Physiologische Charakterisierung des Korallenholobionten mit einem neuen Mikro-Respirometrie-Tool

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines Mikro-Respirometrie-Systems, mit dem die physiologischen Merkmale des Korallenholobionten untersucht werden können.

Zusammenfassung

Die Stoffwechselaktivität, definiert als die Summe der organismischen Prozesse, die Energie beinhalten, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Funktion und Evolution des Lebens auf der Erde. Die Messung der Stoffwechselraten von Organismen steht daher im Mittelpunkt der Erklärung des physiologischen Zustands von Organismen, ihrer ökologischen Rolle und der Auswirkungen von Umweltveränderungen auf Arten in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen. An Korallenriffen wurden Messungen des Stoffwechsels verwendet, um die Symbiosefunktion zwischen Korallen und ihren obligaten Algensymbionten (Symbiodiniaceae) zu quantifizieren und zu bewerten, wie sich Umweltstressoren, einschließlich des Klimawandels, auf die Gesundheit der Korallen auswirken. Trotz dieser Bedeutung fehlen Methoden und damit Daten zur Messung der Stoffwechselrate bei Korallennachkommen, wahrscheinlich aufgrund ihrer geringen Größe. Um diese Lücke zu schließen, zielte diese Studie darauf ab, einen maßgeschneiderten Aufbau zur Messung der Atmung kleiner (Millimeterbereich) Meerestierökologien zu entwickeln. Diese geringen Kosten und die einfache Einrichtung sollten eine verbesserte Messung der Stoffwechselrate ermöglichen. Dies wird für die angewandte ökologische Forschung, die die sexuelle Produktion von Korallen zur Wiederherstellung von Riffen nutzt, von entscheidender Bedeutung sein.

Einleitung

Die Atmung ist eine kritische biologische Messung, die die gesamte Stoffwechselaktivität eines Organismus signalisiert, aber wie andere kritische Merkmale (Wachstum) bei kleinen Organismen schwer zu messen^{ist 1}. Atmung kann als Oxidation organischer Moleküle durch die Verwendung von Sauerstoff definiert werden. Dieser Prozess erzeugt die chemische Energie, die für die Zellfunktion (d. h. den Stoffwechsel) benötigt wird, die für das Überleben von Organismen unerlässlich ist. Alternativ führt der anaerobe Stoffwechsel zu einer Sauerstoffschuld². Die Atemfrequenz kann mit Hilfe von Optoden bestimmt werden, die den Verbrauch (und damit die Abnahme) der Sauerstoffkonzentration im Laufe der Zeit in einer geschlossenen Kammer messen, eine Praxis, die allgemein als Respirometrie^{bekannt ist 3}. Da die meisten Organismen keinen Sauerstoff speichern, kann die Stoffwechselrate durch die direkte Korrelation zwischen Atmung und Kohlenstoffverbrauch abgeleitet werden. Aus diesem Grund können die Atemfrequenzen in den täglichen Kohlenstoffverbrauch umgewandelt werden, was wichtige Stoffwechselfunktionen wie Wachstum, Fortpflanzung und die Fähigkeit, die metabolische Homöostase in Zeiten von Umweltstress aufrechtzuerhalten, informiert ^4,5, einschließlich Hitzewellenbedingungen, die im Allgemeinen zu Stress oder Bleiche bei Korallen führen.

Die Korallenriffe gehen weltweit immer schneller zurück. Das Korallentier beherbergt ein Konsortium von Partnern (darunter Dinoflagellaten-Symbiodiniaceae, Pilze, Bakterien und Viren), die zusammen als "Holobiont" bezeichnet ^werden6. Mit steigenden Meerestemperaturen stehen Korallen und damit Korallenriffe unter zunehmendem Überlebensdruck, da hohe Temperaturen zum Verlust der Dinoflagellaten-Symbiodiniaceae (im Folgenden Symbionten) führen, ein Phänomen, das als Bleiche bekannt ist⁷. Viele Nährstoffe sind für Korallen in oligotrophen tropischen Gewässern sonst nicht verfügbar, darunter anorganischer Stickstoff und Phosphor⁸. Um damit fertig zu werden, bilden Korallen eine obligate Nahrungssymbiose mit ihren Dinoflagellaten-Symbionten (Symbiodiniaceae), die den Großteil der Nährstoffe liefern, die der Korallenwirt zum Überleben benötigt und seine Kalziumkarbonat-Skelette ablagert⁹. Eine funktionierende Symbiose kann durch ein hohes Maß an Kohlenstoffteilung zwischen den Partnern gekennzeichnet sein^10,11, und die Regulation der Symbiose beinhaltet eine dynamische Homöostase¹².

