Methodenartikel

Genexpressionsanalysen in humanen Follikeln

DOI:

10.3791/64807

17. Februar 2023

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir ein Protokoll, das beschreibt, wie menschliche Ovarialfollikel aus gefrorenem und aufgetautem kortikalem Gewebe isoliert werden können, um Genexpressionsanalysen durchzuführen.

Zusammenfassung

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Der Eierstock ist ein heterogenes Organ, das sich aus verschiedenen Zelltypen zusammensetzt. Um die molekularen Mechanismen während der Follikulogenese zu untersuchen, kann die Lokalisierung von Proteinen und Genexpression auf fixiertem Gewebe durchgeführt werden. Um die Genexpression in einem menschlichen Follikel richtig beurteilen zu können, muss diese komplexe und empfindliche Struktur jedoch isoliert werden. Daher wurde ein angepasstes Protokoll entwickelt, das zuvor von Woodruffs Labor beschrieben wurde, um die Follikel (die Eizelle und die Granulosazellen) von ihrer Umgebung zu trennen. Das kortikale Gewebe der Eierstöcke wird zunächst manuell bearbeitet, um kleine Fragmente mit zwei Werkzeugen zu erhalten: einem Gewebeschneider und einem Gewebezerkleinerer. Das Gewebe wird dann mit 0,2 % Kollagenase und 0,02 % DNase für mindestens 40 min enzymatisch verdaut. Dieser Aufschlussschritt wird bei 37 °C und 5 % CO2 durchgeführt und von einem mechanischen Pipettieren des Mediums alle 10 min begleitet. Nach der Inkubation werden die isolierten Follikel manuell mit einer kalibrierten Mikrokapillarpipette unter mikroskopischer Vergrößerung entnommen. Wenn noch Follikel in den Gewebestücken vorhanden sind, wird der Eingriff mit einer manuellen Mikrodissektion abgeschlossen. Die Follikel werden auf Eis in einem Nährmedium gesammelt und zweimal in Tröpfchen phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült. Dieser Verdauungsvorgang muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine Verschlechterung der Follikel zu vermeiden. Sobald die Struktur der Follikel beeinträchtigt zu sein scheint oder nach maximal 90 Minuten, wird die Reaktion mit einer 4 °C heißen Blockierlösung gestoppt, die 10 % fötales Kälberserum enthält. Es sollten mindestens 20 isolierte Follikel (mit einer Größe unter 75 μm) entnommen werden, um nach der RNA-Extraktion eine ausreichende Menge an Gesamt-RNA für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RT-qPCR) zu erhalten. Nach der Extraktion erreicht die Quantifizierung der Gesamt-RNA aus 20 Follikeln einen Mittelwert von 5 ng/μL. Die gesamte RNA wird dann in cDNA retrotranskribiert und die interessierenden Gene werden mittels RT-qPCR weiter analysiert.

Einleitung

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Der Eierstock ist ein komplexes Organ, das aus funktionellen und strukturellen Einheiten besteht, einschließlich der Follikel innerhalb der Hirnrinde und des Stromas. Die Follikulogenese, der Prozess der Follikelaktivierung, des Wachstums und der Reifung von einem ursprünglichen Ruhezustand zu einem reifen Follikel, der befruchtet werden kann und die frühe Embryonalentwicklung unterstützt, wird in der Forschung umfassend untersucht1. Die Entschlüsselung der Mechanismen, die dieses Phänomen antreiben, könnte die Fruchtbarkeitsversorgung von Frauen verbessern2. Analysen an fixiertem menschlichem Gewebe ermöglichen die Beur....

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Protokoll

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Dieses Projekt wurde von der Ethikkommission des Erasme-Krankenhauses (Brüssel, Belgien) genehmigt. Die in dieses Protokoll eingeschlossene Patientin unterzog sich vor der Chemotherapie im Jahr 2000 einer Kryokonservierung des Eierstockgewebes (OTC) zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Die Patientin unterschrieb eine schriftliche Einverständniserklärung, ihr verbleibendes gefrorenes Gewebe am Ende der Aufbewahrungsfrist für die Forschung zu spenden.

1. Auftauen von kryokonserviertem Eierstockgewebe

  1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit fünf Auftaulösungen vor. Die erste Vertiefung enthält 5 ml Kryoprotektivlösung, beste....

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Ergebnisse

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Mit diesem Isolationsverfahren kann der Experimentator Follikel aus der Stromaumgebung entnehmen, um spezifische Genexpressionsanalysen durchzuführen. Anhand der Größe und Morphologie der Follikel ist es möglich, die verschiedenen Stadien der Follikulogenese zu unterscheiden. Der Experimentator kann die interessierenden Follikel entsprechend ihrer Größe mit einer angepassten Mikrokapillarpipette auswählen. Durch die Verwendung einer Mikrokapillare von maximal 75 μm ist es möglich, primordiale und primäre Follikel von sek.......

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Diskussion

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Die Kryokonservierung von Eierstockgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Fruchtbarkeit von Krebspatientinnen zu erhalten. In der Klinik wird aufgetautes kortikales Gewebe nach der Remission wieder in die Patientin transplantiert, was die Wiederaufnahme der Eierstockfunktion und der Fruchtbarkeit ermöglicht19,20. Neben der klinischen Verwendung können am Ende der Lagerzeit auch verbleibende Eierstockfragmente für die Forschung gespendet werden, um die M.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch einen Excellence of Science (EOS) Grant (ID: 30443682) unterstützt. I.D. ist assoziierter Forscher am Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 mm gerasterte PetrischaleCorning430196
2100 BioanalysegerätAgilentG2939BA
2100 Expert SoftwareAgilentVersion B.02.08.SI648
4-Well-PlatteSigma AldrichD6789
6-Well-PlatteCarl Roth  EKX5.1
Agilent Gesamt-RNA 6000 Pico-KitAgilent5067-1513
AscorbinsäureSigma AldrichA4403
Aspirator-Röhrchenbaugruppen für MikrokapillarpipettenSigma AldrichA5177
ZentrifugeEppendorf5424R
Kollagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript reverse TranskriptasePromegaA5003
HSACAF DCF DCFLC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-GlutaminSigma AldrichG7513
McCoy' s 5A + Bikarbonat + HepesLifeTechnologies12330-031
McIlwain GewebehackerStoelting51350
Mikrokapillare RI EZ-Spitzen 200 & Mikrokapillare mCooperSurgical7-72-2200/1
Mikrokapillare RI EZ-Spitzen 75 & Mikrokapillare mCooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c BediensoftwareThermoFisherVersion 1.6
NanoDrop SpektralphotometerThermoFisher2000/2000c
Penicillin GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR grüner MastermixThermoFisherA46109
Primer: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primer: HPRTF: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primer: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3ThermoFisherA33779
RNAqueous-micro total RNA IsolationskitThermoFisherAM1931
SelenSigma AldrichS9133
NatriumpyruvatSigma AldrichS8636
StereomikroskopNikonSMZ800
StreptomycinsulfatSigma AldrichS1277
SaccharoseSigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Serie II  wasserummantelt CO2  InkubatorenThermoFisher3110
Thomas Stadie-Riggs Tissue SlicerThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

Referenzen

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  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

FollikelisolationEierstockgewebeenzymatischer VerdauGranulosazellenRNA ExtraktionRT qPCROozytenisolationFollikulogenese

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