Das vorliegende Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Echtzeit- und dynamischen Erfassung von spannungsgesteuerten Kaliumkanalströmen (Kv) in H9c2-Kardiomyozyten unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik.
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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Echtzeit- und dynamischen Erfassung von spannungsgesteuerten Kaliumkanalströmen (Kv) in H9c2-Kardiomyozyten unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik.
Kaliumkanäle auf der myokardialen Zellmembran spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der elektrophysiologischen Aktivitäten der Zellen. Als einer der wichtigsten Ionenkanäle sind spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (Kv) eng mit einigen schweren Herzerkrankungen wie medikamenteninduzierten Myokardschäden und Myokardinfarkt verbunden. In der vorliegenden Studie wurde die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik verwendet, um die Wirkungen von 1,5 mM 4-Aminopyridin (4-AP, ein Breitband-Kaliumkanalinhibitor) und Aconitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM und 200 μM) auf den Kv-Kanalstrom (IKv) in H9c2-Kardiomyozyten zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass 4-AP das I Kv um etwa 54% hemmte, während die hemmende Wirkung von AC auf das IKv einen dosisabhängigen Trend zeigte (keine Wirkung für 25 μM, 30% Hemmrate für 50 μM, 46% Hemmrate für 100 μM und 54% Hemmrate für 200 μM). Aufgrund der Eigenschaften einer höheren Empfindlichkeit und Präzision wird diese Technik die Erforschung der Kardiotoxizität und der pharmakologischen Wirkungen der Ethnomedizin auf Ionenkanäle fördern.
Ionenkanäle sind spezielle integrierte Proteine, die in die Lipiddoppelschicht der Zellmembran eingebettet sind. In Gegenwart von Aktivatoren bilden die Zentren solcher speziellen integrierten Proteine hochselektive hydrophile Poren, die Ionen geeigneter Größe und Ladung passiv transportieren1. Ionenkanäle sind die Grundlage der Zellerregbarkeit und Bioelektrizität und spielen eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von zellulären Aktivitäten2. Das Herz versorgt andere Organe durch regelmäßige Kontraktionen mit Blut, die aus einem Erregungs-Kontraktions-gekoppelten Prozess resultieren, der durch Aktionspotentiale ausgelös....
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Die kommerziell gewonnenen H9c2-Kardiomyozyten der Ratte (siehe Materialtabelle) wurden in DMEM inkubiert, das 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einer mit 5%CO2 befeuchteten Atmosphäre enthielt. Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik wurde dann verwendet, um die Veränderungen in IKv in normalen H9c2-Zellen und 4-AP- oder AC-behandelten Zellen zu erkennen (Abbildung 1 und Abbildung 2).
1. Lösungsvorbereitung
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Dieses Protokoll ermöglichte die Aufzeichnung des IKv gemäß den Parametern, die in der Ganzzellen-Patch-Clamp-Technik eingestellt wurden. Das IKv wurde durch 150 ms depolarisierenden Pulsstimulus von −40 bis +60 mV bei einem Haltepotential von −60 mV ausgelöst (Abbildung 3A). Das IKv der H9c2-Kardiomyozyten der Ratte erschien zuerst um −20 mV, und dann nahm die Amplitude mit weiterer Depolarisation zu. Aus den gemessenen Stromamplituden wurde die mittlere Bez.......
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Die elektrophysiologische Patch-Clamp-Technik wird hauptsächlich verwendet, um die elektrische Aktivität und funktionelle Eigenschaften von Ionenkanälen auf der Zellmembran25 aufzuzeichnen und zu reflektieren. Gegenwärtig umfassen die Hauptaufzeichnungsverfahren der Patch-Clamp-Technik die Einkanalaufzeichnung und die Ganzzellenaufzeichnung26. Für den Ganzzellenmodus werden die Glasmikroelektrode und der Unterdruck verwendet, um eine hochohmige Abdichtung zwischen einem kle.......
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Wir freuen uns über die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Foundation of China (82130113) und des Key R&D and Transformation Program der Science & Technology Department der Provinz Qinghai (2020-SF-C33).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopyridin | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitin | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
| Verstärker | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| Analysenwaage | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| Borosilikatglas mit Filament (AD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm Länge) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| Zellkulturschale (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Zellkulturschale (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
| Clampfit-Software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | Datenerfassungssoftware |
| D-(+)-Glukose | Rhawn | RH289133 | |
| Digitalkamera | Hamamatsu | C11440 | |
| Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 2166090RP | |
| Flammender/brauner Mikropipettenabzieher | Sutter Instrument | Modell P-1000 | |
| H9c2 Zellen | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221 | ||
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
| KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
| MgCl2· 6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
| Mikromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
| Mikroskop Olympus | IX73 | ||
| Mikroskop-Deckglas (20 & 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
| Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B Commander | Axon Instrument | MultiClamp Commander 2.0 | Signalverstärker-Software |
| OriginPro 8 Software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| PH Meter | Mettler Toledo | S201K | |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Trypsin 0,25% (1x) | HyClone | J210045 |
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