Bei Hitzestress werden diese dynamische Regulation und Kommunikation gestört, was zu Dysbiose und Bleichen führt (siehe Referenz¹³). Stoffwechselmessungen wie Photosynthese und Atmung haben daher das Potenzial, sowohl den gesunden als auch den unregulierten, dysbiotischen Zustand von Korallen aufzuklären, und die genaue Messung dieser Prozesse über die Ontogenese hinweg ist entscheidend für das Verständnis der Funktionsweise von Organismen. Dies ist besonders wichtig, da die Häufigkeit und das Ausmaß von Massenbleichen zunehmen und das Potenzial haben, Veränderungen in der Nährstoffverteilung der Symbionten zu beeinflussen, bei denen der Kohlenstofftransfer mit steigenden Temperaturen abnimmt¹⁴. Dies könnte auf gesteuerte Mechanismen des Symbionten zurückzuführen sein, die Nährstoffe binden, oder auf harte physiologische Kompromisse (erhöhte thermische Toleranz, aber eine Verringerung des Überlebens des Wirts 15,16,17). Störungen in der Symbiose können sowohl vom Symbionten als auch vom Wirt herrühren, obwohl ein führender Faktor wahrscheinlich die zelluläre Fehlfunktion des Symbionten^{ist 18}. Stress durch steigende Meerwassertemperaturen destabilisiert diese Symbiose jedoch; Die Kohlenstoffteilung vom Symbionten zum Wirt ist verringert^19,20, und es kann zu einem Hungertod der Korallen kommen. Dies kann sich in verminderten Lipid- und Kohlenhydratspeichern in Korallen aufgrund einer erhöhten Wirtsnutzung ("erhöhter Katabolismus von fixiertem Kohlenstoff") widerspiegeln, wahrscheinlich aufgrund einer verminderten gemeinsamen Nutzung durch Symbionten¹¹. Neben dem Beitrag der Photosynthese und der Atmung der Symbionten der Korallen ist die Atmung des Korallentieres ein wichtiges Maß, um die Gesundheit der Korallen, die Auswirkungen der Bleiche und des Nährstoffaustauschs zwischen diesen Partnern und das Wachstum des Holobionten zu verstehen, ein Phänotyp, der für das Überleben von Umweltveränderungen relevant ist ^8,21,22. Da viele Korallen symbiotisch sind, ist die Verwendung der Respirometrie zur Charakterisierung der Photosynthese zusätzlich zur Atmung besonders nützlich, um das P:R-Verhältnis zu kontextualisieren und zu verstehen, ob die Symbiose stabil ist oder nicht (z. B. Referenz²³).

Umweltveränderungen führen daher zu Verschiebungen im Energiehaushalt der Koralle und ihrer Symbionten, was zu Unterschieden im Wachstum führt¹⁴. Um damit fertig zu werden, kann der Korallenwirt die Atmung und den Lipidverbrauch erhöhen, um seinen Stoffwechselbedarf zu decken; Hitzestress kann die Nettoproduktivität aufgrund dieser erhöhten Atmung um 60 % verringern¹⁴, gemessen an einer Änderung des gelösten Sauerstoffs. Symbiodiniaceae können auch die Stickstoffassimilation und Kohlenstoffretention erhöhen^14,24 und diese Reserven dann nutzen, um Energie auf ihre eigenen Reparatur- und Schutzmechanismen zu verlagern^25,26. Das Gleichgewicht von N und C ist wichtig für die Regulierung des Wachstums und insbesondere von P²⁷, was sich als dynamische Regulation der Symbiontenhäufigkeit manifestieren kann. Tatsächlich deuten Beweise, die von Korallen in großen Riffgebieten (>1.000 km) gesammelt wurden, darauf hin, dass Wirte die Fähigkeit haben, das Wachstum von Symbionten durch die Regulierung von P zu begrenzen, obwohl dies je nach Korallenart variiert²⁷.

Zusammengenommen deuten diese Studien auf einen Gewinn an Hitzetoleranz mit einer gleichzeitigen Abnahme der Produktion oder Translokation von Nährstoffen (d.h. der Neigung zur Symbiose) aufgrund von Umweltveränderungen hin. Leistungsstarke Methoden für Einzeljuvenile, wie z. B. die Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs durch Mikrorespirometrie, sollten daher verwendet werden, um die grundlegenden Mechanismen in Bezug auf den Stoffwechsel zu verstehen, und dann auf Konservierungsfragen wie das Verständnis des Erwerbs von Hitzetoleranz angewendet werden. Dies wird hier als Mikro-Respirometrie-Werkzeug für physiologische Messungen vorgestellt, das die Ernährungsbeziehung zwischen Korallenjungtieren und ihren Algensymbionten abfragen soll, aber auch für andere kleine Meeresorganismen geeignet ist.

Die Verwendung oder Produktion von Sauerstoff durch Organismen kann gemessen werden, indem sie in einzelne, hermetisch abgeschlossene Respirometriekammern oder "Respirometer" (nachstehend "Respirometer" (nachstehend "Respirometer" genannt) gelegt werden, in denen die Sauerstoffveränderung mit Hilfe von Optoden^{gemessen wird 3}. Optoden sind Sonden, die die Sauerstoffkonzentration mithilfe von Lichtimpulsen messen, und die Protokollierung von Messungen im Laufe der Zeit ermöglicht die Berechnung von Atmungs- und/oder Photosyntheseraten. In der Praxis ähnelt die Messung der Atmung der Messung der Photosynthese in Korallen, nur dass die Korallen in völliger Dunkelheit inkubiert werden. Subtrahiert man die gesamte tägliche Atmung der Korallen und Symbionten von der gesamten täglichen Photosynthese, so ergibt sich ein Sauerstoffunterschied (Sauerstoffdelta)^2,3. Im Allgemeinen verbrauchen Organismen mehr Sauerstoff als sie produzieren, was zu einem Defizit führt. Dies kann in Kohlenstoffäquivalente umgerechnet werden, da Sauerstoff und Kohlenstoff in einem festen Verhältnis^{verbraucht werden 2}. Der Kohlenstoffüberschuss kann von der Koralle für das Wachstum, die Schleimsynthese und -vermehrung sowie andere wichtige Stoffwechselbedürfnisse verwendet werden¹².

