Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

Erin Crawford; Heather L. Mentrup; Elizabeth A. Novak; Kevin P. Mollen

doi:10.3791/64804

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Methodenartikel

Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

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DOI:

10.3791/64804

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2. Juni 2023

Erin Crawford^*¹ , Heather L. Mentrup^*²^,³ , Elizabeth A. Novak²^,³ , Kevin P. Mollen²^,³

¹Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, ²Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, ³Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Isolierung von murinen Kolonkrypten für die Entwicklung von 3-dimensionalen Kolonoiden beschreibt. Die etablierten Kolonoide können dann terminalisiert werden, um die zelluläre Zusammensetzung des Wirtsepithels widerzuspiegeln, bevor sie eine entzündliche Herausforderung erhalten oder angewiesen werden, eine epitheliale Monoschicht zu bilden.

Zusammenfassung

Das Darmepithel spielt eine wesentliche Rolle für die menschliche Gesundheit, da es eine Barriere zwischen dem Wirt und der äußeren Umgebung darstellt. Diese hochdynamische Zellschicht stellt die erste Verteidigungslinie zwischen mikrobiellen und immunen Populationen dar und hilft, die Immunantwort des Darms zu modulieren. Die Störung der Epithelbarriere ist ein Kennzeichen der chronisch entzündlichen Darmerkrankung (CED) und für das therapeutische Targeting von Interesse. Das 3-dimensionale Kolonoidkultursystem ist ein äußerst nützliches In-vitro-Modell für die Untersuchung der Dynamik von Darmstammzellen und der Physiologie von Epithelzellen in der Pathogenese von CED. Im Idealfall wäre die Etablierung von Kolonoiden aus dem entzündeten Epithelgewebe von Tieren am vorteilhaftesten, um die genetischen und molekularen Einflüsse auf Krankheiten zu beurteilen. Wir haben jedoch gezeigt, dass in vivo Epithelveränderungen bei Kolonoiden, die von Mäusen mit akuter Entzündung gebildet wurden, nicht unbedingt erhalten bleiben. Um dieser Einschränkung zu begegnen, haben wir ein Protokoll zur Behandlung von Kolonoiden mit einem Cocktail von Entzündungsmediatoren entwickelt, die typischerweise während einer CED erhöht sind. Während dieses System ubiquitär auf verschiedene Kulturbedingungen angewendet werden kann, legt dieses Protokoll den Schwerpunkt auf die Behandlung sowohl auf differenzierten Kolonoiden als auch auf 2-dimensionalen Monoschichten, die von etablierten Kolonoiden abgeleitet sind. In einer traditionellen Kulturumgebung werden Kolonoide mit Darmstammzellen angereichert, was eine ideale Umgebung für die Untersuchung der Stammzellnische bietet. Dieses System erlaubt jedoch keine Analyse der Merkmale der Darmphysiologie, wie z.B. der Barrierefunktion. Darüber hinaus bieten traditionelle Kolonoide nicht die Möglichkeit, die zelluläre Antwort von terminal-differenzierten Epithelzellen auf proinflammatorische Reize zu untersuchen. Die hier vorgestellten Methoden bieten einen alternativen experimentellen Rahmen, um diese Einschränkungen zu adressieren. Das 2-dimensionale Monolayer-Kultursystem bietet auch die Möglichkeit für ein therapeutisches Wirkstoff-Screening ex vivo. Diese polarisierte Zellschicht kann mit Entzündungsmediatoren auf der basalen Seite der Zelle und gleichzeitig mit putativen Therapeutika apikal behandelt werden, um ihren Nutzen bei der CED-Behandlung zu bestimmen.

Einleitung

Entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind eine chronische, remittierende und rezidivierende Erkrankung, die durch Episoden von Entzündungen und klinischer Ruhe gekennzeichnet ist. Die Ätiologie der CED ist multifaktoriell, aber zu den wichtigsten charakteristischen Merkmalen der Erkrankung gehören eine gestörte Barrierefunktion und eine erhöhte Permeabilität des Darmepithels sowie proinflammatorische Signalkaskaden, die innerhalb des Epithelkompartiments aktiviert werden ^1,2. Mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle wurden verwendet, um die Epithelreaktion während CED zu rekapitulieren, einschlie....