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Chromatin-Immunpräzipitation im Nesseltier-Modellsystem Exaiptasia diaphana

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DOI:

10.3791/64817

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17. März 2023

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1Red Sea Research Center (RSRC), Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 2KAUST Environmental Epigenetics Program (KEEP), Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Chromatin-Immunpräzipitationsassay (X-ChIP) gegen die Histonmarkierung H3K4me3 für den Modellorganismus Exaiptasia diaphana vorgestellt. Die Spezifität und Wirksamkeit des Assays werden durch quantitative PCR und Next-Generation-Sequencing bestätigt. Dieses Protokoll ermöglicht die verstärkte Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der Seeanemone E. diaphana.

Zusammenfassung

Posttranslationale Histonmodifikationen (PTMs) und andere epigenetische Modifikationen regulieren die Zugänglichkeit von Genen zum Transkriptionsapparat und beeinflussen so die Fähigkeit eines Organismus, auf Umweltreize zu reagieren. Die Chromatin-Immunpräzipitation in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird häufig eingesetzt, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in den Bereichen Epigenetik und Genregulation zu identifizieren und zu kartieren. Das Gebiet der Nesseltier-Epigenetik wird jedoch durch einen Mangel an anwendbaren Protokollen behindert, was zum Teil auf die einzigartigen Eigenschaften von Modellorganismen wie der symbiotischen Seeanemone Exaiptasia diaphana zurückzuführen ist, deren hoher Wassergehalt und Schleimmengen molekulare Methoden behindern. Hier wird ein spezialisiertes ChIP-Verfahren vorgestellt, das die Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen bei der Genregulation von E. diaphana ermöglicht. Die Vernetzungs- und Chromatinextraktionsschritte wurden für eine effiziente Immunpräzipitation optimiert und anschließend durch die Durchführung von ChIP mit einem Antikörper gegen die Histonmarkierung H3K4me3 validiert. Anschließend wurde die Spezifität und Wirksamkeit des ChIP-Assays durch Messung der relativen Belegung von H3K4me3 um mehrere konstitutiv aktivierte Genorte mittels quantitativer PCR und durch Next-Generation-Sequencing für die genomweite Analyse bestätigt. Dieses optimierte ChIP-Protokoll für die symbiotische Seeanemone E. diaphana ermöglicht die Untersuchung der Protein-DNA-Wechselwirkungen, die an der Reaktion von Organismen auf Umweltveränderungen beteiligt sind, die symbiotische Nesseltiere, wie z.B. Korallen, betreffen.

Einleitung

Der Bericht des Weltklimarats (IPCC) aus dem Jahr 2022 hebt hervor, dass trotz wachsender Sensibilisierung und Bemühungen zur Eindämmung des Klimawandels immer intensivere und häufigere Hitzewellen im Meer die Korallenriffe einem hohen Risiko für großflächige Bleiche und Massensterben in den nächsten Jahrzehnten aussetzen1. Um die Bemühungen zum Schutz und zur Wiederherstellung von Korallenriffen zu unterstützen, werden die aktuellen und prognostizierten Auswirkungen sich ändernder Umweltbedingungen auf benthische Nesseltiere auf mehreren biologischen Ebenen untersucht, um die zugrunde liegenden Mechanismen von Reaktion und Resilienzzu verstehen 2.

Die Verfügbarkeit von Untersuchungsinstrumenten, die auf benthische Nesseltiere anwendbar sind, ist von entscheidender Bedeutung, um dieser Herausforderung zu begegnen, und die Entwicklung dieser Werkzeuge erfordert aktive Anstrengungen zur Weitergabe von Wissen und Technologien, die in anderen Bereichen etabliert wurden, auf Meeresorganismen3. Die Hürden bei der Arbeit mit vielen Korallenarten werden teilweise durch den Einsatz von Modellsystemen wie der Seeanemone Exaiptasia diaphana (allgemein als Aiptasia bezeichnet)4 abgebaut. Diese schnellwüchsigen, fakultativ symbiotischen Seeanemonen sind unter Laborbedingungen relativ einfach zu halten, vermehren sich sowohl sexuell als auch asexuell und es fehlt das Kalziumkarbonat-Skelett5. Das frei zugängliche Referenzgenom5 von E. diaphana ermöglicht den Einsatz epigenetischer Methoden, die eine Sequenzierung erfordern. Merkmale wie ein hoher Wassergehalt, eine Schleimproduktion und geringe Gewebemengen pro Individuum stellen jedoch eine Herausforderung für die Etablierung replizierbarer Protokolle dar, wodurch die epigenetische Forschung an E. diaphana und anderen Nesseltieren mit ähnlichen Merkmalen eingedämmt wird.