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikrorespirationsmethode (Abbildung 1), die zur Messung der Atmungsraten (R) für einzelne Korallenjungtiere unter Verwendung eines maßgeschneiderten 1,5-ml-Glaskammerdesigns (Fläschchen mit GL25-Gewinde und 20 mm Höhe, mit Stoßkante/Grat, flachem Bodenrand und Schraubverschluss mit Loch; siehe Materialtabelle) verwendet wurde, das mit 0,5 μm gefiltertem Meerwasser gefüllt war. Faseroptische Optoden (siehe Materialtabelle) wurden durch ein Loch in der Seite des Deckels in jede Kammer eingeführt. Jede einzelne Koralle wurde über einer durchströmbaren Rührplattenplattform mit hartem Netz über einem magnetischen Rührstab befestigt, um eine ausreichende Durchmischung des Wassers in der Kammer zu gewährleisten. Im repräsentativen Beispiel hier wurden zwei Kontrollen oder "Leerzeichen" (Kammern, die bis auf das Vorhandensein der Probe identisch waren) gleichzeitig mit den drei Kammern der Replikatprobe gemessen, da mehrere Controller gleichzeitig liefen. Das Setup-Beispiel (Abbildung 2) zeigt jedoch nur die Verwendung von vier Kanälen. Dies kann durch mehrere Controller und mehrere Durchflussständer erhöht werden. Die Temperatur konnte in diesem System auch geregelt werden, indem jede Kammer in ein maßgeschneidertes Wasserbad mit voreingestellten Wassertemperaturen (27 °C für die Steuerung oder 31 °C für die hohe Temperaturbelastung in den Beispieldaten hier) mit einem Umlaufdurchströmungssystem (kontinuierlicher, sanfter Durchfluss mit 75 l/h) getaucht wurde. Die Rührplattenplattform und die Rührplatte mit Zahnrädern können beliebig groß sein und so groß oder so klein wie nötig gefertigt werden, um die Anzahl der Glaskammern aufzunehmen. In diesem Beispiel waren die Plattform und die Platte etwa 34 cm x 26 cm x 3 cm groß (Materialtabelle). Die Kalibrierung der Optoden wurde vor jedem Lauf mit zwei Standardlösungen durchgeführt, die eine Sauerstoffsättigung von 0 % und 100 % bei der entsprechenden Wassertemperatur und dem entsprechenden Salzgehalt für diese Versuchsanordnung darstellen.

Protokoll

1. Aufbau von Geräten und Korallen in den Atemkammern

HINWEIS: Fortpflanzungsfähige Korallen (d. h. Korallen mit rosa pigmentierten Ei-/Spermienbündeln, die an fragmentierten Zweigen der Acropora tenuis-Kolonien sichtbar waren) wurden am Tag eines Vollmonds im Oktober 2018 aus dem Riff von Magnetic Island (19° 6.249'S; 146° 51.728'E) entfernt, gesammelt und zum Korallenlaichen ins Labor gebracht. wo junge Korallen gezüchtet und gezüchtet wurden.

1. Verbinden Sie am Tag der Messung die beiden Wasserbadplatten mit blauem Polyrohr und Verbindern (siehe Materialtabelle; Abbildung 1 [5], Abbildung 2A,B). Diese dienen als Inkubatoren, nachdem sie mit dem blauen Polyrohr an den Warmwasserbereiter/-kühler angeschlossen wurden. Stellen Sie sicher, dass die Motorplatte durch die transparenten Wasserbadplatten gut sichtbar ist, wenn die Respirometriekammern nicht vorhanden sind.
2. Schließen Sie die beiden Schläuche an den Warmwasserbereiter/-kühler an (siehe Materialtabelle). Schalten Sie den Warmwasserbereiter/-kühler ein und stellen Sie dann die gewünschte Versuchstemperatur (27 °C oder 31 °C) ein.
3. Verbinden Sie den Boden des Wasserbades (Schritt 1.1) mit der Grundmotorplatte mit den Magneträdern (Abbildung 1 [6, 7] und Abbildung 3A) und schließen Sie diese Baugruppe dann an eine Stromquelle an (Abbildung 3B). Schalten Sie die Stromquelle ein, um die Zahnräder zu aktivieren, die die Rührstäbe in den Kammern aktivieren.
4. Modulieren Sie den Wasserdurchfluss nach Bedarf (z. B. kontinuierlicher, sanfter Durchfluss bei 75 l/h mit langsamem Rühren bei 30 U/min) mit den Ventilanschlussknöpfen (Abbildung 3C).
5. Um die Respirometriekammer zusammenzubauen, fügen Sie die Magnetperle (Abbildung 1 [1.5]) in die Glaskammer (Abbildung 1 [1.6]) und dann die undurchsichtige Kunststoff-Durchflussständerbasis (Abbildung 1 [1.4]) in die Glaskammer hinzu (Abbildung 4A). Die Größe der Kammer und der Magnetperle hängt vom Organismus und dem Studiensystem ab.
   Anmerkungen: Der Kunststoffsockel enthält Löcher, um den Wasserfluss und die Zirkulation durch die Bewegung der Magnetperle im Boden zu ermöglichen.
6. Kleben Sie die Koralle mit Aquarienkleber (siehe Materialtabelle) auf den schwarzen Kabelbinder im Kunststoffsockel (Abbildung 4B-D). Kleben Sie dazu zuerst das Korallenjungtier auf ein Stück schwarzes Plastik und kleben Sie dieses Stück dann auf die Kunststoffbasis. Sobald die Koralle sicher befestigt ist (das Aushärten des Klebers erfolgt fast augenblicklich), schrauben Sie den Deckel mit dem O-Ring (Abbildung 4A) auf die Glaskammer. Führen Sie diese Aktionen unter Wasser in einem separaten Becken durch, um sicherzustellen, dass sich keine Luft in der Respirometriekammer befindet.
   HINWEIS: Das Wasservolumen im Respirometer (d. h. effektives Volumen = 1,5 ml) wurde durch vollständiges Eintauchen der Kammer unter Wasser bestimmt. Die Annahme ist, dass die Verschiebung von der Masse/Dichte der sehr kleinen Koralle im Verhältnis zum Wasservolumen vernachlässigbar ist. Das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ist hier zur Skalierung dargestellt (Abbildung 4A).
7. Setzen Sie die Kammern fest in die Wasserbäder ein (Abbildung 5A). Stellen Sie sicher, dass die Glaskammern mit dem temperierten Wasser für das Experiment in Kontakt sind.
8. Schließen Sie die Ø 2-Lichtwellenleiter (siehe Materialtabelle) so an, dass sie mit den Sauerstoffsensorpunkten (im Folgenden als Spots bezeichnet; siehe Materialtabelle) in Kontakt kommen, indem Sie sie in das seitlich in die Deckelkammern gebohrte Loch einführen. Diese kleinen Spots sind sauerstoffempfindlich und erkennen und übertragen das Signal aus der Kammer durch das Glasfaserkabel.
   1. Fügen Sie Klempnerband (weißes, dünnes, selbstdichtendes Klebeband) hinzu, damit das Kabel fest sitzt und fest in der Wasserkammer bleibt. Stellen Sie sicher, dass die einzelne Koralle (wie in Abbildung 5B zu sehen) mit braunen Tentakeln nach oben in der Kammer zu sehen ist (Abbildung 5B, Video 1).
      HINWEIS: Kostenschätzungen für die Komponenten in der Vorrichtung sind in Tabelle 1 aufgeführt.

