trophoblastenlinien zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Dazu gehören Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER und Gcm1-Cre 11,12,13,14. Obwohl diese Cre-Transgene effizient sind, sind sie möglicherweise nicht in der Lage, einige Gene zu bestimmten Zeitpunkten zu manipulieren. Eine weitere häufig verwendete Methode, um die plazentare Genexpression entweder auszuknocken oder zu überexprimieren, ist die Insertion lentiviraler Vektoren in die Blastozystenkultur, was zu einer trophoblastenspezifischen genetischen Manipulation führt15,16. Diese Technik ermöglicht eine robuste Veränderung der Plazenta-Genexpression in einem frühen Entwicklungsstadium. Die Verwendung von RNA-Interferenz in vivo wurde in der Plazenta nur spärlich genutzt. Die Insertion von shRNA-Plasmiden kann ähnlich wie die in dieser Arbeit beschriebene CRIPSR-Technik durchgeführt werden. Dies wurde bei E13.5 durchgeführt, um die PlGF-Expression in der Plazenta erfolgreich zu verringern, mit Auswirkungen auf das Gehirnsystem der Nachkommen17.

Zusätzlich zu Techniken, die in erster Linie für Knockout oder Knockdown verwendet werden, wird die Induktion einer Überexpression häufig mit Adenoviren oder der Insertion eines exogenen Proteins durchgeführt. Die Techniken, die für die Überexpression verwendet werden, haben unterschiedliche Erfolgsraten und wurden meist später in der Trächtigkeit durchgeführt. Um die Rolle des insulinähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) in der Plazentafunktion zu untersuchen, wurde ein adenoviral vermittelter Plazenta-Gentransfer durchgeführt, um die Überexpression des IGF-1-Gens zu induzieren18,19. Dies wurde spät in der Trächtigkeit der Maus auf E18.5 mittels direkter Plazentainjektion durchgeführt. Um zusätzliche Optionen bereitzustellen und mögliche Misserfolge etablierter plazentagenetischer Manipulationen, wie z. B. Cre-Lox-Kombinationsfehler, die mögliche Toxizität von Adenoviren und die Off-Target-Effekte von shRNA, zu umgehen, kann in vivo die direkte CRISPR-Manipulation der Plazenta verwendet werden20,21,22. Dieses Modell wurde entwickelt, um das Fehlen von Überexpressionsmodellen zu beheben und ein Modell mit Flexibilität zu erstellen.

Diese Technik basiert auf der Arbeit von Lecuyer et al., in der shRNA- und CRISPR-Plasmide direkt in vivo auf die Plazenta der Maus gerichtet wurden, um die PlGF-Expression zu verändern 17. Diese Technik kann verwendet werden, um die Plazenta-Genexpression durch CRISPR-Manipulation zu mehreren Zeitpunkten direkt zu verändern. für diese Arbeit wurde E12.5 ausgewählt. Die Plazenta ist zu diesem Zeitpunkt gereift und groß genug, um sie zu manipulieren, was die Insertion eines spezifischen CRISPR-Plasmids auf E12.5 ermöglicht, was einen erheblichen Einfluss auf die fetale Entwicklung von der mittleren bis zur späten Schwangerschaft haben kann23,24. Im Gegensatz zu transgenen Ansätzen, aber ähnlich wie bei viralen Induktionen oder RNA-Interferenzen, ermöglicht diese Technik eine Überexpression oder einen Knockout zu bestimmten Zeitpunkten mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz, wodurch eine mögliche Beeinträchtigung der Plazentation oder embryonale Letalität durch frühere Veränderungen vermieden wird. Da nur wenige Plazenten das Versuchs- oder Kontrollplasmid innerhalb eines Wurfes erhalten, erlaubt der Ansatz zwei Arten von internen Kontrollen. Bei diesen Kontrollen handelt es sich um solche, die mit dem entsprechenden Kontrollplasmid injiziert und elektroporiert werden, und solche, die keine direkte Manipulation erhalten. Diese Technik wurde optimiert, um eine Überexpression des IGF-1-Gens in der Mausplazenta über ein synergistisches Aktivierungsmediator (SAM) CRISPR-Plasmid zu erzeugen. Die Wahl fiel auf das IGF-1-Gen, da es sich bei IGF-1 um ein essentielles Wachstumshormon handelt, das dem Fötus zugeführt wird und vor der Geburt hauptsächlich in der Plazenta produziert wird25,26. Diese neue, auf die Plazenta ausgerichtete CRISPR-Technik wird eine direkte Manipulation ermöglichen, um den Zusammenhang zwischen Plazentafunktion und fetaler Entwicklung zu definieren.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Bundesvorschriften und den Richtlinien der University of Iowa durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Tiere und Haltung