Epigenetische Modifikationen können den Phänotyp verändern, ohne die genomische Nukleotidsequenz eines Organismus zu verändern, indem sie Chromatin-assoziierte Prozesse regulieren6. Die epigenetische Regulation von Nesseltieren wird hauptsächlich im Kontext der Evolutionsgeschichte und -entwicklung 7,8,9,10, der Etablierung und Aufrechterhaltung von Symbiosen 11,12,13 und der Reaktion auf Umweltveränderungen14,15 untersucht.. Insbesondere wurden Variationen in den Mustern der DNA-Methylierung, die in den meisten Fällen die Hinzufügung einer Methylgruppe zu einer Cytosinbase beinhalten, als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen wie die Erwärmung13 und die Versauerung der Ozeane16 beobachtet. Es wurde auch gezeigt, dass DNA-Methylierungsmuster intergenerationell vererbbar sind, was die Rolle der Epigenetik bei der Akklimatisierung von Korallen an Umweltstressoren unterstreicht17. Im Vergleich zur DNA-Methylierung gab es relativ wenige Studien zu anderen wichtigen epigenetischen Regulatoren, wie z. B. nicht-kodierenden RNAs 11,18,19, Transkriptionsfaktoren 9,10 oder posttranslationalen Histonmodifikationen (PTMs) bei Nesseltieren20. Die Untersuchung von DNA-assoziierten Proteinen ist besonders anspruchsvoll, da die verfügbaren Methoden den Zugang zu einem Referenzgenom des Studienorganismus erfordern und aufgrund der großen Stichprobengrößen und der benötigten Antikörper mit hoher Spezifität teuer sind3. Mit einer Vielzahl chemischer Gruppen, die PTMs an spezifischen Histonresten bilden, bleibt das Verständnis der Chromatinmodifikationslandschaften bei Nesseltieren, insbesondere im Zusammenhang mit drohenden Umweltbelastungen, eine große Herausforderung.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Untersuchung von Histon-PTMs, Histonvarianten und anderen Chromatin-assoziierten Proteinen bei Nesseltieren voranzutreiben, indem ein optimiertes Chromatin-Immunpräzipitationsprotokoll (ChIP) für das Korallenmodell E. diaphana vorgestellt wird (Originalprotokoll von Bodega et al.21). ChIP kann mit quantitativer PCR kombiniert werden, um locusspezifische Protein-DNA-Interaktionen zu charakterisieren, oder mit Next-Generation-Sequencing (NGS), um diese Interaktionen über das gesamte Genom hinweg abzubilden. Im Allgemeinen werden Proteine und DNA reversibel vernetzt, so dass das Protein of Interest (POI) an denselben Locus gebunden bleibt, mit dem es in vivo assoziiert ist. Während die im Säugetiermodellsystem weit verbreitete Vernetzungsmethode in der Regel bei Raumtemperatur auf 15 Minuten oder darunter gehalten wird, wurde der Vernetzungsansatz optimiert, damit das Formaldehyd den von E. diaphana produzierten Schleim effektiver durchdringen kann. Das Gewebe wird dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren, homogenisiert und lysiert, um die Zellkerne aus den Zellen zu extrahieren. Der Materialverlust in diesen Schritten wird vermieden, indem nur ein Lysepuffer verwendet wird und dann direkt zur Beschallung übergegangen wird, bei der das Chromatin in ~300 bp lange Fragmente fragmentiert wird. Diese Fragmente werden mit einem für den POI spezifischen Antikörper bis auf PTM-Niveau inkubiert. Der Antikörper-Protein-DNA-Immunkomplex wird mit Hilfe von magnetischen Beads gefällt, die an die primären Antikörper binden und dabei nur die DNA-Abschnitte auswählen, die mit dem POI assoziiert sind. Nach der Cross-Link-Umkehr und der Reinigung des Niederschlags können die gewonnenen DNA-Segmente für die qPCR oder den Aufbau einer DNA-Bibliothek für die Sequenzierung verwendet werden, um die Segmente auf ein Referenzgenom abzubilden und so die Loci zu identifizieren, mit denen der POI assoziiert ist. Weitere Einzelheiten zu den Überlegungen für die einzelnen Schritte finden Sie in Jordán-Pla und Visa22.