2. Standardarbeitsanweisungen für die Messung der Atmung mit dem System O₂

1. Öffnen Sie die Sauerstoffmesssoftware (siehe Materialtabelle).
2. Messen Sie die Temperatur des Raums, in dem die Kalibrierung durchgeführt wird. Dies wird später für die Kalibrierungsphase (Schritt 2.8) benötigt.
3. Montieren Sie die optischen Sensoren und Kappen. Schließen Sie dazu alle Lichtwellenleiter an den passenden Port im O₂ Modul an. Stellen Sie sicher, dass Kappe 1 mit Sensor 1, Kappe 2 mit Sensor 2 usw. übereinstimmt.
4. Um die Kammern für die Kalibrierung einzurichten, befeuchten Sie zunächst ein Stück sauberen Schwamm mit etwas Umkehrosmosewasser (RO) und führen Sie es in jede Kammer ein.
   HINWEIS: Der Schwamm sollte nicht tropfen, sondern nur feucht sein. Es kann auf den Glasfaserfleck tropfen. Stellen Sie sicher, dass die Stelle nicht nass ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
5. Stellen Sie die Kammern mit der passenden Glasfaser auf den Kopf (Abbildung 6). Dies ermöglicht das Abschrauben der Kammer, ohne die Glasfaser zu berühren und das Natriumsulfit für die 0%-Kalibrierung hinzuzufügen.
6. Überprüfen Sie das Signal jedes Sensors vor Beginn der Kalibrierung. Gehen Sie alle Registerkarten in der Softwareoberfläche durch und überprüfen Sie den Signalwert (obere linke Ecke) (Abbildung 7A), um sicherzustellen, dass sie nicht wesentlich variieren. Im O_2-Handbuch sind die akzeptablen Werte für den Versuchsaufbau (abhängig vom Organismus und den interessierenden Bedingungen) zu überprüfen. Für diesen speziellen Aufbau ist bei einer Raumtemperatur von 25,3 °C ein FTC (Oxygen Sensor Spot Flow Through Cell Normal Range) von 20,59 mit einem Signal von 179,5 akzeptabel.
7. Öffnen Sie das Programm und überprüfen Sie die Einstellungen in der Software, um sicherzustellen, dass sie korrekt sind, wie unten beschrieben. Wenn das Popup-Fenster nicht sofort nach dem Öffnen des Programms angezeigt wird, können Sie dies tun, indem Sie auf die Schaltfläche Einstellungen in der linken unteren Ecke der Softwareoberfläche klicken.
8. Überprüfen Sie, ob der externe Temperatursensor aktiviert ist (Abbildung 7B). Ändern Sie die Einstellung auf Feste Temperatur (Abbildung 7C). Fügen Sie dann den Raumtemperaturwert hinzu und klicken Sie auf Einstellung auf alle anderen Kanäle kopieren.
9. Ändern Sie die Einstellung in Signaldrift reduzieren (Abbildung 7C). Wählen Sie dann Sensoreinstellungen und wählen Sie Stufe 2. Andernfalls ist die Drift bei Verwendung kleiner Volumina so hoch, dass die Kalibrierung schwierig ist.
10. Überprüfen Sie die allgemeinen Einstellungen der Kanäle. Drücken Sie OK , wenn dies ausreichend ist. Klicken Sie auf Einstellungen in alle Kanäle kopieren und dann auf OK.
11. Kalibrieren Sie die Sensoren. Gehen Sie für die Kalibrierung von Kanal 1 auf die Registerkarte Kanal 1 und drücken Sie die Schaltfläche Kalibrieren . Wählen Sie 2-Punkt in Wasser oder feuchter Luft.
12. Tauchen Sie für die "Luft"-Kalibrierung ein Stück Schaumstoff in Wasser, legen Sie es in die Kammer und warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat (siehe Vorher-Nachher-Luftkalibrierungsbilder). Wenn sie stabil sind, drücken Sie "set air". Klicken Sie auf air > Kalibrieren > eingestellte Luft.
13. Stellen Sie die 0%- und 100%-Kalibrierung ein (Abbildung 7D). Entfernen Sie die Kammer von der Kappe und setzen Sie sie in die nächste Kappe, damit das Luftkalibrierungssignal fertig ist, wenn die 0%-Kalibrierung im ersten Sensor abgeschlossen ist. Verwenden Sie eine Transferpipette und füllen Sie die Kappe mit 2% Natriumsulfit. Warten Sie, bis sich das Signal stabilisiert hat.
    HINWEIS: Die Stabilisierung des Signals dauert im Vergleich zur Luftkalibrierung in der Regel länger. Wenn eine Warnmeldung angezeigt wird, die besagt, dass die "Werte außerhalb des typischen Bereichs liegen", stellen Sie sicher, dass das Natriumsulfit frisch ist. Wiederholen Sie den gleichen Kalibrierungsvorgang für alle Kanäle. Bereiten Sie das Natriumsulfit vor, indem Sie 2 g in 100 ml RO-Wasser geben.
14. Spülen Sie nach Abschluss der Kalibrierung die Atemkammern gut aus und trocknen Sie die Kammern und Kappen. Stellen Sie sicher, dass sich kein Wasser im Glasfaserloch befindet.
15. Legen Sie den Organismus (in diesem Beispiel einzelne Korallenjungtiere) in die Atemkammern und verschließen Sie ihn mit Deckeln. Achten Sie beim Aufsetzen der Deckel darauf, dass Sie dies tun, wenn die Kammern vollständig untergetaucht sind und sich absolut keine Luft im Inneren befindet.
16. Legen Sie die Kammern fest in die Rührplatte und verbinden Sie die Lichtwellenleiter.
17. Schalten Sie das Netzteil ein. Achten Sie darauf, dass das Wasser in den Kammern vollständig vermischt wird. Stellen Sie die Temperatur im Kühler/Heizgerät auf die gewählten Versuchstemperaturen ein.
18. Schalten Sie die Pumpe und die Heizung ein (Schritte 1.2 und 1.4).
19. Drücken Sie auf der Schnittstelle der O₂ -Messsoftware auf Log, um die Aufnahme zu starten.