  1. Halten Sie die Tiere in einem 12-stündigen Tageslichtzyklus mit Futter und Wasser ad libitum.
  2. Verwenden Sie weibliche CD-1-Mäuse im Alter von 8-15 Wochen. Verwenden Sie das Vorhandensein eines Kopulationspfropfens, um E0.5 zu identifizieren.
  3. Auf E0.5 werden die trächtigen Mütter einzeln untergebracht.

2. Kalibrierung der Mikropipette

HINWEIS: Die Kalibrierung der Mikropipette sollte nach Möglichkeit vor der Operation durchgeführt werden.

  1. Vor der Herstellung und Kalibrierung der Mikropipette werden alle Plasmide auf die empfohlene Konzentration (0,1 μg/μl) in DNasefreiem Wasser verdünnt. Mischen Sie das Plasmid mit entsprechend verdünntem Fast Green-Farbstoff (1 μg/μl in PBS) (endgültige Plasmidkonzentration: 0,06 μg/μl).
  2. Ziehen Sie Mikropipetten mit 10 cm Glaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 0,86 mm mit einem Mikropipettenzieher.
  3. Brechen Sie die Spitze einer Mikropipette (2-3 mm) vorsichtig mit einer sterilen Pinzette ab.
  4. Füllen Sie die Mikropipette in eine Mikrokapillarspitze, die an einem Mikroinjektor befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass der Mikroinjektor an der Mikroinjektionsmaschine angebracht ist und dass genügend Stickstoff vorhanden ist, um die Mikropipette zu kalibrieren.
  5. Sobald die Mikropipette am Mikroinjektor befestigt ist, beladen Sie sie mit der Fast Green-Farbstofflösung, um die Kalibrierung durchzuführen (1 μg/μl in PBS). Kalibrieren Sie die Mikropipette, um ein Volumen von ca. 3,5 μl zu injizieren. Entleeren ("reinigen") Sie die Mikropipette, um die Beladung der Plasmidlösungen wie folgt vorzubereiten.
    Anmerkungen: Jede Mikropipette ist etwas anders. Um eine Schädigung der Plazenta während der Injektion zu vermeiden, sollte die Injektionszeit zwischen 0,5-1,5 s eingestellt werden. Der Druck sollte zwischen 1 und 8,5 psi eingestellt werden. Kalibrieren Sie jede Mikropipette separat. Wenn die Mikropipette nicht innerhalb dieser Parameter kalibriert werden kann, sollte sie nicht verwendet werden.

3. Chirurgie (Abbildung 1A)

Anmerkungen: Reinigen Sie zur Vorbereitung die Oberflächen sowohl des Präparations- als auch des Operationsbereichs mit 70 % Ethanol. Legen Sie eine saugfähige Unterlage in den Vorbereitungsbereich. Legen Sie im Operationsbereich ein Heizkissen ab und legen Sie dann eine saugfähige Unterlage darauf. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge vor der Operation. Die Zeit, in der der Damm unter Narkose steht, sollte unter 1 Stunde liegen.