Protokoll

Eine Übersicht über das Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Die ChIP-Seq-Daten sind im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter dem BioProject-Code PRJNA931730 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA931730) verfügbar.

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Abbildung 1: Workflow des ChIP-Protokolls. Überblick über den Workflow des ChIP-Protokolls, einschließlich der geschätzten Dauer der einzelnen Schritte und optionaler Stopppunkte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Sammlung von Tieren

  1. Lösen Sie mit einem Plastikspatel vorsichtig 20 symbiotische E. diaphana (Stamm CC7) mit einem Pedaldurchmesser von ~5 mm oder größer von den Aquarienwänden und pipettieren Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Anzahl der Anemonen basierend auf ihrer Größe und der Anzahl der vorgesehenen IPs zu optimieren. Anemonen können in flüssigem Stickstoff (LN2) schockgefrostet und mindestens 1 Monat lang bei -80 °C gelagert werden, bevor die ChIP gestartet wird. Andernfalls empfiehlt es sich, sofort vorzugehen, um zu verhindern, dass sich die Anemonen an den Wänden des 15-ml-Röhrchens absetzen.

2. Vernetzung

  1. Bereiten Sie 10 ml 0,5%igen Vernetzungspuffer vor (Tabelle 1).
  2. Lassen Sie die Anemonen am Boden des Röhrchens absetzen oder drehen Sie sie einige Sekunden lang in einer Zentrifuge auf ~3.500 x g bei Raumtemperatur und entfernen Sie dann überschüssiges Meerwasser mit einer Vakuumpumpe. Waschen Sie sie in 1x DPBS, indem Sie sie aufhängen, und entfernen Sie dann die DPBS.
  3. Übertragen Sie die Anemonen mit einer Pinzette oder einem Plastikspatel in den 0,5%igen Vernetzungspuffer, um eine Übertragung des überflüssigen Puffers zu vermeiden. Auf einem Rotator bei 12 U/min und 4 °C 1 h inkubieren.
  4. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 10 mL 1% Vernetzungspuffer vor (Tabelle 1).
  5. Entfernen Sie wie in Schritt 2.2 den 0,5%-Puffer und füllen Sie das Röhrchen mit dem 1%-Vernetzungspuffer neu. Auf einem Rotator bei 12 U/min und 4 °C über Nacht inkubieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Anemonen aufgehängt sind und nicht aneinander kleben, indem Sie den Schlauch vorsichtig umdrehen.
  6. Bereiten Sie am nächsten Tag 10 mL Quenching-Puffer aus einem 2 M Glycin-Stamm vor (Tabelle 1).
  7. Entfernen Sie den 1%-igen Vernetzungspuffer wie in Schritt 2.2 und suspendieren Sie die Anemonen im Quenchpuffer, um die Vernetzungsreaktion zu stoppen. Auf einem Rotator bei 12 U/min und 4 °C für 20 min inkubieren.
  8. Entfernen Sie den Quenchpuffer wie in Schritt 2.2 und waschen Sie die Anemonen zweimal in DPBS. Wenn Sie mit mehreren Proben umgehen, lassen Sie die Anemonen in DPBS hängen, während Sie die Schritte 3.2-3.4 Probe für Probe durchlaufen.
    HINWEIS: Das Experiment kann unterbrochen werden, indem die Probe eingefroren und zu diesem Zeitpunkt höchstens 1 Monat lang bei -80 °C gelagert wird. Entfernen Sie überschüssiges DPBS, indem Sie das Röhrchen vor dem Einfrieren und Lagern auf ein Papiertuch entleeren.

