Bildgestützte optische Kohärenztomographie zur Beurteilung struktureller Veränderungen der Netzhaut von Nagetieren

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verfahren der Datenerhebung und Datenanalyse für die bildgesteuerte optische Kohärenztomographie (OCT) und demonstriert deren Anwendung in mehreren Nagetiermodellen von Augenerkrankungen.

Zusammenfassung

Augenerkrankungen wie die altersbedingte Makuladegeneration, das Glaukom, die Retinitis pigmentosa und die Uveitis gehen immer mit strukturellen Veränderungen der Netzhaut einher. Diese Erkrankungen, die den Fundus betreffen, weisen immer typische Anomalien bei bestimmten Zelltypen der Netzhaut auf, darunter Photorezeptorzellen, retinale Ganglienzellen, Zellen in den retinalen Blutgefäßen und Zellen in den Aderhautgefäßzellen. Nicht-invasive, hocheffiziente und anpassungsfähige bildgebende Verfahren sind sowohl für die klinische Praxis als auch für die Grundlagenforschung erforderlich. Die bildgesteuerte optische Kohärenztomographie (OCT) erfüllt diese Anforderungen, da sie Fundusfotografie und hochauflösende OCT kombiniert und so eine genaue Diagnose von winzigen Läsionen sowie wichtigen Veränderungen in der Netzhautarchitektur ermöglicht. Diese Studie beschreibt die Verfahren der Datenerfassung und Datenanalyse für die bildgesteuerte OCT und demonstriert ihre Anwendung in Nagetiermodellen der choroidalen Neovaskularisation (CNV), der Sehnervenquetschung (ONC), der lichtinduzierten Netzhautdegeneration und der experimentellen Autoimmun-Uveitis (EAU). Diese Technik hilft Forschern im Augenfeld, strukturelle Veränderungen der Netzhaut von Nagetieren bequem, zuverlässig und nachvollziehbar zu identifizieren.

Einleitung

Augenerkrankungen, die den Augenhintergrund betreffen, weisen immer typische Anomalien bei bestimmten Zelltypen der Netzhaut auf, wie z. B. bei Photorezeptorzellen, retinalen Ganglienzellen, Zellen in den retinalen Blutgefäßen und Zellen in den choroidalen Blutgefäßen, die in der Folge die Sehschärfe der Patienten beeinflussen können¹. Um irreversible Sehstörungen zu vermeiden, sind rechtzeitige Diagnosen und geeignete Behandlungen erforderlich¹. Die optische Kohärenztomographie (OCT) wird in der Klinik häufig eingesetzt, um eine Reihe von Augenerkrankungen zu beurteilen, darunter altersbedingte Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Glaukom, Uveitis und Netzhautablösung,^{unter anderem 2,3,4}. Diese Art von nicht-invasiver, hocheffizienter und anpassungsfähiger Bildgebungstechnik wird auch für die rechtzeitige Beurteilung der Krankheitszustände bei Versuchstieren benötigt 5,6,7,8,9,10.

Bei der bildgesteuerten optischen Kohärenztomographie (OCT) werden mittels Interferometrie Schnittbilder der Netzhaut von Tieren mit einer Längsauflösung von 1,8 μm und einer axialen Auflösung von 2 μm erstellt. Es hat mindestens drei Vorteile bei der Untersuchung von Veränderungen der Netzhautarchitektur 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Erstens handelt es sich um eine nicht-invasive Technik, die es Forschern ermöglicht, den interessierenden Ort in der Netzhaut desselben Tieres dynamisch zu verfolgen 5,6,7,8,9,10. Zweitens reduziert dieses Merkmal die Stichprobengröße für jedes Experiment erheblich³. Gleichzeitig spart es erheblich Zeit und Mühe bei den Forschungsprojekten 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Drittens erfasst die bildgesteuerte OCT bei der Aufnahme von OCT-Bildern farbige Fundusbilder und liefert so genaue und zuverlässige Ergebnisse für die Benutzer.