Ergebnisse

Datenverarbeitung und -analyse
Obwohl es zahlreiche Methoden gibt, um die Rohdaten aus Respirometrie-Experimenten zu verarbeiten, wird empfohlen, das R-Paket respR²⁸ zu verwenden. In Übereinstimmung mit der gemeinsamen Nutzung der oben genannten Protokolle, die sich für offene Wissenschaft und Reproduzierbarkeit einsetzen, ermöglicht dieses Paket die gemeinsame Nutzung von Datenverarbeitung und -analyse in einer leicht reproduzierbaren Form und wurde unter diesem Gesichtspunkt entwickelt. Es ist eine kostenlose Open-Source-Plattform und ein unabhängiges Sondensystem und kann entweder von CRAN oder GitHub einfach installiert werden. Der vollständige Code und Beispiele für respR werden beibehalten und können unter https://github.com/januarharianto/respR gefunden werden.

Das respR-Paket verfügt über Funktionen zum Importieren, Visualisieren und Durchführen einer Qualitätskontrolle von Respirometriedaten sowie zum automatischen Berechnen von Atemfrequenzen oder aus manuell ausgewählten Regionen. Es kann auch die Raten für die Hintergrundatmung und die Umwandlungsraten an häufig verwendete Ausgabeeinheiten anpassen. Die Schritte zur Verarbeitung der Daten aus dem Mikro-Respirometrie-System sind unten beschrieben. In dieser Studie wurden die Daten des Respirometriesystems als Beispiel verwendet, aber das Paket akzeptiert auch Eingaben von den meisten kommerziell erhältlichen Sauerstoffsondensystemen sowie generische R-Datenobjekte. Weitere Details zum Paket, einschließlich vollständiger Dokumentation und Tutorials, finden Sie auf der Paketwebsite unter https://januarharianto.github.io/respR/index.html.

Rohdaten importieren
Die Rohausgabedatei (.txt) wird importiert. respR erkennt das Format und analysiert es in einen generischen R-Datenrahmen, der in nachfolgenden Funktionen verwendet werden kann. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass dies optional ist; Diese Dateien und praktisch alle Sauerstoff-Zeitreihendaten können auch mit den Basisfunktionen (unten angegeben) von jedem mit Grundkenntnissen in R importiert werden.

#load respR
Bibliothek (respR)

#Import ---
Daten <- import_file("file.txt")
#Firesting-Pryo-Datei erkannt

Inspektion und Visualisierung der Daten
Ein wichtiger Teil jeder Datenanalyseaufgabe besteht darin, die Daten darzustellen und zu untersuchen, um nach offensichtlichen Anomalien oder Mustern zu suchen oder einfach nur zu helfen, sie zu verstehen. Hier wird die Inspektionsfunktion verwendet (Abbildung 8A), die nach Problemen sucht, die bei Respirometriedaten üblich sind, wie z. B. nicht numerische oder fehlende Werte.

#inspect einer einzigen Sauerstoffsäule
Insp <-inspect(data, time = 3, oxygen = 8, width = 0.2)

Diese Funktion zeichnet auch die Sauerstoff-Zeitreihen auf und berechnet eine Rollrate (unteres Feld), um zu verdeutlichen, wie sich diese Rate im Laufe des Experiments ändern kann. Diese rollierenden Ratendiagramme geben Aufschluss darüber, welche Bereiche dieser Ratenkurven extrahiert werden sollten. Bei Standard- oder Routine-Stoffwechselraten sind die gewünschten Regionen diejenigen, in denen die Rate stabil ist (z. B. nach etwa 3.000 Zeitpunkt; Abbildung 8B).

Hier wird abnehmender Sauerstoff erst nach etwa Zeile 200 im vollständigen Zeitreihenpanel nachweisbar. Muster wie dieses sind in Respirometriedaten sehr häufig; Zu Beginn eines Experiments gibt es oft eine längere Zeit der Instabilität, wenn sich das System stabilisiert und sich die Probe an die Versuchsbedingungen gewöhnt. Es wird empfohlen, die Kurse erst nach dieser anfänglichen Instabilität aus den Zeitreihen zu extrahieren, was auch die Bedeutung von Visualisierungen unterstreicht.

Preise extrahieren
respR hat zwei Funktionen zur Extraktion von Atemfrequenzen. Die erste ist die Funktion calc_rate(), mit der eine Rate manuell extrahiert werden kann, indem ein Zeitbereich, eine Zeile oder ein Sauerstoffgehalt angegeben wird. Dies ist bei respirometrischen Analysen sehr häufig und eine durchaus akzeptable Methode zur Bestimmung einer Rate, solange Auswahlkriterien festgelegt und konsequent angewendet werden²⁸.

