Visualisierung früher Infektionsherde der Reisexplosionskrankheit (Magnaporthe oryzae) an Gerste (Hordeum vulgare) mit einem einfachen Mikroskop und einem Smartphone

Magnaporthe oryzae, der Reisexplosionspilz, infiziert eine Reihe von Getreidekulturen, darunter Gerste, Weizen und Reis¹. Dieser Erreger verursacht verheerende Krankheiten und stellt eine weltweite Bedrohung für diese wertvollen Nutzpflanzen dar, die zu vollständigen Ernteverlusten führt, wenn er nicht kontrolliert wird. Viele Labore auf der ganzen Welt konzentrieren sich auf die Reisexplosionskrankheit aufgrund ihrer globalen Bedrohung und ihrer Eigenschaften als hervorragendes Modell für Pflanzen-Pilz-Interaktionen². Es wurde vollständig sequenziert, und die Genetik seines Infektionszyklus, insbesondere der frühen Ereignisse, wurde festgestellt ^3,4. Der Lebenszyklus beginnt damit, dass eine Spore auf einer Blattoberfläche keimt und die spezialisierte Penetrationsstruktur bildet, die als Appressorium bezeichnet wird. Das Appressorium dringt in das Blattgewebe ein und die Infektion setzt sich mit der Entwicklung von Läsionen fort, die den Prozess der Sporulation auslösen und die Krankheit verbreiten⁴. Die Verhinderung eines dieser frühen Ereignisse würde diese verheerende Krankheit drastisch hemmen. Folglich konzentrierte sich der Großteil der aktuellen Forschung zur Blastenerkrankung auf die frühen Infektionsschritte, von den gekeimten Konidien, die ein Appressorium bilden, bis zur Entwicklung der invasiven Hyphen und des biotrophen Grenzflächenkomplexes (BIC)⁵.

Die umfangreiche Forschung zur Explosionskrankheit wurde bei Reis durchgeführt, obwohl M. oryzae ein bedeutender Krankheitserreger für eine Vielzahl von Nutzpflanzen ist und neu entwickelte Stämme zu einer globalen Bedrohung für Weizen werden⁶. Während Reis neben Weizen und Mais zu den drei wichtigsten Grundnahrungsmitteln gehört, um die Bevölkerung zu ernähren, ist Gerste das vierte Getreidekorn in Bezug auf Viehfutter und Bierproduktion⁷. Mit dem Wachstum der Craft-Beer-Industrie wächst auch der wirtschaftliche Wert von Gerste. Es gibt deutliche Vorteile bei der Verwendung von M. oryzae und Gerste als Pathosystem zur Untersuchung von Blastenkrankheiten. Erstens gibt es Stämme von M. oryzae , die nur Gerste infizieren, sowie Stämme, die mehrere Grasarten infizieren können. Zum Beispiel infiziert 4091-5-8 hauptsächlich nur Gerste, während Guy11 und 70-15 sowohl Gerste als auch Reis⁸ infizieren können. Diese Stämme sind genetisch ähnlich und der Infektionsprozess ist vergleichbar⁹. Zweitens ist Gerste unter Standard-Labor- und Gewächshausbedingungen einfacher zu züchten, da sie nicht die komplizierten Anforderungen von Reis hat (präzise Temperaturkontrolle, hohe Luftfeuchtigkeit, spezifische Lichtspektren). Es gibt auch Herausforderungen bei der Bildgebung von Reis aufgrund der Hydrophobie der Blattoberfläche, die Gerste nicht aufweist¹⁰.

Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode zur Isolierung und effektiven Nutzung von Gerstenblatthüllen für die mikroskopische Analyse mehrerer Infektionsstadien dar, wobei gängiges Laborzubehör und ein Smartphone zur Datenerfassung verwendet werden. Diese Methode für den Gerstenblattscheiden-Assay ist für Labore auf der ganzen Welt anpassbar, da sie nur minimale Vorräte erfordert und dennoch ein klares Bild der mikroskopischen Wechselwirkung zwischen dem Erreger und den ersten Zellen, die er infiziert, liefert. Während Pathogenitätstests, wie z. B. eine Spray- oder Tröpfchenimpfung, eine Makroansicht der Fähigkeit des Erregers, Läsionen zu bilden, liefern können, ermöglicht dieser Assay dem Forscher, bestimmte Schritte der frühen Infektion zu visualisieren, von Ereignissen vor der Penetration bis zur Besiedlung von Epidermiszellen. Darüber hinaus können die Forscher die Infektion mit dem Wildtyp-Pilz leicht mit einer Infektion mit einer Mutante vergleichen, deren Virulenz reduziert ist.

