Methodenartikel

Genexpressionsanalysen in humanen Follikeln

DOI:

10.3791/64807

⸱

17. Februar 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir ein Protokoll, das beschreibt, wie menschliche Ovarialfollikel aus gefrorenem und aufgetautem kortikalem Gewebe isoliert werden können, um Genexpressionsanalysen durchzuführen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Eierstock ist ein heterogenes Organ, das sich aus verschiedenen Zelltypen zusammensetzt. Um die molekularen Mechanismen während der Follikulogenese zu untersuchen, kann die Lokalisierung von Proteinen und Genexpression auf fixiertem Gewebe durchgeführt werden. Um die Genexpression in einem menschlichen Follikel richtig beurteilen zu können, muss diese komplexe und empfindliche Struktur jedoch isoliert werden. Daher wurde ein angepasstes Protokoll entwickelt, das zuvor von Woodruffs Labor beschrieben wurde, um die Follikel (die Eizelle und die Granulosazellen) von ihrer Umgebung zu trennen. Das kortikale Gewebe der Eierstöcke wird zunächst manuell bearbeitet, um kleine Fragmente mit zwei Werkzeugen zu erhalten: einem Gewebeschneider und einem Gewebezerkleinerer. Das Gewebe wird dann mit 0,2 % Kollagenase und 0,02 % DNase für mindestens 40 min enzymatisch verdaut. Dieser Aufschlussschritt wird bei 37 °C und 5 % CO2 durchgeführt und von einem mechanischen Pipettieren des Mediums alle 10 min begleitet. Nach der Inkubation werden die isolierten Follikel manuell mit einer kalibrierten Mikrokapillarpipette unter mikroskopischer Vergrößerung entnommen. Wenn noch Follikel in den Gewebestücken vorhanden sind, wird der Eingriff mit einer manuellen Mikrodissektion abgeschlossen. Die Follikel werden auf Eis in einem Nährmedium gesammelt und zweimal in Tröpfchen phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Dieser Verdauungsvorgang muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine Verschlechterung der Follikel zu vermeiden. Sobald die Struktur der Follikel beeinträchtigt zu sein scheint oder nach maximal 90 Minuten, wird die Reaktion mit einer 4 °C heißen Blockierlösung gestoppt, die 10 % fötales Kälberserum enthält. Es sollten mindestens 20 isolierte Follikel (mit einer Größe unter 75 μm) entnommen werden, um nach der RNA-Extraktion eine ausreichende Menge an Gesamt-RNA für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RT-qPCR) zu erhalten. Nach der Extraktion erreicht die Quantifizierung der Gesamt-RNA aus 20 Follikeln einen Mittelwert von 5 ng/μL. Die gesamte RNA wird dann in cDNA retrotranskribiert und die interessierenden Gene werden mittels RT-qPCR weiter analysiert.

Einleitung

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Der Eierstock ist ein komplexes Organ, das aus funktionellen und strukturellen Einheiten besteht, einschließlich der Follikel innerhalb der Hirnrinde und des Stromas. Die Follikulogenese, der Prozess der Follikelaktivierung, des Wachstums und der Reifung von einem ursprünglichen Ruhezustand zu einem reifen Follikel, der befruchtet werden kann und die frühe Embryonalentwicklung unterstützt, wird in der Forschung umfassend untersucht1. Die Entschlüsselung der Mechanismen, die dieses Phänomen antreiben, könnte die Fruchtbarkeitsversorgung von Frauen verbessern2. Analysen an fixiertem menschlichem Gewebe ermöglichen die Beurteilung der Proteinexpression und der Genlokalisation innerhalb der funktionellen Einheiten des Ovars 3,4. Es sind jedoch spezielle Techniken erforderlich, um die Follikel von der umgebenden Hirnrinde zu trennen, um die Genexpression in den Eierstockfollikeln genau zu bestimmen. Daher wurde in einer früheren Studie eine Follikelisolationstechnik entwickelt, die Analysen der Genexpression direkt aus der funktionellen Einheit des Ovars ermöglicht5. Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, wie z. B. der enzymatische Aufschluss und/oder die mechanische Isolierung sowie die Laser-Capture-Mikrodissektion, die eine Follikelisolierung innerhalb eines Gewebestücks ermöglichen 6,7,8,9. Die Follikelisolierung wird häufig verwendet, entweder mit menschlichem oder tierischem Eierstockgewebe, um die Genexpressionsprofile von Follikeln in allen Entwicklungsstadien zu bewerten10,11,12. Ein optimales Isolationsverfahren sollte jedoch die fragile Struktur des Follikels innerhalb des dichten Kortex berücksichtigen und daher mit Sorgfalt durchgeführt werden, um Schäden zu vermeiden7. Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren, das von einem von Woodruffs Labor beschriebenen Protokoll adaptiert wurde, um menschliche Follikel aus gefrorener und aufgetauter Eierstockrinde zu isolieren, um Genexpressionsanalysen durchzuführen13.