Eine robustere und objektivere Methode ist die Verwendung der Funktion auto_rate(), die lineare Bereiche der Daten identifiziert. Diese Regionen sind Regionen mit konstant anhaltenden Atemfrequenzen, die mithilfe von maschinellem Lernen automatisch zugewiesen werden. Diese Funktion ist auch nützlich für die Detektion niedriger Signale (wie in den in dieser aktuellen Studie verwendeten Proben aufgrund der geringen Biomasse in diesem Alter). Diese Funktion ermöglicht die Identifizierung der linearsten, minimalsten und maximalen Raten mit unabhängigen, objektiven und statistisch robusten Methoden²⁸. Das folgende Beispiel zeigt einen linearen Bereich, der zwischen den Zeitpunkten 3.000 und 5.000 liegt. Es sollte beachtet werden, dass mehrere lineare Bereiche identifiziert werden können, aber dieser Abschnitt ist der am höchsten eingestufte oder linearste Bereich (Abbildung 8C).

#Determine linearste (d. h. konsistenteste) Rate
Tarif <-auto_rate (INSP)

Hintergrundanpassung
Hintergrundraten aus Kontrollexperimenten können auf ähnliche Weise wie im obigen Beispiel bestimmt werden und können verwendet werden, um die Probenraten mit der Funktion adjust_rate() anzupassen (Abbildung 9A; beachten Sie, dass hier nicht die vollständige Analyse gezeigt wird, sondern nur die Anpassung). Vollständige Beispiele finden Sie auf der respR-Website .

#Adjust Rate für Hintergrund
rate_adj <-adjust_rate(Rate, um = bg) #saved bg-Objekt
drucken(rate_adj)

Kurse umrechnen
Der letzte Schritt besteht darin, die Raten in die gewünschten Ausgabeeinheiten umzuwandeln, wobei die ursprünglichen Einheiten der Rohdaten, das effektive Volumen des Respirometers und andere experimentelle Daten verwendet werden, einschließlich der Normalisierung auf Blindmessungen (Abbildung 9B). Die Ausgabe kann eine absolute Atemfrequenz, d. h. der gesamten Probe, oder eine massen- oder oberflächenspezifische Rate sein. Die oberflächenspezifische Rate war die hier verwendete Ausgabe, die speziell die absolute Rate geteilt durch die Oberfläche der Probe ist (Abbildung 9C).

Wie oben erwähnt, wurde dieses System entwickelt, um sehr kleine Proben zu messen. Daher erwarteten wir niedrige Werte und potenzielle Überlappungen mit Blindmessungen. Ein gewisses Signalniveau wird innerhalb der Rohlinge erwartet, und wenn diese Werte untersucht werden, liegen sie innerhalb des erwarteten Bereichs des allgemeinen experimentellen Rauschens, möglicherweise aufgrund von Sondendrift, leichten Temperaturänderungen oder Blasen auf den Sonden. Konstruktionsbedingt und aufgrund der geringen Probengröße und des damit verbundenen geringen Nutzvolumens ist hier der Einsatz von Rohlingen besonders wichtig, insbesondere bei jedem Lauf. Hier wurden beispielhaft repräsentative Werte aufgenommen (Abbildung 10). Aufgrund der geringen Probengröße empfehlen wir die Verwendung der Rohlinge bei jedem Lauf, um die Messungen pro Lauf zu standardisieren.