1. Vorbereitung von Versuchsmaterialien

1. Bereiten Sie Haferflocken-Agar (OMA) zu, indem Sie Haferflocken pürieren, bis es ein feines Pulver ist. 25 g Haferflockenpulver und 15 g Agar zu 500 ml_ddH2Ogeben und im Medienzyklus autoklavieren (alternativ 20 min zum Kochen bringen). Gießen Sie das Medium in sterile 60-mm-Petrischale.
   HINWEIS: Andere Medientypen, die eine Sporulation induzieren, wie z. B. V8-Agar, sind für dieses Protokoll akzeptabel.
2. Die Platte M. oryzae filtert die Platten mit einer sterilen Pinzette direkt auf die OMA-Platten und lässt sie die gesamte Platte bedecken (9-12 Tage). Legen Sie die Platten in einen Wachstumsinkubator bei 25 °C mit 12:12 h Tag-Nacht-Zyklen, um die Sporulation zu induzieren.
   HINWEIS: Einige Mutanten wachsen langsamer und erfordern zusätzliche Pflege (z. B. zuerst vollständige Medien, dann eine Übertragung an die OMA) und können eine zusätzliche Woche benötigen, um genügend Konidien zu produzieren.
3. Pflanzen Sie Gerstensamen (Hordeum vulgare Lacey) direkt in ein feuchtes Wachstumsmedium (z. B. erdloses Blumenerde) mit 10-15 Samen pro 6-Zoll-Topf. Stellen Sie die Töpfe in Schalen mit 1-2 Zoll Wasser.
4. Stellen Sie die Bedingungen in der Gerstenwachstumskammer auf 22 °C für 12 h (Tageslicht) und 19 °C für 12 h (dunkel) bei 60 % relativer Luftfeuchtigkeit ein. Gießen Sie weiter von unten, um die Samen nicht zu stören.
5. Züchten Sie die Gerste bis zum zweiten Blattstadium, ungefähr 14 Tage lang. Schneiden Sie die Gerstenpflanze mit einer sterilen Schere knapp über der Bodenlinie ab. Schneiden Sie mit einer Pinzette und einem Rasiermesser/Skalpell vorsichtig die Blattscheide des ersten Blattes ab, das in Längsrichtung geöffnet ist, und entfernen Sie sie mit der Pinzette von der Basis des zweiten Blattes.
   HINWEIS: Reinigen Sie die Werkzeuge (Pinzette, Skalpell usw.) vor Gebrauch mit 75%-80% Ethanol. Die Hülle ist die dünne Epidermisschicht, die die Befestigung vom ersten zum zweiten Blatt (zweites bis drittes Blatt usw.) bereitstellt; siehe Abbildung 1).
6. Legen Sie das erste Blatt flach in eine sterile 60-mm-Petrischale, die ein feuchtes Papiertuch enthält, um die Feuchtigkeit im Inneren des Tellers aufrechtzuerhalten. Schneiden Sie mit dem Skalpell den größten Teil des ersten Blattes von der Scheide ab und lassen Sie nur 0,5 Zoll des Blattgewebes für die Montage übrig.
7. Kleben Sie das Blattgewebe auf den Boden der Petriplatte.
   HINWEIS: Die Scheide kräuselt sich, aber dies ist akzeptabel, da eine gekräuselte Hülle das konidiale Tröpfchen leichter hält.
8. Sammeln Sie 9-12 Tage alte M. oryzae-Platten und geben Sie 0,5-2 ml steriles Wasser in die Platten. Kratzen Sie das Myzel mit einer sterilen Impfschleife vorsichtig ab, um die anhaftenden Konidien freizusetzen. Pipettieren Sie die Konidiensuspension vorsichtig in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das ein kleines Stück Käsetuch enthält, um große Myzelstücke aus der Konidiensuspension herauszufiltern.
   HINWEIS: Sporen können bereits nach 7 Tagen gesammelt werden, wenn Wachstum und Sporulation ausreichen, um die gewünschte Sporenkonzentration zu erreichen. Die Entnahme kann nicht länger als 14 Tage verzögert werden, wenn mit einer langsam wachsenden genetischen Mutante gearbeitet wird
9. Die gewünschte Sporenkonzentration beträgt 5 x 10 4 Sporen pro ml, aber ein Bereich (1 x 10 ^4-1 x 10 5) ist akzeptabel. Eine zu hohe Konzentration macht die Bildgebung einzelner Infektionsherde schwierig. Verdünnen Sie die Sporenkonzentration bei Bedarf mit sterilem Wasser.
10. Pipettieren Sie vorsichtig die konidiale Suspension in der gerollten Blattscheide. Beginnen Sie mit 25 μl (die Tröpfchengröße kann je nach Größe der Hülle auf bis zu 50 μl erhöht werden).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, drei bis fünf Replikate jedes mutierten Stammes oder jeder Gerstenlinie durchzuführen. Es ist üblich, dass während des Färbeprozesses Schäden auftreten, daher werden zusätzliche Mantelreplikate empfohlen.
11. Füllen Sie vier oder fünf 500-ml-Becher mit ddH₂O und erhitzen Sie sie bis zum Dämpfen (mit einer Mikrowelle oder Kochplatte). Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Heißwasserbecher bewegen. Halten Sie den Deckel der Petrischale über einen der dampfenden Becher, um die Feuchtigkeit im Inneren des Tellers einzufangen.
12. Stapeln Sie die infizierten Blattscheidenplatten und umgeben Sie sie mit den restlichen heißen Bechern. Dadurch entsteht eine feuchte, feuchte Umgebung, die für die Keimung der Sporen erforderlich ist.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Deckel dämpfen, um sicherzustellen, dass kein heißes Wasser oder Dampf die Hüllen berührt.
13. Schützen Sie die Blattscheiden vor Licht, bedecken Sie sie mit einer einfarbigen (vorzugsweise schwarzen) Gummi- oder Plastikbox und lassen Sie sie 48 Stunden oder den gewünschten Zeitpunkt für die Aufnahme einwirken.
    HINWEIS: Ein Karton ist nicht geeignet, da er die Feuchtigkeit/Feuchtigkeit nicht einschließt und den Dampf aus den Heißwasserbechern aufnimmt. Eine abschließbare Plastikwanne eignet sich gut, um die Feuchtigkeit einzudämmen, und sie kann mit schwarzem Stoff oder einem größeren dunklen Behälter abgedeckt werden, um das Licht zu blockieren.