Der erste Schritt der Isolierung der Eierstockfollikel aus gefrorenem menschlichem Gewebe ist das Auftauen. Dieser Prozess wird auf der Grundlage des klinischen Protokolls durchgeführt, das für die Transplantation von kryokonserviertem Eierstockgewebe verwendet wird, wie zuvor beschrieben14,15. Das Verfahren zielt darauf ab, die Kryoprotektiva zu entfernen, indem die Eierstockrinde in abnehmenden Konzentrationen des Mediums gespült wird. Anschließend wird das Gewebe fragmentiert, bevor es enzymatisch und mechanisch isoliert wird, um die Follikel zu gewinnen. Follikel in verschiedenen Stadien können mit einem Stereomikroskop mit hoher Vergrößerung und hochwertiger Optik unterschieden werden, um die interessierenden Follikel zu isolieren. Jeder isolierte Follikel wird mit einem in das Mikroskop integrierten Lineal gemessen, und die Follikel können nach ihrem Entwicklungsstadium zusammengefasst werden: Primordialfollikel (30 μm), Primärfollikel (60 μm), Sekundärfollikel (120-200 μm) und Antralfollikel (>200 μm)16. Eine weitere Klassifizierung kann nach der Morphologie der Follikel vorgenommen werden: primordiale Follikel haben eine Schicht abgeflachter Granulosazellen (GCs), primäre Follikel haben eine Schicht quaderförmiger GCs, sekundäre Follikel haben mindestens zwei Schichten quaderförmiger GCs, und das Vorhandensein eines Hohlraums zwischen den GCs charakterisiert das Antralstadium. Wenn die interessierenden Follikel ausgewählt werden, wird eine RNA-Extraktion durchgeführt. Die RNA-Quantität und -Qualität wird vor der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) in Echtzeit bewertet (Abbildung 1).

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Protokoll

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Dieses Projekt wurde von der Ethikkommission des Erasme-Krankenhauses (Brüssel, Belgien) genehmigt. Die in dieses Protokoll eingeschlossene Patientin unterzog sich vor der Chemotherapie im Jahr 2000 einer Kryokonservierung des Eierstockgewebes (OTC) zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Die Patientin unterschrieb eine schriftliche Einverständniserklärung, ihr verbleibendes gefrorenes Gewebe am Ende der Aufbewahrungsfrist für die Forschung zu spenden.

1. Auftauen von kryokonserviertem Eierstockgewebe

  1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit fünf Auftaulösungen vor. Die erste Vertiefung enthält 5 ml Kryoprotektivlösung, bestehend aus Leibovitz-15-Medium, 0,1 mol/l Saccharose, 1,5 mol/l Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1 % humanem Serumalbumin (HSA). Die nächsten Vertiefungen enthalten 5 ml Leibovitz-15-Medium mit abnehmenden Konzentrationen des Kryoprotektionsmittels: 1 mol/l, 0,5 mol/l und 2 x 0 mol/l DMSO.
    HINWEIS: Die Kryoprotektivlösung kann je nach Protokoll, das in der Fruchtbarkeitsklinik verwendet wird, unterschiedlich sein.
  2. Entnehmen Sie eine Durchstechflasche mit einem kortikalen Fragment der Eierstöcke aus flüssigem Stickstoff unter Einhaltung der Sicherheitsvorschriften (Kryohandschuhe, Schutzbrille und geschlossene Schuhe) und bewahren Sie das Röhrchen 30 s lang bei Raumtemperatur (RT) auf.
  3. Weichen Sie das Fläschchen 2 Minuten lang bei RT unter leichtem Rühren in doppelt destilliertem Wasser ein, bevor Sie das Fläschchen unter einer vertikalen Haube öffnen und direkt in die erste Vertiefung der 6-Well-Platte (auf Eis) überführen.
  4. Das Fragment wird nacheinander in jede Vertiefung der 6-Well-Platte überführt, wobei jedes Fragment abnehmende Konzentrationen von Kryoprotektivum in 5 ml Leibovitz-15-Medium enthält. Bewegen Sie das Gewebe in jedem Medium 5 Minuten lang vorsichtig (auf Eis).