Tabelle 1: Lösungen und Puffer, die im ChIP-Protokoll verwendet werden. Die Inhaltsstoffe und ihre jeweiligen Konzentrationen sind für jeden verwendeten Puffer im Protokoll aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

3. Homogenisierung und Lyse

  1. Bereiten Sie den Lysepuffer (Tabelle 1) am Tag frisch vor (2 ml pro Probe) und fügen Sie den 100-fachen Proteasehemmer-Cocktail (PIC, siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 1x zu. Reinigen Sie einen Porzellanmörser und Stößel mit Ethanol und beginnen Sie mit der Kühlung aller Werkzeuge mit LN2.
  2. Dekantieren Sie das DPBS und leeren Sie die Anemonen auf ein Papiertuch, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Gießen Sie etwas LN2 in den Mörser und übertragen Sie die Anemonen mit einer Pinzette.
  3. Beginnen Sie mit dem Stößel damit, das Gewebe vorsichtig aufzubrechen, und mahlen Sie es dann, bis die Probe ein feines Pulver ist. Füllen Sie bei Bedarf LN2 nach, um ein Auftauen zu verhindern.
  4. Geben Sie 2 mL Lysepuffer in ein 5 mL Röhrchen auf Eis. Entnehmen Sie die Probe mit einem Spatel und überführen Sie sie in den Lysepuffer, wobei Sie sicherstellen, dass sich die Probe im Puffer auflöst. Lassen Sie die Probe 1 Minute lang auf Eis ruhen und mischen Sie sie dann durch Inversion. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.4 für alle anderen Proben und reinigen Sie das gesamte Gerät zwischen den Proben gründlich mit Ethanol.
    HINWEIS: Minimieren Sie in diesem Schritt den Probenverlust so weit wie möglich.
  5. Waschen Sie einen Dounce Gewebewolf (siehe Materialtabelle) mit Lysepuffer, übertragen Sie die Probe und tupfen Sie sie 20-30 Mal mit einem festen Stößel aus.
  6. Übertragen Sie die Probe zurück in das Röhrchen, waschen Sie den Tissue-Grinder mit Ethanol und destilliertem Wasser und wiederholen Sie Schritt 3.5 für alle Proben.
  7. Inkubieren Sie die Proben über Nacht auf einem Rotator bei ~14 U/min und 4 °C.
  8. Verwenden Sie Trypanblau, um die erfolgreiche Lyse unter dem Mikroskop (20-fache Vergrößerung) zu überprüfen, indem Sie es mit 10 μl Probe im Verhältnis 1:1 mischen. Dringt der Farbstoff in die Zellkerne ein, ist die Lyse erfolgreich.
    HINWEIS: Das Experiment kann an dieser Stelle unterbrochen werden, indem die Probe bis zu 2 Monate lang bei -80 °C gelagert wird.

4. Beschallung

  1. Die Probe in einer Zentrifuge bei ~2.000 x g für 3-5 s bei Raumtemperatur drehen, um jegliche Flüssigkeit von der Kappe und den Wänden zu entfernen.
  2. Führen Sie das Lysat 10 Mal durch eine 25-G-Nadel und 1 ml-Spritze, um alle Aggregate aufzubrechen.
  3. Legen Sie die Probe in ein Eisbad, um sie während der Beschallung so kühl wie möglich zu halten.
  4. Reinigen Sie die Ultraschallnadel mit Ethanol. Legen Sie die Probe in das Ultraschallgerät (siehe Materialtabelle), wobei die Nadel 1 cm über dem Boden des Röhrchens liegt und die Wände nicht berührt.
  5. Stellen Sie die Einschaltdauer auf 50 % und die Leistung auf 0 ein. Starten Sie den Ultraschallator und stellen Sie sicher, dass sich kein Schaum in der Probe bildet (andernfalls stoppen Sie und stellen Sie die Nadelposition neu ein). Erhöhen Sie langsam die Ausgangsleistung auf 2 und beschallen Sie sie dann 2 Minuten lang.
  6. Schalten Sie das Ultraschallgerät aus, stellen Sie die Ausgangsleistung wieder auf 0 und lassen Sie die Probe 2 Minuten lang ruhen und abkühlen.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.6 für insgesamt vier Beschallungs- und Abkühlsets pro Probe. Entnehmen Sie die Probe, lagern Sie sie auf Eis und wiederholen Sie den Vorgang mit anderen Proben. Reinigen Sie die Ultraschallnadel zwischen den Proben und am Ende mit Ethanol.
    HINWEIS: Die Beschallungsintensität und die Zykluszahl müssen möglicherweise optimiert werden, um die niedrigste Beschallungsintensität zu erreichen und gleichzeitig Fragmente mit einer Größe von 150-500 bp zu erhalten.