2. Färbeprozess

1. Bereiten Sie den Fleck wie folgt vor: Bereiten Sie eine frische Verdünnung von 45% Essigsäure vor und fügen Sie 0,1% v/v Trypanblau hinzu. Aliquot 1 ml der Farbstofflösung in Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie einen Heizblock oder ein Wasserbad auf 40 °C ein.
2. Schneiden Sie die Blattscheide vorsichtig mit einem Rasiermesser oder Skalpell vom Klebeband ab. Legen Sie den Mantel mit einer Pinzette in das Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass er vollständig in die Farbstofflösung eingetaucht ist. Warten Sie 2 Stunden, bis der Farbstoff in das Blatt eingedrungen ist. Erhitzen Sie die Proben während des Färbevorgangs auf 40 °C in einem Heizblock oder Wasserbad, um das Eindringen des Farbstoffs zu erhöhen.
   HINWEIS: Die Hüllen versuchen, im Mikrozentrifugenröhrchen zu schwimmen; Um ungefärbte Taschen von Blattgewebe zu vermeiden, füllen Sie die Röhrchen, tauchen Sie die Hüllen ein und schließen Sie das Röhrchen. Legen Sie nicht mehrere Hüllen in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Spülen Sie die Blattscheiden vorsichtig mit 60% Glycerin ab, um den zusätzlichen Farbstoff zu entfernen. Drei Spülgänge (jeweils in frischem Glycerin) sind in der Regel ausreichend. Bewahren Sie die Hülle in Glycerin auf, bis sie auf Objektträgern montiert werden kann.