2. Isolierung der Follikel

HINWEIS: Alle Experimente werden mit RNase-freien Materialien und unter einer vertikalen Haube durchgeführt.

  1. Das aufgetaute Gewebe wird in eine 2 mm große, gerasterte Petrischale überführt, die mit 10 ml Präpariermedium (Leibovitz-15-Medium, Natriumpyruvat [2 mmol/l], L-Glutamin [2 mmol/l], HSA [0,3 %], Penicillin G [30 μg/ml] und Streptomycin [50 μg/ml]) gefüllt ist. Passen Sie die Größe des Gewebes bei Bedarf mit einem Skalpell an.
    HINWEIS: Je nach klinischem Protokoll kann die Größe des gefrorenen Gewebes zwischen 8 mm x 4 mm x 1 mm und 4 mm x 2 mm x 1 mm variieren. Für dieses Protokoll wurden zwei Streifen von 4 mm x 2 mm x 1 mm verwendet.
  2. Stapeln Sie die drei Teile des Gewebeschneiders, legen Sie das Fragment zwischen die beiden Blöcke und schneiden Sie das Fragment mit einer Klinge in zwei Hälften, indem Sie durch die Blöcke gleiten, um zwei Fragmente von 0,5 mm Dicke zu erhalten.
  3. Verwenden Sie den Gewebezerkleinerer, um das Fragment zu schneiden und kleinere Stücke zu erhalten. Schneiden Sie die restlichen Stücke bei Bedarf manuell mit einem Skalpell ab, bis das Gewebe vollständig zerbrochen ist.
  4. Übertragen Sie das fragmentierte Gewebe in eine gerasterte Petrischale, die mit 7 ml Verdauungsmedium gefüllt ist (Nährmedium [McCoy's 5A-Medium, 3 mmol/l Glutamin, 0,1 % HSA, 30 μg/ml Penicillin G, 50 μg/ml Streptomycin, 2,5 μg/ml Transferrin, 4 ng/ml Selen und 50 μg/ml Ascorbinsäure], ergänzt mit 0,2 % Kollagenase und 0,02 % DNase).
  5. Stellen Sie die Schale bei 5% CO2 und 37 °C in den Inkubator. Nehmen Sie alle 10 Minuten die Petrischale aus dem Inkubator und spülen Sie das Gewebe durch Auf- und Abpipettieren mit einer 1-ml-Pipette.
  6. Nach 45-minütiger Inkubation im Verdauungsmedium wird die Schale unter ein Stereomikroskop mit einem Vergrößerungsbereich von 5x-6,3x gestellt und die Follikel mit einer Mikrokapillarpipette entnommen. Wählen Sie die interessierenden Follikel aus und isolieren Sie sie, indem Sie sie mit einer Mundpipette aufsaugen.
    Anmerkungen: Das Pipettieren mit dem Mund sollte vorsichtig durchgeführt werden, um Materialverlust in das Rohr und Verunreinigungen zu vermeiden.
  7. Wenn die Follikel in einem Stück Kortex stecken bleiben, isolieren Sie sie mechanisch mit zwei 27-G-Spritzen, indem Sie die Rinde mit der Spitze der Spritzen abreißen, um die Follikel aus dem Stroma zu lösen.
    Anmerkungen: Berühren Sie die Follikel nicht mit den Spritzen, um sie nicht zu beschädigen.
  8. Übertragen Sie die Follikel mit der Mikrokapillare in eine 4-Well-Platte, die Tropfen von 15 μl des kalibrierten Nährmediums enthält, bedeckt mit 500 μl Ölkultur (1 bis 10 Follikel pro Tropfen). Dieser Schritt erhält die Lebensfähigkeit der Follikel während des Entnahmeprozesses. Spülen Sie die Follikel am Ende des Eingriffs zweimal für jeweils 5 s in zwei Tropfen von 15 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bedeckt mit 500 μl Ölkultur (auf Eis).
  9. Sammeln Sie 20 Follikel mit einer minimalen Menge PBS mit der Mundpipette (maximal 10 μl) in einem leeren Röhrchen und bewahren Sie das Röhrchen auf Eis auf.
    HINWEIS: Für die RNA-Stabilität ist es entscheidend, die Schritte 2.8 und 2.9 auf Eis durchzuführen. Etwa 20 Follikel (<75 μm) werden benötigt, um genügend RNA für die Standard-RT-qPCR (SYBR Green) zu haben.
  10. Nach maximal 90 Minuten Inkubation im Verdauungsmedium wird die enzymatische Reaktion gestoppt, indem ein Überschuss an kalter (4 °C) Blockierlösung (7,5 ml) in die Petrischale gegeben wird, die aus einem Nährmedium besteht, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) angereichert ist.
    Anmerkungen: Die Blockierlösung kann hinzugefügt werden, sobald der Experimentator beobachtet, dass Follikel auf der Platte haften oder Follikel beschädigt werden (asymmetrische Form oder dunklere Follikel). Es wird empfohlen, die Follikelisolierung innerhalb eines Zeitraums von maximal 2,5 Stunden durchzuführen, um eine Follikelschädigung zu vermeiden, und die RNA-Extraktion sofort nach der Isolierung durchzuführen.