Diese Blindwerte werden dann verwendet, um die Werte der Behandlungsmessungen zu standardisieren. Da Korallen nicht nur Sauerstoff produzieren, sondern auch atmen, kann die Stoffwechselrate zwischen negativen und positiven Werten liegen. Ein Beispiel für repräsentative Ergebnisse des Bereichs der Atmungswerte, die mit dem Mikrorespirationstool ermittelt wurden, ist hier angegeben. Diese Ergebnisse wurden aus einem erfolgreichen Experiment an einzelnen Korallenjungtieren ermittelt (Abbildung 10). Insgesamt wurde erwartet, dass die Atmung in diesem Beispieldatensatz (konstruktionsbedingt) aufgrund der geringen Größe der Proben schwer zu erkennen sein würde; Dies unterstreicht den Wert dieser Methode bei der Erfassung dieser niedrigen Signalschwelle. Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen die Atmung im Dunkeln bei den kleinsten getesteten Probengrößen, was die minimale Nachweisschwelle dieses Systems unterstreicht. Wir haben auch unter zwei Bedingungen gemessen (Kontrolle und Hochtemperaturbelastung). Nach der Standardisierung auf die pro Lauf gemessenen Leerproben reichten die Werte von nahe Null (Kontrolle) bis zu einem Median von ~-^5e-5 für die Stressbehandlung. Wie erwartet war die Atmung gering. Diese Ergebnisse zeigen deutlich repräsentative Werte für Leerproben sowie einen Kontroll- und Hochtemperaturvergleich für diese sehr kleinen Proben.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des neuen Mikrorespirometrie-Werkzeugs zur physiologischen Charakterisierung des Korallenholobionten (Korallentier + Symbionten) oder eines beliebigen kleinen Organismus (<1 mm). Es wurden kundenspezifische Respirometriekammern hergestellt (Nummer 1; 1.1-1.6). Dazu gehören Deckel (1.1) mit Sauerstoffsensorspots (1.2), und das einzelne Jungtier (1.3) wird auf einen Durchflussständer (1.4) gestellt, der auf einem Magnetrührer (1.5) steht, die alle in die Glaskammer (1.6) passen. Der Controller (2) wird mit einem Glasfaserkabel, das in den Deckel (1) passt, am Spot befestigt und mit dem Computer (3) verbunden. Die Heizung/Kältemaschine (4) ist mit der Respirometrieplatte (5) mit dem Durchflusswasser (gekennzeichnet durch Chevronpfeile für die Richtung) verbunden, das auf der Rührplatte (6) mit Zahnrädern (7) sitzt, die vom Motor (8) und der Stromversorgung (9) angetrieben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Aufbau der Mikrorespirometrie. Es stehen mehrere Optionen zur Verfügung, darunter (A) eine Respirometrieplatte oder (B) Anschluss an mehrere Platten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Speziell angefertigte Magnetrührplatte auf der Respirometrieplatte. Jede Kammer hat (A) ein magnetisches Rührgetriebe darunter, (B) das von einem Motor angetrieben wird, wobei (C) die Respirometrieplatte über einen Schlauch mit der Heizung/dem Kühler verbunden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kundenspezifischer Aufbau der Respirometriekammer. (A) Komponenten (von links nach rechts: Deckel, Glasfläschchen, Ständer, 1,5-ml-Röhrchen für die Waage und Rührstab). (B) Individueller Durchflussständer, in dem sich die Probe befindet. (C) Draufsicht auf den Durchflussständer. (D) und mit dem Ständer in der Glasdurchstechflasche mit aufgeschraubtem Deckel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Glasfläschchen in der Rührplatte. (A) Speziell angefertigte Rührplatte mit (B) einer Nahaufnahme des kompletten Glasfläschchens mit dem Deckelaufbau. Die junge Koralle ist hier durch den Deckel (brauner Punkt) auf dem Kabelbinder zu sehen, wobei die Glasfaser in der Deckelöffnung platziert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Kammern auf den Kopf gestellt, bereit für die Kalibrierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Wichtige Schritte in der Sauerstoffmesssoftware. (A) Überprüfen Sie das Signal jedes Sensors. Ein optimales Signal für diese Studie und Sensoren ist im Sauerstoffsensor-Spot FTC (Normalbereich) dargestellt. (B) Überprüfen Sie die Signaldrift. (C) Stellen Sie die Behandlungstemperaturen ein und überprüfen Sie sie. (D) Stellen Sie die 0%- und 100%-Kalibrierungen ein und überprüfen Sie sie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Ausgabeschritte der jeweiligen Analyse I. (A) Überprüfen Sie den Befehl und die Ausgabe. (B) Überprüfen Sie die Kursstabilität. (C) Bestimmen Sie die linearste Rate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Ausgabeschritte II der RespR-Analyse . (A) Passen Sie die Rate für den Hintergrund an, (B) Konvertieren und (C) Überprüfen Sie die Kurse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Repräsentative Ergebnisse des Mikrorespirometrie-Tools. Mediane Atmung (O₂ ± Standardfehler) von Replikaten einzelner Korallenjungtiere, einschließlich Blindwerte sowie Atmung von Individuen unter kontrollierten und hohen Temperaturstressbedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Draufsicht auf die Respirometriekammer mit den jungen Korallen im Inneren während einer Messsitzung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Tabelle 1: Kostenschätzungen der Komponenten des Respirometriegeräts. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Diese Arbeit skizziert den Aufbau eines maßgeschneiderten Mikro-Respirometrie-Setups, mit dem die Menge an Sauerstoff quantifiziert werden kann, die von kleinen sessilen Wasserorganismen verbraucht und produziert wird. Zu den kritischen Komponenten dieses Protokolls gehören der Aufbau der Kammern, einschließlich der Spots, und die Kalibrierung des Low-Signals mit dem respR-Paket , in dem ein Low-Signal als Raten definiert werden kann, die durch flache oder verrauschte Flanken gekennzeichnet sind. Die benutzerdefinierte Kammer und ihr Aufbau ermöglichen die Erkennung auch niedriger Signale, während die Verwendung des R-Pakets zum Schutz vor Problemen beiträgt, bei denen das Auftreten von flachen oder verrauschten Steigungen zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse führen könnte (z. B. falsch positive Ergebnisse).

Zu den möglichen Modifikationen, die für andere Benutzer erforderlich sind, gehört die Sicherung des interessierenden Organismus in der maßgefertigten Kammer. In diesem Fall wurden ein kleiner, starrer Kabelbinder und Aquarienkleber verwendet, um das einzelne Jungtier an der Kunststoffbasis zu befestigen, die dann auf die Krawatte geklebt wurde. Es ist zu beachten, dass für dieses Experiment Korallenjungtiere auf schwarzen Plastikfolien angesiedelt wurden. Dieser Kunststoff ermöglichte die einfache Entfernung der Korallenjungtiere, die effektiv vom Kunststoff abrutschten, um sie während der Entfernung nicht physisch zu verletzen. Korallenjungtiere haften an dem Substrat, auf dem sie sich ansiedeln, daher wird empfohlen, sie auf ähnlichem Kunststoffmaterial unter Verwendung eines künstlichen Peptids¹⁶ anzusiedeln, um ihre Entfernung für den Klebeprozess zu erleichtern. Um den Handhabungsstress und die Auswirkungen auf die Atmungsreaktion weiter zu minimieren, wird empfohlen, die an Kabelbindern montierten Korallen 1-2 Wochen lang akklimatisieren zu lassen, wie es bei vielen Stressexperimenten mit erwachsenen Korallen üblich ist. Möglicherweise sind weitere Modifikationen erforderlich, um den Organismus über der Stelle im Deckel zu sichern und die Wasserzirkulation zu ermöglichen. Ein weiterer wichtiger Schritt zur Fehlerbehebung ist die Signalerkennung, insbesondere an der Steigung der Sauerstoffzeitreihe, in der die Raten bestimmt werden sollten. Letztendlich läuft dies auf eine Kombination aus gutem Urteilsvermögen hinaus, um offensichtlich instabile Daten auszuschließen, und den Funktionen innerhalb von respR , die es ermöglichen, Raten entweder aus konsistent ausgewählten Regionen oder automatisch durch Identifizierung linearer Regionen der Daten zu extrahieren. Weitere Beispiele dafür finden Sie auf der Website von respR .