3. Montage- und Bildgebungsprozess

1. Legen Sie die Hülle auf einen sauberen Objektträger und fügen Sie ein paar Tropfen 60% Glycerin hinzu. Rollen Sie die Hülle mit einem Präpariermikroskop und zwei Pinzetten vorsichtig ab und lassen Sie die geimpfte Mitte nach oben zeigen. Halten Sie die Hülle mit der Pinzette offen und legen Sie das Deckglas darauf, um zu verhindern, dass sich die Hülle kräuselt und die Infektionsstelle blockiert.
   HINWEIS: Die Blattscheide ist sehr zerbrechlich, und diese Schritte müssen mit Sorgfalt durchgeführt werden, um Schäden an der Hülle zu vermeiden.
2. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack für die Langzeitlagerung oder Klebeband für die Kurzzeitlagerung. Beobachten Sie die Objektträger unter einem zusammengesetzten Lichtmikroskop.
3. Nehmen Sie einfache Bilder mit einem Mikroskop und einem Mobiltelefon auf. Hier wurden Bilder mit einer Handy-Adapterhalterung und einem Smartphone aufgenommen. Stellen Sie bei Android-Geräten die Kameraanwendung auf die folgenden Einstellungen ein: Blitz aus, Top Shot deaktivieren, automatische Anpassung von Helligkeit und Schatten deaktivieren und die Fotoauflösung auf voll einstellen.
   HINWEIS: Wenn Sie die Kameraanwendung auf dem Telefon verwenden, verringert sich die Akkulaufzeit schneller als üblich, daher wird empfohlen, eine externe Stromversorgung zu haben.
4. Sobald das Mobiltelefon auf dem Mikroskop montiert ist, nehmen Sie ein Bild eines Mikrometers mit dem Objektiv auf, das zur Erfassung der Daten verwendet wird. Die Daten in dieser Studie wurden an einem 40x 0,65 NA Luftobjektiv erfasst, und der Telefonadapter wurde auf einem 10x Okular montiert. Stellen Sie den Zoom des Telefons auf das 2,5-fache ein und halten Sie ihn konstant, um eine konstante Pixelgröße beizubehalten.
5. Das Zentrum der Hülle beherbergt die größte Konzentration von Sporen und infizierenden Appressorien; Streben Sie daher 9-12 Bilder jeder Hülle an, um signifikante Zahlen für die statistische Analyse zu erhalten. Die Anzahl der Sporen und Appressorien variiert je nach Konzentration der angewendeten Sporen.

4. Bildbeurteilung und -zählung mit ImageJ (FIJI)

Eine Darstellung des anfänglichen Arbeitsablaufs für diese Technik ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Scheiden wurden von 14 Tage alten anfälligen "Lacey"-Gerstenpflanzen (H. vulgare) geerntet. Die Konidien wurden aus 10 Tage alten sporulierenden M. oryzae OMA-Platten geerntet, wobei eine konidiale Suspension unter Verwendung von sterilem ddH2O für eine Endkonzentration von 5 x 104 Sporen pro ml hergestellt wurde. Die Inokulumsuspension wurde direkt auf die Blattscheiden aufgetragen, die an sterilen Petriplatten befestigt waren. Die Platten wurden in einer warmen, feuchten Kammer für 48 h ohne Licht aufbewahrt. Nach der Inkubationszeit wurden die Blattscheiden mit Trypanblau gefärbt und für die Bildgebung vorbereitet.

Die Infektionsstellen wurden mit einem Smartphone und einem Smartphone-Mikroskopadapter abgebildet. Für jeden der getesteten Stämme von M. oryzae wurden mindestens 10 Bilder aufgenommen. Das Experiment wurde dreimal wiederholt, um mindestens 30 Bilder für jeden Pilzstamm zu erhalten. Abbildung 2A zeigt die repräsentativen Ergebnisse eines erfolgreichen Hüllen-Assays sowie ungefärbte und falsch gefärbte Bilder als Referenz.