  1. Betäubung
    1. Verabreichen Sie dem trächtigen Muttertier 30 Minuten bis 1 Stunde vor der Operation 5 mg/kg NSAR (Meloxicam) oder ein anderes zugelassenes Analgetikum.
    2. Legen Sie die trächtige Mutter in eine Induktionskammer, die an einem Isofluran-Verdampfer befestigt ist.
    3. Stellen Sie den Verdampfer auf 4% Isofluran und 3,5 l/min Sauerstoff ein.
    4. Sobald die Anästhesie durch das Ausbleiben des Ansprechens auf ein Zehenzwicken und eine reduzierte Atemfrequenz bestätigt wurde, entfernen Sie den Damm aus der Induktionskammer in den Präparationsbereich.
  2. Vorbereitung auf die Operation
    1. Legen Sie den Damm in Rückenlage mit einem Nasenkegel in den Vorbereitungsbereich.
    2. Reduzieren Sie den Verdampfer auf 2% Isofluran und 3,5 l/min Sauerstoff, während sich der Damm im Nasenkegel befindet.
    3. Rasieren Sie den Bauch des Muttertiers gründlich und entfernen Sie überschüssiges Fell. Beschichten Sie den rasierten Bauch abwechselnd dreimal mit Povidon-Lösung und 70%igem Ethanol mit sterilen Applikatoren mit Wattespitze. Tragen Sie die letzte Schicht Povidon-Lösung auf. Um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern, tragen Sie künstliches Tränengel auf beide Augen des Muttertiers auf (Abbildung 2A, B).
    4. Bewegen Sie nach der Präparation den Damm mit dem Nasenkegel in den dafür vorgesehenen Operationsbereich.
  3. Uterus Laparotomie
    Anmerkungen: Verwenden Sie während des gesamten chirurgischen Eingriffs sterile Handschuhe. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche berührt wird.
    1. Legen Sie im Operationsbereich den Damm in Rückenlage und befestigen Sie den Nasenkegel mit Klebeband. Stellen Sie das Heizkissen unter dem saugfähigen Pad auf 45 °C ein.
    2. Machen Sie mit einer Pinzette und einer Schere einen ca. 2 cm langen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut zu spannen, und machen Sie einen vertikalen Schnitt in die Haut. Machen Sie danach einen weiteren ähnlich großen Schnitt durch das Bauchfell, um die Gebärmutterhörner freizulegen. Zelten Sie das Bauchfell mit einer Pinzette, während Sie den vertikalen Schnitt machen (Abbildung 2C, D).
      HINWEIS: Wenn das Bauchfell nicht richtig eingeschnitten wird, kann dies zu einem tödlichen Einschnitt des Darms führen.
    3. Massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft durch den Schnitt, indem Sie auf die Seiten des Bauches drücken. Führen Sie dazu die Gebärmutter vorsichtig und ohne Hilfsmittel und nur mit den Fingern, um versehentliche Verletzungen zu vermeiden. Legen Sie den freiliegenden Uterus auf ein steriles OP-Tuch, das den Bauch des Damms bedeckt, und halten Sie es während der gesamten Operation mit Tropfen steriler Kochsalzlösung feucht, die vor der Anwendung bei Bedarf auf 30 °C erwärmt werden kann (Abbildung 2E, F).
      ANMERKUNG: Die Uterushörner können wie in Wang et al.27 beschrieben identifiziert werden.
    4. Sobald die Gebärmutter freigelegt ist, wählen Sie drei Plazentapaare zur Manipulation aus.
      HINWEIS: Die Plazenta können wie von Elmore et al.24 beschrieben identifiziert werden. Um das Überleben der Embryonen zu maximieren, sollten nicht mehr als 6 Plazenten behandelt werden. Wenn weniger als 12 Embryonen vorhanden sind, sollten nicht mehr als 4 Plazenten injiziert werden. Wählen Sie zwei benachbarte Plazenten aus, so dass eine eine Kontrollinjektion und die andere das experimentelle Plasmid erhält. Die Verwendung von zwei benachbarten Plazenten ermöglicht einen besseren Vergleich von Plazenten an ähnlichen Stellen in der Gebärmutter und ermöglicht auch eine erhöhte Überlebensrate. Die ausgewählten Plazentapaare werden zufällig ausgewählt und in beiden Uterushörnern verteilt (Abbildung 1B).
    5. Zeichnen Sie die Lage der Plazentamanipulationen und die Organisation der Embryonen in den Uterushörnern auf, damit die Embryonen und Plazenten während der Entnahme identifiziert werden können, da ein Damm sowohl Kontroll- als auch experimentell behandelte Plazenten/Embryonen trägt.
  4. Plazentainjektion und Elektroporation des Kontrollplasmids
