Methodenartikel

Screening-Strategien für kleine Moleküle von der Identifizierung von Leitstrukturen bis zur Validierung

DOI:

10.3791/64811

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20. Januar 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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DISKUTIERTE ARTIKEL:

Festa, F., Labaer, J. Kinase-Inhibitor-Screening in selbstorganisierten humanen Protein-Microarrays. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 152, e59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. NMR-basierte Aktivitätsassays zur Bestimmung der Verbindungshemmung, der IC50-Werte, der künstlichen Aktivität und der Ganzzellaktivität von Nukleosid-Ribohydrolasen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 148, e59928 (2019).

Gao, S. et al. Ein Hochdurchsatz-Assay zur Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisiertes phänotypisches Profiling von Caenorhabditis elegans. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 145, E59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Verwendung von High-Content-Bildgebung zur Quantifizierung der Zielbindung in adhärenten Zellen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 141, E58670 (2018).

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Ein Hochdurchsatz-Luziferase-Assay zur Bewertung der Proteolyse der Einzelumsatzprotease PCSK9. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 138, E58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Verwendung von Zebrafischmodellen menschlicher Influenza-A-Virusinfektionen zum Screening antiviraler Medikamente und zur Charakterisierung der Immunzellreaktionen des Wirts. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 119, E55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Bewertung der Resistenz gegen Tyrosinkinase-Inhibitoren durch eine Abfrage von Signaltransduktionswegen durch Antikörperarrays. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 139, e57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. Eine Semi-Hochdurchsatz-Adaption des NADH-gekoppelten ATPase-Assays für das Screening von niedermolekularen Inhibitoren. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Entwicklung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch REPLACE: Anwendung auf das Design und die Entwicklung von nicht-ATP-kompetitiven CDK-Inhibitoren. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 104, E52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identifizierung von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor-Signalgebung durch das Screening chemischer Inhibitorbibliotheken. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 143, E58946 (2019).

Takakusagi, Y. Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und bioinformatische Analysestrategie für die globale Validierung von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 166, e61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. Hochdurchsatz-Zellprofilierung von zielgerichteten Proteinabbauverbindungen unter Verwendung von HiBiT CRISPR-Zelllinien. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 165, e61787 (2020).

Editorial

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Die Genomik-Revolution hat zu einer großen Menge an Wissen über den Zusammenhang zwischen genetischer Störung und verschiedenen Krankheitsphänotypen geführt1. Dies hat zur Annotation zahlreicher Proteine als potenzielle Angriffspunkte für Medikamente geführt und das Interesse an der Entdeckung und Entwicklung von Verbindungen geweckt, die diese Ziele hemmen2. In diesem Zusammenhang haben sich verschiedene Screening-Strategien als wichtige Ansätze für die Entdeckung von Treffersubstanzen, die Validierung von Zielen, die Messung von Bindungsaffinitäten, Selektivität, Toxizität und In-Zell-Zielbindung sowie für die Reaktivität, Stabilität und pharmakokinetische Eigenschaften von Verbindungen herausgestellt. Diese Sammlung erfasst einige der methodischen Fortschritte in diesem Bereich mit dem Ziel, eine Vielzahl von Strategien vorzustellen, die zum Screening und zur Bewertung der biochemischen und/oder biologischen Aktivität kleiner Moleküle verwendet werden können.

Proteinkinasen stellen eine große Enzymfamilie mit über 500 Mitgliedern dar. Diese Enzyme sind wichtige Regulatoren aller zellulären Prozesse, und ihre Fehlfunktion wurde mit zahlreichen Krankheiten in Verbindung gebracht3. Daher standen sie im Mittelpunkt des intensiven Interesses an der Wirkstoffforschung und damit auch an der Methodenentwicklung. So berichten vier Artikel in dieser Sammlung über Fortschritte in diesem Bereich. Festa et al. beschreiben eine Screening-Plattform für die Entdeckung von Kinase-Inhibitoren, die selbstorganisierte Nukleinsäure-programmierbare Protein-Arrays (NAPPA) verwendet4. Diese Arrays zeigen humane Kinasen in voller Länge an und ermöglichen ein Multiplex-Screening von Verbindungen über eine große Kinasesammlung, wodurch nicht nur die Identifizierung von Treffern, sondern auch die Profilierung der Selektivität ermöglicht wird. Tieman et al. beschreiben eine Phosphoantikörper-Microarray-basierte Methode, die entwickelt wurde, um zellweite Veränderungen des Phosphorylierungsstatus als Auslese der Kinase-Inhibitor-Aktivität zu untersuchen5. Dies kann zu Einblicken in die Art der Signalwege führen, die resistent gegen Hemmung geworden sind, was ein wichtiger Parameter ist, der für das Verständnis des Ansprechens und der Wirksamkeit von Medikamenten relevant ist. Chen et al. beschreiben einen Durchflusszytometrie-Assay zum Screening von Kinase-Inhibitor-Sammlungen zur Identifizierung von Verbindungen, die die Signalübertragung des T-Zell-Rezeptors (TCR) beeinflussen6. Diese Strategie führte zur schnellen Identifizierung von Kinasen, die an der TCR-Signalübertragung beteiligt sind, was auf ihr Potenzial als Ziele für die Entwicklung immuntherapeutischer Medikamente hinweist. Schließlich wird die Aktivität vieler Kinasen durch Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) reguliert, was darauf hindeutet, dass Verbindungen, die auf diese PPIs abzielen, von Interesse sein könnten. Nandha Premnath et al. beschreiben eine Methode namens REPLACE (Replacement with partial ligand alternatives using computational enrichment), die zur Entwicklung von nicht-ATP-kompetitiven PPIs von Kinasen verwendet werden kann, indem Merkmale von Peptidbindern in kleine Moleküle umgewandelt werden, die an derselben Bindungsoberfläche binden7.