Je nach Hypothese können diese Bilder auf vielfältige Weise quantifiziert und analysiert werden. Für dieses Experiment wurde 48 h nach der Inokulation die Gesamtzahl der lebenden Sporen (gekeimte Sporen) zusammen mit der Anzahl der Appressorien und der Anzahl der erfolgreich infizierten Zellen gezählt. Eine Sammlung von 2.000 zufällig mutagenisierten M. oryzae-Stämmen in einem Gersten-infizierenden Hintergrund wurde im Labor erzeugt. Pathogenitätstests unter Verwendung von Spray- und Tropfenimpfungen ergaben viele Mutanten mit reduzierter Läsionsgröße im Vergleich zum Wildtyp (ein häufiger Phänotyp für M. oryzae-Mutanten )11. Um diese Phänotypen auseinander zu nehmen, wurde die Hypothese aufgestellt, dass die reduzierte Läsionsgröße durch die Hemmung eines der frühen Infektionsschritte (Sporenkeimung, appressoriale Bildung, Penetrationsstiftbildung, anfängliche epidermale Zellbesiedlung) verursacht wurde, die am einfachsten über den Blattscheiden-Assay getestet werden kann. Ein vielversprechender Kandidat aus dem Mutagenese-Projekt wurde unter Verwendung eines Vorwärtsgenetikums namens J99A12 identifiziert. Diese Mutante zeigte während des Screenings keine Empfindlichkeit gegenüber stickstoffarmen oder reaktiven Sauerstoffbedingungen. Während der Folgeexperimente produzierte J99A eine signifikante Anzahl von Appressorien auf einer hydrophoben Oberfläche, zeigte jedoch eine reduzierte Läsionsgröße auf lebender Gerste. Bei Tests mit dem Scheidenassay entwickelte J99A erfolgreich Appressorien und Penetrationsstifte, die in die Blattscheide eindrangen, aber im Inneren keine invasiven Hyphen produzierten, was darauf hindeutet, dass die Infektion am Penetrationsstift gestoppt wurde (Abbildung 2B). Erfolgreich infizierte Zellen wurden durch das Vorhandensein infektiöser Hyphen im Gewebe der Blattscheide identifiziert. Der Vergleich der Anzahl der Appressorien mit der Anzahl der infizierten Zellen ergab einen Prozentsatz der erfolgreich infizierten Appressorien. Beim Wildtyp 4091-5-8 drangen 87% der Appressorien erfolgreich in die Zelle ein und besiedelten sie, während in der Mutante J99A nur 36% der Appressorien Hyphen in der Zelle12 aufwiesen.

Abbildung 1: Blattscheiden, die von 10 Tage alter Gerste geerntet und vorsichtig mit in Ethanol gereinigten Werkzeugen entfernt wurden. Konidien werden gesammelt und die Konzentration wird mit sterilem Wasser auf 0,5-1,0 x 105 pro Milliliter eingestellt. Die isolierten Hüllen werden in eine 60 cm lange Petriplatte geklebt, und die konidiale Suspension wird in die Hülle geladen. Die beimpften Proben werden bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Bechern mit heißem Wasser für Feuchtigkeit aufbewahrt. Die Proben werden in 45% Essigsäure + 0,1% Trypanblau für 1-2 h bei 40 °C gefärbt und dann 48 h nach der Inokulation dreimal in 60% Glycerin gespült. Gefärbte Proben werden montiert und bebildert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse aus dem Färbeprotokoll . (A) Abweichungen vom Färbeprotokoll können zu suboptimalen Ergebnissen führen. Die Hitze und die Essigsäure dienen dazu, das Blattgewebe sanft aufzuweichen. Die Nachfärbungsspülungen in 60% Glycerin entfernen nicht nur den überschüssigen Fleck, sondern tragen auch dazu bei, die durch das Blatt verursachte Lichtstreuung zu reduzieren und die Bildqualität zu verbessern. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Repräsentative Bilder, die die Robustheit dieses Assays zeigen, um fehlgeschlagene Penetrations- und nachfolgende Infektionsversuche von J99A (Pfeilspitzen) zu sehen, verglichen mit erfolgreichen Versuchen von 4091WT, die zur Produktion von invasiven Hyphen im Blattgewebe (Pfeile) führten. Maßstabsbalken = 50 μm. Alle Bilder wurden 48 Stunden nach der Infektion aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.