    Anmerkungen: Um eine aseptische Technik beizubehalten, sterilisieren Sie die Elektroporationspaddel und den Mikroinjektor vor dem Gebrauch mit einem kalten Sterilisationsmittel. Wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine unsterile Oberfläche berührt wird.
    1. Laden Sie mit der kalibrierten Mikropipette eine ausreichende Menge des entsprechenden Kontrollplasmids für drei Injektionen. Führen Sie alle Injektionen in einer Tiefe von ~0,5 mm seitlich in die Plazenta zwischen der Dezidua (weiß) und der Verbindungszone (dunkelrot) durch (Abbildung 3A-F).
    2. Führen Sie Injektionen in die drei Kontrollplazenten durch.
      Anmerkungen: Führen Sie alle Kontrollplasmidinjektionen vor den experimentellen Injektionen durch, um eine Kreuzkontamination der Plasmide mit der Mikropipette zu vermeiden. Auf diese Weise kann dieselbe Mikropipette verwendet werden, da der Wechsel der Mikropipetten und der Kalibrierzeit die Operationszeit drastisch verlängert und das Überleben des Muttertiers verringert.
    3. Führen Sie die Elektroporation der mit Kontrollplasmid injizierten Plazenten innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion durch.
    4. Verwenden Sie für die Elektroporation ein Paar 3-mm-Paddel, die an einer Elektroporationsmaschine befestigt sind. Um die Effizienz der CRISPR-Inkorporation und die Lebensfähigkeit von Embryonen zu gewährleisten, verwenden Sie die folgenden Elektroporationseinstellungen: 2 Impulse, 30 V, 30 ms Impuls, 970 ms Impuls aus, unipolar.
    5. Nach der Injektion, aber unmittelbar vor der Elektroporation, beschichten Sie die Kontaktstellen mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette oder Spritze genau auf die drei Stellen der Gebärmutterwand und der Paddel auf.
    6. Drücken Sie die Elektroporationspaddel vorsichtig auf die seitlichen Seiten der Plazenta. Platzieren Sie das Anodenpaddel über der Injektionsstelle und der Kathode direkt gegenüber (Abbildung 4A-C).
    7. Drücken Sie den Impuls an der Elektroporationsmaschine und warten Sie, bis die beiden Impulse abgeschlossen sind, bevor Sie die Elektroporationspaddel entfernen.
      Anmerkungen: Während des Pulses ist oft eine kleine Menge weißer Schaum zwischen den Paddeln und der Plazenta zu sehen. Wenn dies nicht der Fall ist, überprüfen Sie vor dem weiteren Gebrauch die Spannung der Paddel mit einem Voltmeter. Wenn der Messwert auf dem Voltmeter nicht mit der eingestellten Elektroporationsspannung übereinstimmt, sind die Paddel nicht funktionsfähig.
  5. Plazentainjektion und Elektroporation des experimentellen Plasmids
    1. Befolgen Sie die gleichen Anweisungen wie in Schritt 3.4.1. zu Schritt 3.4.2. Verwendung des experimentellen Plasmids anstelle des Kontrollplasmids.
    2. Führen Sie die Elektroporation aller drei experimentell injizierten Plazenten innerhalb von 2 Minuten nach der Injektion durch. Dies sollte auf die gleiche Weise durchgeführt werden wie bei denen, die mit den Kontrollplasmiden injiziert werden. Befolgen Sie Schritt 3.4.4. zu Schritt 3.4.7.
  6. Abschluss der Operation
    1. Sobald die Plazentamanipulation abgeschlossen ist, massieren Sie die Gebärmutterhörner sanft nur mit den Fingern zurück in die Bauchhöhle (Abbildung 5A).
    2. Führen Sie zunächst doppelt geknotete Einzelnähte auf der Peritoneumschicht mit beschichteten und geflochtenen auflösbaren Nähten von 45 cm Länge mit einer 13 mm 3/8c-Nadellegierung durch. Abstand zwischen den Nähten 2-3 mm (Abbildung 5B).
    3. Nachdem Sie die Bauchfellschicht vernäht haben, vernähen Sie die Haut mit auflösbaren Nähten. Verknoten Sie die einzelnen Nähte im Abstand von 2-3 mm dreifach, um sicherzustellen, dass der Damm die Naht nicht lösen kann (Abbildung 5C).
    4. Sobald die Naht abgeschlossen ist, stellen Sie das Isofluran auf 1 % und den Sauerstoffgehalt auf 3,5 l/min ein und tragen Sie Gewebekleber auf die Nähte auf der Haut auf (Abbildung 5D).
      Anmerkungen: Gewebekleber ist optional, wird aber empfohlen, um ein erneutes Öffnen des Einschnitts durch Kauen des Damms zu verhindern.
    5. Wenn der Gewebekleber getrocknet ist, schalten Sie den Verdampfer aus und entfernen Sie den Damm aus dem Operationsbereich. Legen Sie den Damm in einen stützenden Käfig auf den Rücken.