Diese Methode wurde entwickelt, um Messungen der unteren Atmungsgrenze auf extrem kleine, sessile wirbellose Meerestiere auszudehnen. Die offensichtliche Einschränkung besteht darin, dass dieses Protokoll im Vergleich zu Protokollen, die für größere Biomassen entwickelt wurden, anfälliger für falsch positive Ergebnisse sein kann. Da dies jedoch der Sinn des Designs war - diese unteren Grenzwerte zu messen - wurde dies in das Design einbezogen, und das Verfahren kann mit dem respR-Paket verwendet werden, um sich besser vor Fehlalarmen zu schützen. Es ist auch wichtig anzuerkennen, dass es andere Systeme zur Messung der Atmung³⁰ und zur Messung kleiner Organismen, einschließlich der Respirometrie an einzelnen Copepoden³¹ in kleineren Volumina (~0,5-1 ml), gibt, die jedoch entweder teuer sind oder spezifische Komponenten (Rührfähigkeit) fehlen. Dieses System ist jedoch Open Source und im Vergleich zu kommerziellen Systemen (z. B. Core Microplate System) relativ kostengünstig. Dieses System beinhaltet auch wichtige methodische Überlegungen wie das Rühren, die anderen Systemen möglicherweise fehlen. Die interne Rührstabfunktion ist unerlässlich, um die natürliche Wassermischung vieler Meeresorganismen (z. B. Copepoden durch Schwimmen) zu replizieren, was oft nicht möglich ist und die Daten weitgehend unbrauchbar machen kann. Im Gegensatz dazu besteht bei anderen verfügbaren Mischmethoden das Platzieren des gesamten Respirometers auf einer riesigen Wippbank, die zusätzliche Ausrüstung erfordert und nur begrenzten Erfolg beim Mischen hat, oder das Mischen durch Vibration, die den Organismus stören kann. Aus diesem Grund ist dies das einzige System, das eine Respirometrie an jungen Korallen oder anderen sehr kleinen sitzenden Organismen durchführen kann. Als Referenz reichte der Größenbereich der hier enthaltenen Exemplare von 2,1 bis 3,6 Polypen (entspricht nur wenigen Monaten) mit einer minimalen bis maximalen mittleren Fläche von 1,3 bis 4,5 mm².

Die Respirometrie ist ein grundlegendes Maß in ökologischen Studien, und es gibt viele Methoden für diesen Zweck. Die meisten dieser bestehenden Methoden zielen jedoch auf Proben mit hoher Biomasse ab, darunter ganze Fische, Korallenfragmente oder Seegräser 32,33,34. Diese Methode ist die erste, bei der einzelne Korallenjungtiere verwendet werden. Darüber hinaus gibt es viele Anwendungsmöglichkeiten für diese Methode, da sie wichtige physiologische Informationen über die Funktionsweise des Organismus liefert. Dies kann für Studien wichtig sein, die darauf abzielen, grundlegende Gesundheitsschätzungen zu charakterisieren³⁵, die Rolle von akutem oder langfristigem Stress während der Korallenontogenese wie Hitzestress^{zu verstehen 36} oder Schwellenwerte bereitzustellen, die Manager festlegen können, um die Gesundheit von Korallenriffen zu schützen und zu verbessern³⁷. Angesichts der Tatsache, dass die Koralle ein Holobiont ist und die Symbiontengemeinschaft in diesem Stadium und während des ersten Lebensjahres relativ flexibel ist³⁸, wäre es interessant, Respirometriedaten mit Veränderungen in den Gemeinschaften im Laufe der Zeit zu koppeln, um die Funktionsweise des Organismus als Ganzes vollständig zu kontextualisieren. Wichtig ist, dass diese Methode zu "Open Science"-Techniken beiträgt, die dazu beitragen, einen Überblick über die Erstellung benutzerdefinierter Versuchsaufbauten zu geben, die offen geteilt, verbessert und standardisiert werden können.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
			Kosten
(1.1 – 1.6) Kundenspezifische Respirometrie-Kammern	LabGlass Party Ldt.	1,5 ml	$407.26
1.1 Deckel	AIMS Workshop	Vial GL25 Gewinde	$10 1.2
Faseroptik-Spots (FireStingO2 II faseroptische Optoden)	PyroScience	Sauerstoffsensor-Spots, 125 & Mikro; m PET-Folie, & Oslash; 5 mm, mit optischer Isolierung, SN: 183801947	$41.25 AUD pro
1.3 einzelne Organismen	NA	NA	NA
1.4 Durchflussständer	AIMS-Workshop	Custom	in den Punkten 5 und 6 inbegriffen Preis (der Workshop gab mir eine Schätzung der Deckel, des Ständers mit Getriebe, des Motors, des Inkubationsflusses durch
1,5 Magnetrührer	Jeder Hersteller ist geeignet	NA	~$2?
1,6 Glaskammer (Fläschchen GL25 Gewinde x 20 mm hoch, mit Stoß/Grat, flach geschliffener Rand, Schraubverschluss mit Loch, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD)	Labglass Pty Ltd, Stafford QLD	Fläschchen GL25 Gewinde x 20 mm hoch, mit Stoß/Grat, flach geschliffener Rand, Schraubverschluss mit Loch	$50.9 AUD
2 FireSting Controller (2)	PyroSciences	NA	4 Sensoren kostet 4000 Euro. Hier kommen 8 Sensoren zum Einsatz.
3 Computer	NA	NA	NA
4 Heizung/Kältemaschine	VWR International	NA	Kleine Modelle ca. 4.000 AUD
5 Respirometrie-Plattenplattform	AIMS Workshop	34 cm x 26 cm x 3 cm (obwohl alle Abmessungen ausreichend sind, um die gewünschte Anzahl von Kammern aufzunehmen)	$1250 AUD
6 Rührplatten mit Zahnrädern (7)	AIMS-Werkstatt	34 cm x 26 cm x 3 cm;	$1250 AUD
8 angetrieben vom Motor	AIMS-Workshop	Benutzerdefiniert	$700 AUD
9 Netzteil	Unspezifisches	NA	~$300 AUD
Aquariumkleber	Seachem Riffkleber	20g	$14
Sauerstoff-Logger-Software	PyroScience	NA
NA Polypipe und Verbinder	John Guest	NA	$20
Natriumsulfit	Sigma	S0505-250G (CAS-Nummer 7757-83-7)	$54