3. RNA-Extraktion

HINWEIS: Die RNA-Extraktion wird gemäß den Anweisungen durchgeführt, die mit einem RNA-Extraktionskit geliefert werden, indem die Elutionsvolumina angepasst werden.

  1. Suspendieren Sie die isolierten Follikel, indem Sie 100 μl der mit dem RNA-Extraktionskit gelieferten Lyselösung in das Röhrchen mit den Follikeln unter einer chemischen Haube geben und mit hoher Geschwindigkeit (2.500 U/min) vortexen, um die Struktur der Follikel aufzubrechen. Geben Sie 50 μl Ethanol (100 %) in das Röhrchen und wirbeln Sie kurz mit hoher Geschwindigkeit.
    Anmerkungen: Da der Lysepuffer 2-Mercaptoethanol und Thiocyansäure enthält, muss dieser Schritt mit Vorsicht unter einer chemischen Haube durchgeführt werden.
  2. Das Gesamtvolumen des Röhrchens (ca. 160 μl) wird in eine Mikrofilterpatronenanordnung übertragen, die aus einer Säule und einem Sammelröhrchen besteht, und es wird 10 s lang bei 16.363 x g bei 4 °C zentrifugiert. Waschen Sie die Säule mit 180 μl Waschlösung 1, die im Lieferumfang enthalten ist, und zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 s lang bei 16.363 x g bei 4 °C.
  3. Geben Sie 180 μl der mit dem Kit gelieferten Waschlösung 2/3 in die Säule und zentrifugieren Sie sie 10 s lang bei 16.363 x g bei 4 °C. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus. Zentrifugieren Sie das Röhrchen ein letztes Mal für 1 Minute, um den Filter zu trocknen, und legen Sie ein neues Auffangröhrchen unter die Kartusche.
  4. Führen Sie die Elution der Nukleinsäuren in zwei Schritten durch:
    1. Zuerst werden 8 μl warme Elutionslösung (75 °C) in den Filter gegeben, 1 Minute bei RT gewartet und 30 s bei 16.363 x g bei 4 °C zentrifugiert.
    2. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 7 μL Elutionslösung.
      Anmerkungen: Das Röhrchen mit den eluierten Nukleinsäuren muss auf Eis aufbewahrt werden. Um eine DNA-Kontamination zu vermeiden, wird ein zusätzlicher Schritt des DNA-Abbaus dringend empfohlen - Schritt 3.5.
  5. Inkubieren Sie das Röhrchen mit 2 IE DNase und 1x DNase-Puffer für 20 min bei 37 °C. Blockieren Sie die enzymatische Aktivität mit einem 1/10 DNase-Inaktivierungsreagenz für 2 min bei RT.
  6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 1,5 min lang bei 16.363 x g bei 4 °C. Sammeln Sie schließlich die Suspension mit der RNA und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen.
  7. Beurteilen Sie die Menge der in der Probe vorhandenen RNA mit einem Spektralphotometer (NanoDrop 2000 Software > Nukleinsäure > RNA). Verwenden Sie 1 μl Elutionslösung als Blind und messen Sie die RNA-Menge, die aus isolierten Follikeln extrahiert wurde, mit 1 μl Lösung.
  8. Überprüfen Sie das Verhältnis 260/280 auf RNA-Reinheit (ca. 2,0). Lagern Sie die Probe bei −80 °C oder transkribieren Sie sie direkt, um eine RT-qPCR durchzuführen.
    HINWEIS: Um die RNA-Integrität zu beurteilen, kann die Probe vor oder nach dem Einfrieren bei −80 °C mit einem hochauflösenden automatisierten Elektrophoresesystem prozessiert werden. In dieser Arbeit wurde nach der Retrotranskription die RT-qPCR mit folgendem Zyklus durchgeführt:
    Haltebühne mit 20 s bei 50 °C und 10 min bei 95 °C
    40 PCR-Zyklen à 15 s bei 95 °C und 1 min bei 60 °C
    Schmelzkurvenstufe mit 15 s bei 95 °C, 1 min bei 60 °C, 30 s bei 95 °C und 15 s bei 60 °C