4. Nachsorge und Überwachung

  1. Lassen Sie die trächtige Mutter mindestens 30 Minuten lang in einem sauberen Käfig unter Aufsicht genesen, um sicherzustellen, dass keine unmittelbaren Komplikationen der Operation auftreten. Beobachten Sie, bis es vollständig gehfähig ist und ohne Hilfe auf die Füße springen kann. Einzelne Unterbringung des Damms nach der Operation.
  2. Verfolgen Sie die institutionelle postoperative Betreuung und Überwachung bis zur Embryonenentnahme. Notieren Sie das Gewicht des Damms und überwachen Sie täglich die Nähte und die Inzisionsstelle.

5. E14.5 Plazentaentnahme

  1. Bei E14.5 wird der Damm mit einem Ketamin/Xylazin-Cocktail (1 mg/ml Ketamin und 0,1 mg/ml Xylazin) tief betäubt und anschließend zervikal disloziert.
  2. Machen Sie mit einer Schere einen V-förmigen Schnitt in den Bauch des Damms und entfernen Sie die Gebärmutter. Sofort auf eine 5 cm Petrischale auf Eis stellen. Mit einer Pinzette wird der Embryo und die dazugehörige Plazenta vorsichtig aus der Gebärmutter entfernt.
    HINWEIS: Zeichnen Sie die Position des Embryos und die entsprechende Plazenta in den Gebärmutterhörnern auf, um festzustellen, welcher Embryo während der Operation direkt manipuliert wurde.
  3. Notieren Sie die Plazentagewichte. Schneiden Sie die Plazenta mit einer RNAse-freien Pinzette und einem Rasierer entlang der Mittellinie in zwei Hälften. Eine Hälfte in 4%iges PFA bei 4 °C geben. Schneiden Sie die restliche Hälfte wieder in zwei Hälften und lagern Sie die restlichen zwei Viertel bei −80 °C in zwei Röhrchen, eines davon mit RNA-Speicherreagenz.
    HINWEIS: Embryonen und anderes mütterliches Gewebe können aus der Sammlung bei −80 °C für die zukünftige Verwendung gelagert werden.

6. Analyse der Genexpression der Plazenta

  1. Verwenden Sie das Viertel der Plazenta, das bei −80 °C in einem RNA-Speicherreagenz gelagert wird.
  2. Verarbeiten Sie die Plazenten für die qPCR, wie in Elser et al. beschrieben, unter Verwendung der Trizol-Methode zur RNA-Isolierung, eines Spektralphotometers für die RNA-Konzentration, eines cDNA-Synthesekits und der qPCR mit SYBR Green Master Mix28. Verwenden Sie anstelle der Turbo-DNAfree-Kit-DNAse, auf die in Elser et al. verwiesen wird, nach der Trizol-RNA-Isolierung ein RNAcleanup-Kit, um sicherzustellen, dass die Proben keine Verunreinigungenenthalten 28.
    HINWEIS: Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (MSDS) für Trizol und verwenden Sie es in einem chemischen Abzug.
  3. Beurteilen Sie die Plasmidinsertion des Kontrollplasmids mit GFP-Primern und des experimentellen Plasmids mit BLAST-Primern (Primer in Ergänzungstabelle 1). Verwenden Sie den CT-Wert, um das Vorhandensein des Plasmids zu bestimmen.
    HINWEIS: CT-Werte über 35 sind falsch positive Ergebnisse, und nur solche unter 35 sollten als positiver Indikator dafür angesehen werden, dass das Plasmid erfolgreich eingesetzt wurde.
  4. Die IGF-1-Plazentaexpression, die auf das Housekeeping-Gen 18s normalisiert ist, wird beurteilt (Primer sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt). Verwenden Sie die ddCT-Methode, um die Faltungsänderung zu berechnen, und berechnen Sie dann die normalisierte Faltungsänderung der experimentellen Stichproben auf die mittlere Faltungsänderung der Kontrollstichproben.