Dieses Manuskript beschreibt die Verfahren der Bilderfassung und Datenanalyse für die bildgesteuerte OCT und erläutert deren Anwendung in Maus- und Rattenmodellen der choroidalen Neovaskularisation (CNV)^11,12, der Quetschung des Sehnervs (ONC)^13,14,15,16, der lichtinduzierten Netzhautdegeneration 17,18,19,20,21und experimentelle autoimmune Uveitis (EAU)^22,23. Mit dieser vielseitigen Technik können Forscher sowohl hochauflösende OCT-Bilder als auch Fundusbilder bequem und effizient aufnehmen.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren entsprachen der Erklärung der Association for Research on Vision and Ophthalmology über die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wenzhou Medical University (WMU) genehmigt. Die Ratten und Mäuse erhielten freien Zugang zu Wasser und Futter mit einer Umgebungslichtintensität von 18 Lux in einem 12-stündigen Dunkel-Licht-Zyklus.

1. Vorbereitung der Augentiermodelle

1. Maus-Laser-induzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) Modell^11,12
   1. Betäuben Sie 4 Wochen alte weibliche Mäuse (C57BL/6J-Hintergrund) mit Ketamin und Xylazin und erweitern Sie die Pupillen mit Tropicamid Phenylephrin Augentropfen nach Schritt 3.2. Betrachten Sie die Maus als richtig betäubt, wenn nach dem Einklemmen des Zehs keine Bewegung festgestellt wird.
   2. Schalten Sie die Lichtquellenbox, die Software und die Laserbox (Wellenlänge: 532 nm) ein, wobei die Ausgangsenergie auf 100 mW und die Dauer auf 100 ms eingestellt wird.
   3. Platzieren Sie die Maus auf der Versuchsplattform und passen Sie die Position der Maus und der Plattform an, bis die Sicht auf den Mausfundus frei ist.
   4. Drücken Sie die Taste Laser ON auf dem Bildschirm der Laserbox und stellen Sie den Fokus des roten Laserreferenzpunkts ein. Bewegen Sie den Laserreferenzpunkt und stellen Sie ihn auf ein bis zwei Papillardurchmesser von der Papille weg ein. Betätigen Sie das Fußpedal, um Laserschäden zu verursachen.
   5. Führen Sie eine sofortige Überprüfung durch, um festzustellen, ob unmittelbar nach dem Aufprall eine Verdampfungsblase aufgetreten ist, die ein Zeichen für eine erfolgreiche Laserbeschädigung ist. Erzeugen Sie drei bis fünf Laserspots für jedes Auge.
2. Maus Sehnerv Crush (ONC) Modell 13,14,15,16
   1. Anästhesieren Sie weibliche Mäuse (C57BL/6J Hintergrund) am postnatalen Tag (P) 21 bis P35 nach Schritt 3.2. Betrachten Sie die Maus als richtig betäubt, wenn nach dem Einklemmen des Zehs keine Bewegung festgestellt wird.
   2. Legen Sie die Maus unter ein Operationsmikroskop und schneiden Sie die Bindehaut eines Auges mit einer Federschere ein, wobei Sie darauf achten, dass die Größe des Bindehautschnitts etwa 1 mm beträgt.
   3. Legen Sie den intraorbitalen Sehnerv frei und zerquetschen Sie ihn mit einer feinen Pinzette 5 s lang in einem Abstand von 0,5 mm zur Sehscheibe. Lenken Sie dabei die Augenhöhlenmuskulatur und die anderen Gewebe vorsichtig ab und legen Sie sie beiseite. Vermeiden Sie Schäden an den Blutgefäßen im chirurgischen Auge.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, da der Augapfel schwingt, wenn Sie den weißen Sehnerv berühren oder zupfen.
   4. Tragen Sie postoperativ eine Augensalbe auf, um Hornhauttrockenheit zu vermeiden.
3. Modell der lichtinduzierten Netzhautdegeneration (LIRD) bei Mäusen 17,18,19,20,21
   1. Vorbereitungen vor dem Experiment: Umschließen Sie die Mäusekäfige (30 cm x 18 cm x 13 cm) mit Alufolie und einer eisernen Netzabdeckung. Legen Sie jeden Käfig in eine Papierschachtel (52 cm x 35 cm x 30 cm) mit einem weißen Licht auf der Oberseite.
   2. Passen Sie 6 Wochen alte männliche Mäuse (BALB/c) über Nacht in der Dunkelkammer an die Dunkelheit an und erweitern Sie dann die Augen mit Tropicamid Phenylephrin Augentropfen in jedem Auge. Erweitern Sie die Pupille vollständig, bis 3/4 des Hornhautbereichs nicht mehr von der Iris bedeckt sind; Dies dauert oft nicht länger als 3 Minuten.
   3. Beleuchten Sie die Mäuse 2 h lang mit 10.000 Lux weißem Licht. Halten Sie die Mäuse postoperativ über Nacht im Dunkeln und kehren Sie dann in die normale Dunkellichtumgebung zurück. Um einen effektiven Lichtreiz zu gewährleisten, halten Sie immer eine Maus im Käfig.
4. Experimentelles Modell für Autoimmun-Uveitis (EAU) an Ratten
   1. Vorbereitungen vor dem Versuch: Emulgieren Sie 2,5 mg hIRBP161-180 in vollständigem Freund-Adjuvans (1:1 Gewicht/Volumen) mit 2,5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra ^22,23.
   2. Injizieren Sie 100 μl der Emulsion subkutan in den linken Fußballen jedes Lewis-Rattenmännchens (ca. 180 g).