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Ergebnisse

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Mit diesem Isolationsverfahren kann der Experimentator Follikel aus der Stromaumgebung entnehmen, um spezifische Genexpressionsanalysen durchzuführen. Anhand der Größe und Morphologie der Follikel ist es möglich, die verschiedenen Stadien der Follikulogenese zu unterscheiden. Der Experimentator kann die interessierenden Follikel entsprechend ihrer Größe mit einer angepassten Mikrokapillarpipette auswählen. Durch die Verwendung einer Mikrokapillare von maximal 75 μm ist es möglich, primordiale und primäre Follikel von sek...

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Diskussion

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Die Kryokonservierung von Eierstockgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Fruchtbarkeit von Krebspatientinnen zu erhalten. In der Klinik wird aufgetautes kortikales Gewebe nach der Remission wieder in die Patientin transplantiert, was die Wiederaufnahme der Eierstockfunktion und der Fruchtbarkeit ermöglicht19,20. Neben der klinischen Verwendung können am Ende der Lagerzeit auch verbleibende Eierstockfragmente für die Forschung gespendet werden, um die M...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch einen Excellence of Science (EOS) Grant (ID: 30443682) unterstützt. I.D. ist assoziierter Forscher am Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 mm gerasterte PetrischaleCorning430196
2100 BioanalysegerätAgilentG2939BA
2100 Expert SoftwareAgilentVersion B.02.08.SI648
4-Well-PlatteSigma AldrichD6789
6-Well-PlatteCarl Roth  EKX5.1
Agilent Gesamt-RNA 6000 Pico-KitAgilent5067-1513
AscorbinsäureSigma AldrichA4403
Aspirator-Röhrchenbaugruppen für MikrokapillarpipettenSigma AldrichA5177
ZentrifugeEppendorf5424R
Kollagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript reverse TranskriptasePromegaA5003
HSACAF DCF DCFLC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-GlutaminSigma AldrichG7513
McCoy' s 5A + Bikarbonat + HepesLifeTechnologies12330-031
McIlwain GewebehackerStoelting51350
Mikrokapillare RI EZ-Spitzen 200 & Mikrokapillare mCooperSurgical7-72-2200/1
Mikrokapillare RI EZ-Spitzen 75 & Mikrokapillare mCooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c BediensoftwareThermoFisherVersion 1.6
NanoDrop SpektralphotometerThermoFisher2000/2000c
Penicillin GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR grüner MastermixThermoFisherA46109
Primer: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primer: HPRTF: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primer: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3ThermoFisherA33779
RNAqueous-micro total RNA IsolationskitThermoFisherAM1931
SelenSigma AldrichS9133
NatriumpyruvatSigma AldrichS8636
StereomikroskopNikonSMZ800
StreptomycinsulfatSigma AldrichS1277
SaccharoseSigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Serie II  wasserummantelt CO2  InkubatorenThermoFisher3110
Thomas Stadie-Riggs Tissue SlicerThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

Referenzen

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FollikelisolationEierstockgewebeenzymatischer VerdauGranulosazellenRNA ExtraktionRT qPCROozytenisolationFollikulogenese

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