Genexpressionsanalysen in humanen Follikeln

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das beschreibt, wie menschliche Ovarialfollikel aus gefrorenem und aufgetautem kortikalem Gewebe isoliert werden können, um Genexpressionsanalysen durchzuführen.

Abstract

Der Eierstock ist ein heterogenes Organ, das sich aus verschiedenen Zelltypen zusammensetzt. Um die molekularen Mechanismen während der Follikulogenese zu untersuchen, kann die Lokalisierung von Proteinen und Genexpression auf fixiertem Gewebe durchgeführt werden. Um die Genexpression in einem menschlichen Follikel richtig beurteilen zu können, muss diese komplexe und empfindliche Struktur jedoch isoliert werden. Daher wurde ein angepasstes Protokoll entwickelt, das zuvor von Woodruffs Labor beschrieben wurde, um die Follikel (die Eizelle und die Granulosazellen) von ihrer Umgebung zu trennen. Das kortikale Gewebe der Eierstöcke wird zunächst manuell bearbeitet, um kleine Fragmente mit zwei Werkzeugen zu erhalten: einem Gewebeschneider und einem Gewebezerkleinerer. Das Gewebe wird dann mit 0,2 % Kollagenase und 0,02 % DNase für mindestens 40 min enzymatisch verdaut. Dieser Aufschlussschritt wird bei 37 °C und 5 % CO₂ durchgeführt und von einem mechanischen Pipettieren des Mediums alle 10 min begleitet. Nach der Inkubation werden die isolierten Follikel manuell mit einer kalibrierten Mikrokapillarpipette unter mikroskopischer Vergrößerung entnommen. Wenn noch Follikel in den Gewebestücken vorhanden sind, wird der Eingriff mit einer manuellen Mikrodissektion abgeschlossen. Die Follikel werden auf Eis in einem Nährmedium gesammelt und zweimal in Tröpfchen phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Dieser Verdauungsvorgang muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine Verschlechterung der Follikel zu vermeiden. Sobald die Struktur der Follikel beeinträchtigt zu sein scheint oder nach maximal 90 Minuten, wird die Reaktion mit einer 4 °C heißen Blockierlösung gestoppt, die 10 % fötales Kälberserum enthält. Es sollten mindestens 20 isolierte Follikel (mit einer Größe unter 75 μm) entnommen werden, um nach der RNA-Extraktion eine ausreichende Menge an Gesamt-RNA für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RT-qPCR) zu erhalten. Nach der Extraktion erreicht die Quantifizierung der Gesamt-RNA aus 20 Follikeln einen Mittelwert von 5 ng/μL. Die gesamte RNA wird dann in cDNA retrotranskribiert und die interessierenden Gene werden mittels RT-qPCR weiter analysiert.

Introduction

Der Eierstock ist ein komplexes Organ, das aus funktionellen und strukturellen Einheiten besteht, einschließlich der Follikel innerhalb der Hirnrinde und des Stromas. Die Follikulogenese, der Prozess der Follikelaktivierung, des Wachstums und der Reifung von einem ursprünglichen Ruhezustand zu einem reifen Follikel, der befruchtet werden kann und die frühe Embryonalentwicklung unterstützt, wird in der Forschung umfassend untersucht¹. Die Entschlüsselung der Mechanismen, die dieses Phänomen antreiben, könnte die Fruchtbarkeitsversorgung von Frauen verbessern². Analysen an fixiertem menschlichem Gewebe ermöglichen die Beur....

Protocol

Dieses Projekt wurde von der Ethikkommission des Erasme-Krankenhauses (Brüssel, Belgien) genehmigt. Die in dieses Protokoll eingeschlossene Patientin unterzog sich vor der Chemotherapie im Jahr 2000 einer Kryokonservierung des Eierstockgewebes (OTC) zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Die Patientin unterschrieb eine schriftliche Einverständniserklärung, ihr verbleibendes gefrorenes Gewebe am Ende der Aufbewahrungsfrist für die Forschung zu spenden.

1. Auftauen von kryokonserviertem Eierstockgewebe

1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit fünf Auftaulösungen vor. Die erste Vertiefung enthält 5 ml Kryoprotektivlösung, beste....

Results

Mit diesem Isolationsverfahren kann der Experimentator Follikel aus der Stromaumgebung entnehmen, um spezifische Genexpressionsanalysen durchzuführen. Anhand der Größe und Morphologie der Follikel ist es möglich, die verschiedenen Stadien der Follikulogenese zu unterscheiden. Der Experimentator kann die interessierenden Follikel entsprechend ihrer Größe mit einer angepassten Mikrokapillarpipette auswählen. Durch die Verwendung einer Mikrokapillare von maximal 75 μm ist es möglich, primordiale und primäre Follikel von sek.......

Discussion

Die Kryokonservierung von Eierstockgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Fruchtbarkeit von Krebspatientinnen zu erhalten. In der Klinik wird aufgetautes kortikales Gewebe nach der Remission wieder in die Patientin transplantiert, was die Wiederaufnahme der Eierstockfunktion und der Fruchtbarkeit ermöglicht^19,20. Neben der klinischen Verwendung können am Ende der Lagerzeit auch verbleibende Eierstockfragmente für die Forschung gespendet werden, um die M.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm gerasterte Petrischale	Corning	430196
2100 Bioanalysegerät	Agilent	G2939BA
2100 Expert Software	Agilent	Version B.02.08.SI648
4-Well-Platte	Sigma Aldrich	D6789
6-Well-Platte	Carl Roth	EKX5.1
Agilent Gesamt-RNA 6000 Pico-Kit	Agilent	5067-1513
Ascorbinsäure	Sigma Aldrich	A4403
Aspirator-Röhrchenbaugruppen für Mikrokapillarpipetten	Sigma Aldrich	A5177
Zentrifuge	Eppendorf	5424R
Kollagenase IV	LifeTechnologies	17104-019
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
DNase	Sigma Aldrich	D4527-10kU
FBS	Gibco	10270-106
GoScript reverse Transkriptase	Promega	A5003
HSA	CAF DCF DCF	LC4403-41-080
Leibovitz-15	LifeTechnologies	11415-049
L-Glutamin	Sigma Aldrich	G7513
McCoy' s 5A + Bikarbonat + Hepes	LifeTechnologies	12330-031
McIlwain Gewebehacker	Stoelting	51350
Mikrokapillare RI EZ-Spitzen 200 & Mikrokapillare m	CooperSurgical	7-72-2200/1
Mikrokapillare RI EZ-Spitzen 75 & Mikrokapillare m	CooperSurgical	7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c Bediensoftware	ThermoFisher	Version 1.6
NanoDrop Spektralphotometer	ThermoFisher	2000/2000c
Penicillin G	Sigma Aldrich	P3032
PowerTrack SYBR grüner Mastermix	ThermoFisher	A46109
Primer: GDF9			F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primer: HPRT			F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primer: Kit Ligand			F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3	ThermoFisher	A33779
RNAqueous-micro total RNA Isolationskit	ThermoFisher	AM1931
Selen	Sigma Aldrich	S9133
Natriumpyruvat	Sigma Aldrich	S8636
Stereomikroskop	Nikon	SMZ800
Streptomycinsulfat	Sigma Aldrich	S1277
Saccharose	Sigma Aldrich	S1888
Thermo Scientific Forma Serie II  wasserummantelt CO2  Inkubatoren	ThermoFisher	3110
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer	Thomas Scientific	6727C10
Transferrin	Roche