2. Einrichtung des OCT-Moduls

1. Verbinden Sie die optische Faser und das OCT-Steuerkabel zwischen dem OCT-Scankopf und der OCT-Engine (Abbildung 1A). Richten Sie die Kerbe an der Faser an einem Schlitz am Stecker aus, und führen Sie die Spitze vorsichtig ein, bis sie sitzt (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Bevor Sie das Steuerkabel anschließen, schalten Sie den Netzschalter des OCT-Motors aus. Die optische Faser ist sehr zerbrechlich, daher sollten Sie beide Enden der Faserspitze vermeiden (Abbildung 1C). Die Montage und Demontage des OCT-Scankopfes und der Faser/des Kabels sollte vermieden werden, wenn dieses Modul häufig verwendet wird.
2. Befestigen Sie das Maus- oder Ratten-OCT-Objektiv an der Vorderseite des Gerätegehäuses (Abbildung 1A). Setzen Sie den OCT-Scankopf auf das OCT-Objektiv, wobei die M-R-Fokusanzeige vom Gerätegehäuse weg zeigt (Abbildung 1A).
3. Befestigen Sie den OCT-Scankopf mit zwei Rändelschrauben: eine am Objektiv und eine am Kameragehäuse. Befestigen Sie den Scankopf fest.
4. Schalten Sie den Hauptschalter ein, gefolgt von der Kameraleuchte und dann die OCT-Software.
   HINWEIS: Die Kamera benötigt einige Zeit, um hochzufahren, damit der Computer sie findet.

3. Vorbereitung von Tieren für OCT-Versuche

1. 10 Minuten vor den OCT-Experimenten träufeln Sie Tropicamid Phenylephrin Augentropfen in die Augen des Tieres und wischen Sie überschüssige Augentropfen mit einem sauberen Handtuch ab.
2. 5 Minuten vor dem Experiment injizieren Sie 200 μl der Anästhesielösung in die Maus und injizieren Sie 2,0 ml intraperitoneal in die Ratte. Betrachten Sie die Maus/Ratte als richtig betäubt, wenn nach dem Einklemmen des Zehs keine Bewegung festgestellt wird.
   HINWEIS: Die Anästhesielösungen bestanden aus Ketamin (12 mg/ml) und Xylazin (1 mg/ml für die Maus und 2 mg/ml für die Ratte) in Kochsalzlösung; In der Regel werden 10 μl Anästhesielösung pro 1 g tierischer Körpermasse aufgetragen. Die Lösungen wurden maximal 2 Wochen bei 4 °C gelagert.
3. Sobald die Anästhesie verabreicht wurde, schmieren Sie die Hornhaut mit Gelsalbe, um eine Trockenheit der Augenoberfläche zu vermeiden.