7. Analyse des Plazentaproteinspiegels

  1. Verwenden Sie das Viertel der Plazenta, das bei −80 °C gelagert wurde. Das Gewebe wird in einer Pufferlösung aus 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl2 und 10 mM Proteaseinhibitor indiH2O mit einem End-pH-Wert von7,4 homogenisiert. Verwenden Sie einen Handhomogenisator und einen Stößel, um das Gewebe aufzubrechen.
    Anmerkungen: Die Probe sollte 10 % des Volumens des Puffers nicht überschreiten.
  2. Verdünnen Sie die homogenisierten Proben im Puffer im Verhältnis 1:12, so dass sie sich im nachweisbaren Bereich eines Bicinchoninsäure-Assay-Kits (BCA) befinden. Führen Sie den BCA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und quantifizieren Sie das Gesamtprotein mit einem Plattenlesegerät.
  3. Nach der Durchführung des BCA-Assays werden alle Proben für den IGF-1-ELISA auf die gleiche Gesamtproteinkonzentration von 2 mg/ml normalisiert, wie dies in Gumusoglu et al.29 der Fall war.
  4. Führen Sie den IGF-1-ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und quantifizieren Sie die IGF-1-Proteinspiegel mit einem Plattenlesegerät unter Verwendung einer Standardkonzentrationskurve.

8. Räumliche CRIPSR-Verifikation mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmarkierung

  1. Nachdem die Plazentahälften 1-3 Tage lang in 4%igem PFA bei 4 °C fixiert wurden, werden sie in 20%ige Saccharose bei 4 °C eingeschoben, bevor sie in optimaler Schnitttemperatur (OCT) eingefroren werden.
  2. Die in OCT eingebetteten Plazentahälften werden in einem −20 °C-Kryostaten seriell in 10-μm-Schnitte geschnitten und auf Objektträger gelegt, um sie zu beschriften. Schneiden Sie die Plazentahälften so, dass alle drei Teilregionen sichtbar sind. Lagern Sie die Objektträger bei −80 °C, bis sie für die In-situ-Hybridisierung verwendet werden.
  3. Führen Sie eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmarkierung (FISH) gemäß den Protokollen des Herstellers durch. Hybridisieren Sie einen Objektträger mit einer dCas9-3xNLS-VP64-Sonde und einen zweiten "Schwester"-Objektträger der gleichen Plazenta mit einer Prl8a8-Sonde.
    HINWEIS: Die Sonde dCas9-3xNLS-VP64 detektiert das Vorhandensein des Überexpressionsplasmids. Die Prl8a8-Sonde hebt Spongiotrophoblasten der Junktionszone hervor, wodurch die Subregionen der Plazenta identifiziert werden können. Diese beiden Sonden sind auf separaten "Schwester"-Objektträgern beschriftet, um eine Interferenz der Mehrkanalfluoreszenz mit der grünen Autofluoreszenz in der Plazenta zu vermeiden.
  4. Beschriften Sie beide Sonden mit dem Detektionsfarbstoff (Opal 620). Nachdem Sie das Protokoll des Herstellers für FISH ausgefüllt haben, tragen Sie DAPI-Eindeckmedium auf und legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger. Versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack.
  5. Stellen Sie die Objektträger auf einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop dar und verarbeiten Sie sie mit einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware. Hier kam die Software CellSens zum Einsatz.

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Ergebnisse

Allgemeine Behandlungsergebnisse (Abbildung 6)
In der Studie gab es drei manipulierte Gruppen. Dazu gehörten Plazenten, die mit einem allgemeinen CRISPR-Cas9-Kontrollplasmid (Cas9-Kontrolle), einem CRISPR-Plasmid zur Aktivierungskontrolle (Act Control) oder einem IGF-1-SAM-Aktivierungsplasmid (Igf1-OE) injiziert wurden. Die Cas9-Kontrolle ist besser für Knockout-Plasmide geeignet, und die Aktivierungskontrolle ist besser für Überexpressions-/Akti...