Neben Kinasen spielen viele andere Enzyme eine Rolle bei Krankheiten und wurden in der Wirkstoffforschung verfolgt. Daher sind auch Methoden, die für andere Enzyme als Kinasen optimiert sind, von Interesse. Zum Beispiel beschreiben Stockman et al. Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)-basierte Aktivitätsassays, um Inhibitoren von Nukleosid-Ribohydrolasen aus dem Parasiten Trichomonas vaginaliszu entdecken und zu bewerten 8. Diese Assays können auch zur Bestimmung von IC50-Werten verwendet werden. Um nach ATPase-Inhibitoren zu suchen, entwickelten Radnai et al. eine Semi-Hochdurchsatz-Screening-Methode, die ein gekoppeltes Enzym-Assay-Format verwendet, an dem zwei Enzyme (Pyruvatkinase und Laktatdehydrogenase) beteiligt sind, das letztendlich die ATPase-Aktivität in eine intrinsische Fluoreszenz von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) als Messwert übersetzt9. Im Gegensatz zu allen bisher beschriebenen Enzymen, die prozessiv sind und mehrere Schritte katalysieren, handelt es sich bei der Proprotein-Konvertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9) um eine Single-Turnus-Protease, die durch ihr Substrat autoinhibiert wird. Dies macht das Screening auf Inhibitoren von PCSK9 zu einer Herausforderung, und Chorba et al. beschreiben eine zellbasierte Hochdurchsatzmethode, die die PCSK9-Spaltaktivität mit der sezernierten Luciferaseaktivität als Auslesung verknüpft und so ein Screening auf Inhibitorenermöglicht 10.

Neben der Suche nach Verbindungen, die die Aktivität verschiedener Ziele hemmen, sind auch Assays von großem Interesse, die bestätigen, dass die Verbindung ihr beabsichtigtes Ziel in Zellen eingreift. Axelsson et al. beschreiben eine Strategie zur Validierung der Zielbindung in adhärenten Zellen, die auf der Kombination von High-Content-Imaging mit Immunfluoreszenz-Antikörpern und einem zellulären thermischen Shift-Assay (CETSA) basiert11. Dieser Assay verwendet eine isotherme Wärmeherausforderung für Zellen, die mit einer großen Stoffsammlung behandelt wurden, um stabilisierende Verbindungen zu identifizieren. Eine von Riching et al. entwickelte Methode zur Bewertung des Zielengagements und der Aktivität von Degrader-Molekülen verwendet die HiBiT/LgBiT-Markierungstechnologie, um ein lumineszierendes Protein herzustellen und Abbauparameter über eine Abnahme der Lumineszenzzu überwachen 12. Schließlich beschreiben Takakusagi et al. ein Verfahren zur Validierung von Protein-Wirkstoff-Wechselwirkungen, das auf der Verwendung von Phagen-basierten Peptid-Displays basiert, um die Bindung zwischen arzneimittelbindenden Peptidmotiven und kleinen Molekülen zu untersuchen13. Der Peptid-Bildschirm wird mit einer bioinformatischen Analyse kombiniert, um die Zielbindung zu validieren.

Eine weitere Ebene der Validierung kleiner Moleküle ist die Charakterisierung ihrer Effekte in Tiermodellen. Diese Sammlung umfasst zwei solcher Methoden, eine, die Zebrafischmodelle (Danio rerio) der menschlichen Influenza-A-Virusinfektion verwendet, um die Wirksamkeit von Verbindungen mit antiviraler Aktivität sowie die Immunantwort des Wirts zu bewerten14, und eine andere, die Caenorhabditis elegans als Modell für die Profilierung der Toxizität von Verbindungen verwendet15. Beide Studien unterstreichen den Bedarf an optimierten Methoden, mit denen Wirksamkeit und Toxizität in vivo bewertet werden können.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wirkstoffforschung und -entwicklung gewaltige Prozesse mit zahlreichen Engpässen, Herausforderungen und einer hohen Wahrscheinlichkeit des Scheiterns sind. Darüber hinaus erfordert die anhaltende Krankheitslast, sei es im Bereich der Infektionskrankheiten, wo die Zahl der arzneimittelresistenten Erreger alarmierend zugenommen hat, oder in den Bereichen der zunehmenden Prävalenz chronischer Krankheiten und Krankheiten, die mit der alternden Bevölkerung verbunden sind, unsere konzentrierte Aufmerksamkeit und unser Handeln. Diese Sammlung stellt mehrere Methoden vor, die darauf abzielen, die Entdeckung, Validierung und Charakterisierung von Arzneimitteln zu beschleunigen. Für die Zukunft erwarten wir weitere Innovationen in diesem Bereich, insbesondere solche, die darauf abzielen, den Durchsatz des Screenings zu verbessern, die Vielfalt der chemischen Bibliotheken zu erhöhen und In-vivo-Modelle zu entwickeln, die mit dem Hochdurchsatz-Screening (HTS) kompatibel sind. Darüber hinaus könnten Arbeitsabläufe, die einen ganzheitlichen Überblick über Wirksamkeit, Selektivität, Spezifität, Wirksamkeit und Toxizität in einem schnelleren und kleineren Maßstab bieten, besonders hilfreich sein.

Offenlegungen

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M.K. ist ein bezahlter Berater für Life-Science-Redakteure.

Danksagungen

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M.K. wird teilweise vom NCI T32 CA236754 unterstützt.

Referenzen

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  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

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Schlagwörter

Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

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