4. Bildgestützte OCT-Bildgebung

HINWEIS: Die Softwareoberfläche wurde in drei Teile unterteilt: Hellfeldbild, OCT-Steuerregisterkarten und OCT-Anzeige (Abbildung 2).

1. Wenn Sie sich das Hellfeldbild ansehen, geben Sie bei Bedarf die Anmerkung der Tierinformationen ein.
2. Schalten Sie die Steuerelemente für die Strahlposition mit dem Kontrollkästchen ein oder aus, um ein Hellfeldbild mit oder ohne Linienüberlagerung auf dem Bild aufzunehmen.
3. Um den Scanstrahl präziser zu platzieren, verwenden Sie die Pfeile " Position Nudge " zur Feinsteuerung, um ihn nach oben, unten, links oder rechts zu richten. Wählen Sie die Dickenwerte und die Farbe aus, und wählen Sie einen Winkel für den Balken aus, der auf die gewünschte Position ausgerichtet ist (z. B. dick, schwarz und 0). Ziehen Sie den Gain-Wert auf 14 db.
4. Wechseln Sie zu den Registerkarten für die Steuerung des OAT. Wählen Sie im Menü Datei/File_Settings aus, und erstellen Sie dann einen Pfad, in dem die OAT- und Fundus-Bilder gespeichert werden.
5. Geben Sie den Scantyp, die Größe und das Tier (Ratte oder Maus) an. Wählen Sie Auge, links oder rechts, und Imaging Retina.
   HINWEIS: Das OAT kann Zeilen-, Kreis- und 3D-Volumenscantypen in den Größen Volles, Halbes, Viertel und Achtel erfassen.
6. Legen Sie die Bildsteuerelemente fest. Passen Sie die Werte an: 60 für den Kontrast, 100 für das Gamma und 0 für die Helligkeit.
7. Platzieren Sie die Maus auf der Versuchsplattform und passen Sie die Position der Maus und der Plattform an, bis die Sicht auf den Mausfundus frei ist. Passen Sie die Position fein an, um die Papille in der Mitte zu lokalisieren.
8. Stellen Sie den Referenzarm zu Beginn auf 850 für Mäuse und 830 für Ratten ein und passen Sie dann die Position durch Klicken auf die Tasten <-1 oder +1> Fein an. Passen Sie das OAT-Bild horizontal an, und verschieben Sie es dann in das obere 1/3 der Vollansicht.
9. Bewegen Sie den Polarisationsregler, um bei Bedarf die Helligkeit des Signals durch die Netzhaut anzupassen.
10. Nachdem Sie ein klares und stabiles OCT-Bild sowie das Fundusbild beobachtet haben, legen Sie die Anzahl der Frames fest (in der Regel 20, 50, 80 oder 100), und drücken Sie dann auf Durchschnitt.
    HINWEIS: Die Aufnahme der OAT-Bilder dauert einige Sekunden. Eine größere Anzahl von Bildern bedeutet, dass die Bildaufnahme länger dauert, aber ein Bild mit höherer Qualität erzeugt wird.
11. Klicken Sie auf Speichern , um das OAT und die Fundusbilder zu speichern, und klicken Sie dann auf Neustart , um eine weitere Probe aufzunehmen.
    HINWEIS: Die Tiere durften sich vor dem Aufwachen auf einer 37 °C heißen Heizplatte erholen. Die Thiere wurden nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis sie wieder genügend Bewußtsein erlangt hatten, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Die behandelten Tiere wurden erst nach vollständiger Genesung in das Aufzuchtsystem anderer Tiere zurückgebracht.