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Diskussion

Die Plazenta ist ein primärer Regulator des fetalen Wachstums, und wie bereits erwähnt, können Veränderungen in der Genexpression oder -funktion der Plazenta die Entwicklung des Fötus erheblich beeinflussen6. Das hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine gezielte in vivo CRISPR-Manipulation der Mausplazenta mit einem relativ fortschrittlichen chirurgischen Ansatz durchzuführen. Diese Technik ermöglicht eine signifikante Ausbeute an lebensfähigen Embryonen und den entsprec...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren nennen die folgenden Finanzierungsquellen: R01 MH122435, NIH T32GM008629 und NIH T32GM145441. Die Autoren danken den Labors von Dr. Val Sheffield und Dr. Calvin Carter an der University of Iowa für die Nutzung ihres Operationsraums und ihrer Ausrüstung sowie Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan und Dr. Matthew Weber für ihre Unterstützung bei der Mikroskopie. Die Autoren danken auch Dr. Sara Maurer, Maya Evans und Sreelekha Kundu für ihre Unterstützung bei den Pilotoperationen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 ml RöhrchenUSA Scientific Inc1615-5500
4% Paraformeldhyd (PFA) in PBSThermo Fisher ScientificJ61899.
96 Well PlateCornings3598Für BCA-Kit
Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-62
Activation Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-437275Dnasefreies Wasser zur Verdünnung bereitgestellt
AMV Reverse TranskriptaseNew England BiolabsM0277LVerwendung für die cDNA-Synthese
Anästhetikum GasverdampferVetamacVAD-601TTVAD-kompakter Verdampfer
Künstliches TränengelAkornNDC 59399-162-35
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227Proteinquantifizierung
BiovortexerBellco Glass, Inc.198050000Handheld-Gewebehomogenisator
CellSens SoftwareOlympusV4.1.1Bildverarbeitung für FISH-Bilder.
Zentrifuge 5810EppendorfEP022628168Plattenzentrifuge
ChloroformThermo Fisher ScientificJ67241-APRNA-Isolierung
Applikatoren mit WattespitzeProAdvantage77100Vor Gebrauch sterilisieren
CRISPR/Cas9 Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-418922Dnasefreies Wasser zur Verdünnung
bereitgestellt CryoStatLeicaCM1950
DissektionsmikroskopLeicaM125 CWird für die Bildgebung nach der Nekroskopie
verwendet Auflösbare NähteMed Vet InternationalJ385H
Destilliertes WasserGibco15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung (DPBS)Thermofisher Scientific14190144(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Elektro-Elektroporator (Elektroporationsgerät)BTX Harvard Apparatus45-0662Nur Generator
ElektrorasiererWahlCL9990Kent Scientific
Elektroporationspaddel/PinzettenBTX Harvard Apparatus45-0487Paddel mit 3 mm Durchmesser; Drähte enthalten
Einbettkassette: 250 PKGrainger21RK94Plazenta-Einbettkassetten
EthanolThermo Fisher Scientific268280010
F-Air KanisterPenn Veterinary Supply IncBIC80120Überschüssiger Isofluranfilter
Fast Green Dye FCFSigmaF7252-5GAuflösen auf 1 μ g/ml und Filter; Schutz vor Licht
Mikrotiterplatten-Photometer (Plattenleser) auf FilterbasisFisherScientific14377576Kann für BCA- und ELISA-Pinzetten
verwendet werden VWR82027-386Feine Spitzen, gerade, gezackt
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%Sigma AldrichHT501128
Glas Kapillaren - Borosilikatglas (Mikropipette)Sutter InstrumentB150-86-10Außendurchmesser: 1,5 mm, Innendurchmesser: 0,86 mm, 10 cm Länge
Halt Protease- und Phosphotase-Inhibitor-Cocktail (100x)Thermo Scientific1861281Proteinhomogenisierungspuffer
HeizkissenThermotechS766DDigitales feuchtes Heizkissen
HämostatenVWR10806-188Vollständig umrandeter Kiefer;
gebogenes HeißwasserbadFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)Santa Cruz Biotechnologysc-421056-ACTDnasefreies Wasser zur Verdünnung bereitgestellt
InduktionskammerVetamac941443Keine spezifische Litergröße erforderlich
IsofluranPiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