5. Dickenmessung und quantitative Analyse

HINWEIS: Dieses OAT verfügt über eine integrierte Analysesoftware. OCT-Bilder können mit dieser Software segmentiert und analysiert werden (Abbildung 3).

1. Öffnen Sie die Analysesoftware und öffnen Sie ein OCT-Bild, das analysiert werden soll.
2. Wählen Sie die Anzahl der Layer aus, und drücken Sie dann Get Initial Layers (Erste Layer abrufen ) (Abbildung 3A). Die Software zeichnet die Ebenen automatisch.
3. Klicken Sie auf das Stiftsymbol und verschieben Sie dann die Punkte auf der Zielebene, um die Ebene fein anzupassen (Abbildung 3A, B). Ändern Sie alle Layer sorgfältig nacheinander.
   HINWEIS: Das Hinzufügen weiterer Ebenen ist möglich. Klicken Sie auf das Plus-Symbol, zeichnen Sie mehrere Punkte über das OCT-Bild und drücken Sie dann auf das Häkchen-Symbol. Es wird eine neue Ebene erstellt.
4. Sobald die Feineinstellungen der Ebenen abgeschlossen sind, exportieren Sie die detaillierten Werte (CSV-Format) und die verschiedenen Bildtypen des segmentierten OCT (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Es ist möglich, verschiedene Bildtypen zu exportieren, z. B. Ebenen, Dicken, Dickenmasken, Ebenen ohne OAT und Screenshots. Der Wert in der Mitte, der sich mit dem Sehnerv jedes Bildes überschneidet, muss aufgegeben und auf Null gesetzt werden, da es dort keine Netzhautschicht gibt.

Ergebnisse

Mit der bildgesteuerten OCT kann die Entwicklung des Laserspots bei der laserinduzierten choroidalen Neovaskularisation (CNV) bei Mäusen überwacht werden. Wie in Abbildung 1 gezeigt, durchliefen die Blutgefäße des Neugeborenen sowohl die Bruch-Membran als auch die retinale Pigmentepithelschicht (RPE) und bildeten nach der Laserverletzung eine fibrotische Narbe^11,12. Dieser Läsionsfleck kann entweder in voller Größe (

Diskussion

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die Bildaufnahme und Dickenmessung von bildgeführten OCT. Durch die Demonstration der vier beliebtesten Nagetiermodelle für Augenerkrankungen fanden die Forscher heraus, dass die bildgesteuerte OCT eine hervorragende Leistung bei der Untersuchung drastischer struktureller Veränderungen der Netzhaut bietet. Tatsächlich können mit hochauflösenden Bildern winzige Läsionen auch in OCT-Bildern leicht gefunden werden. Mit Hilfe der bildgesteuerten OCT f...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BALB/c Maus	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Tiermodellpräparate
C57BL/6JNifdc Maus	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Tiermodellpräparate
Carbomer Eye Gel	Fabrik GmbH Tochtergesellschaft von Bausch & Lomb		Befeuchten Sie die Hornhaut
Komplett Freund' s Adjuvans	Sigma	F5881	EAU Experiment
Experimentierplattform	Phoenix Technology Group		Präparate für Tiermodelle
hIRBP161-180	Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Dienstleistungen Co., Ltd.		EAU-Experiment
Ketamin	Ceva Sante Animale		Vollnarkose
Laserbox	Haag-Streit Gruppe	Merilas 532α	Präparate von Tiermodellen
Lewis-Ratte	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd		Tiermodellpräparate
Mycobacterium Tuberculosis H37RA	Sigma	344289	EAU-Experiment
Phoneix Micron IV mit bildgeführter OCT und bildgeführtem Laser	Phoenix Technology Group		Tiermodellpräparate
Gewebezange	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-F101A-5	Tiermodellpräparate
Tropicamid Phenylephrin Augentropfen	SANTEN OY, Japan		Augendilatation
Vannas Schere	Suzhou Mingren Medical Instrument Co., Ltd	MR-S121A	Tiermodellpräparate
Xylazin	Ceva Sante Animale		Allgemeinanästhesie