Isoproponal/2-ProponalFisher ScientificA451-4RNA-Isolierung
Ketamin HCl 100mg/mlAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum ChloridSigma Aldrich63069-100ML1M. Protein-Homogenisierungspuffer
MicroAmp™ Optische 384-Well-Reaktionsplatte mit BarcodeFisher Scientific4309849Barcode-Platten nicht erforderlich
MikrokapillarspitzeEppendorf5196082001Befestigung am BTX Microinjector
MicroinjectorBTX Harvard Apparatus45-0766Pipettenhalter aus Edelstahl, 130 mm Länge, für 1 bis 1,5 mm Pipetten
Microject 1000A (Injektionsmaschine)BTX Harvard Apparatur45-0751MicroJect 1000A Plus System
Mikropipettenabzieher Modell P-97Sutter InstrumentP-97/Brauner Mikropipettenabzieher
Mikroplattenmischer (Plattenschüttler)scilogex822000049999
Maus/Ratte IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA KitR & D SystemsMG100
NadelnBD - Becton, Dickson, and Company30510630 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm)
StickstofftankLinde7727-37-9Jedes innere Gas
Nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament (NSAID)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10Analesgisch wie Meloxicam
NasenkonusVetamac9216099-14 mm
Opal 620 DetektionsfarbstoffAkoya BiosciencesSKU FP1495001KTVerwendet für FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) CompoundSakura4583
SauerstofftankLinde7782 - 44 - 7Medizinischer Sauerstoff
StößelUSA Scientific Inc14155390
Povidon-Jod-Lösung, 5%Avrio Health L.P.NDC 67618-155-16
Stromversorgung SYBR&Handel; Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659Verwendung für qPCR
Random Hexamer (Random Primers)New England BiolabsS1330SVerwendung für die cDNA-Synthese
Razor BladeGrainger26X080
RNA Cleanup Kit & KonzentratorZymo ResearchR1013
RNALaterThermo Fisher ScientificAM7021
RNAscope kit v.2.5Advanced Cells Diagnostics323100Enthält alle Reagenzien, die für die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung erforderlich sind. Sonden sind separat erhältlich.
RNAscope&Handel; Sonde - MM-PRL8A8-C2Erweiterte Zelldiagnostik  528641-C2
RNAscope & Handel Sonde - Vector-dCas9-3xNLS-VP64Erweiterte Zelldiagnostik527421
Roto-Therm MiniBenchmarkR2020Trockenofen für In-situ-Hybridisierung
SchereVWR82027-578Präparierschere, scharfe Spitze, 4¹/?
Natriumchlorid (Kochsalzlösung)HospraNDC 0409-4888-03steril,  0,9%
Natriumcitrat, Trinatriumsalz, Dihydrat, [Zitronensäure, Trinatriumdihydrat]Research Product International03-04-6132
Natriumhydroxid 1N-Konzentrat, Fisher ChemicalFisher ScientificSS277Proteinhomogenisierungspuffer
DampfgarerBellaB00DPX8UBA
Steriles OP-AbdecktuchBusse696Vor Gebrauch sterilisieren
Superfrost Plus ObjektträgerFisher Scientific12-550-15
Surgipath Deckglas 24x60Leica3800160
SpritzenBD - Becton, Dickson and Company309659BD Luer Slip Tip Spritze steril, Einmalgebrauch, 1 mL
Thermo Scientific&Handel; Invitrogen&Handel; Nanodrop&Handel; Ein Spektralphotometer mit WiFi und Qubit™ 4 FluorometerFisher Scientific13-400-525Diese Konfiguration wird mit dem Qubit 4 Fluorometer geliefert. Qubit-Quantifizierung nicht erforderlich.
Gewebekleber3M1469SBVetBond
Tris HClThermo Fisher Scientific155680251M. Protein-Homogenisierungspuffer
TRIzol™ ReagenzThermo Fisher Scientific15596018 RNA-Isolierung
TSA Buffer PackAdvanced Cells Diagnostics322810Wird zur Verdünnung des Nachweisfarbstoffs Opal 620
verwendet Universal F-CircuitVetamac40200Wird an Vaporizer und Vaporizer-Zubehör befestigt
Aufrechte Verbindung FluoreszenzmikroskopOlympusBX61VSWird für die FISH-Bildgebung verwendet
Vectorshield mit DAPIVector LaboratoriesH-1200Deckglas Eindeckglas Eindeckmedium
ViiA™ 7 Real-Time PCR System mit 384-Well BlockThermo Fisher Scientific4453536Dies ist für die Detektion von SYBR 384-Well-Blöcken. TaqMan und/oder kleinere Blöcke erhältlich
Wet n Wild Nagellack Wild Shine, Clear Nail Protector, NagelfarbeAmazonC450B
Xylazine 20mg/mlAnased343730_RX
APfür Flammender

Referenzen

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