5. DNA-Extraktion und Überprüfung der Fragmentgröße

HINWEIS: Bevor Sie mit der IP fortfahren, muss die Größe der Fragmente überprüft werden. Wenn die Fragmente zu groß sind (>500 bp), muss die Anzahl der Beschallungszyklen und/oder die Beschallungsintensität erhöht werden; Wenn sie zu klein sind (<150 bp), muss die Beschallungszeit und/oder -intensität reduziert werden.

  1. Halten Sie die Probe auf Eis, während Sie die Fragmentgrößenprüfung für eine Teilmenge der Probe durchführen. Übertragen Sie eine 100-μl-Teilmenge in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen.
  2. 8 μl RNase-Cocktail (siehe Materialtabelle) zugeben und 30 Minuten lang bei 42 °C inkubieren, während bei 700 U/min geschüttelt wird.
  3. Fügen Sie 2 μl Proteinase K hinzu (siehe Materialtabelle). und bei 55 °C für 1 h unter Schütteln bei 700 U/min inkubieren.
  4. Die Probe wird umgekehrt vernetzt, indem sie mindestens 1 Stunde lang bei 95 °C inkubiert und bei 700 U/min geschüttelt wird.
  5. Bereiten Sie ein 1%iges Agarosegel mit 1x TAE-Puffer und 0,01% Ethidiumbromid (siehe Materialtabelle) oder eine alternative Gelfärbung vor.
  6. Extrahieren Sie die DNA aus der Probe mit einem Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  7. Um die Fragmentierungsgröße der extrahierten DNA zu überprüfen, beladen Sie das Agarosegel mit einer Leiter und einer Probe. Mischen Sie 4 μl 1 kbp Leiter mit 1 μl 6x Purple Loading Farbstoff und geben Sie es in eine Vertiefung des Agarosegels. Mischen Sie 20 μl DNA mit 4 μl 6x violettem Ladefarbstoff für eine Endkonzentration von 1x und pipettieren Sie es in eine Vertiefung. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Proben.
  8. Lassen Sie das Gel etwa 30 Minuten lang bei 100 V laufen und bilden Sie dann das Gel ab, indem Sie es auf ein Tablett laden, es in das Gel-Imaging-System legen und den Anweisungen der jeweiligen Systemsoftware folgen (siehe Materialtabelle). Entscheiden Sie, ob Sie fortfahren möchten, basierend auf den Fragmentierungsgrößen, die im Durchschnitt zwischen 150 und 500 bp liegen sollten (Abbildung 2).

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Abbildung 2: Überprüfung der Fragmentgröße. Nach der Beschallung wird eine Teilmenge der Probe entvernetzt, gereinigt und auf ein Agarosegel aufgebracht, um sicherzustellen, dass das Chromatin auf Fragmentgrößen zwischen 150 und 500 bp geschert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Immunpräzipitation (IP)

  1. Überprüfen Sie mit einer Pipette das Volumen der Hauptprobe, die während der DNA-Extraktion auf Eis gehalten wurde. 10% Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 1% zugeben.
  2. Die Probe wird bei 20.000 x g bei 4 °C 10 Minuten lang geschleudert und dann der Überstand mit einer Pipette in ein sauberes Röhrchen überführt.
    HINWEIS: Der Versuch kann hier pausiert werden, indem die Probe bei −80 °C für bis zu 2 Monate eingefroren wird. Die Details der folgenden IP-Schritte müssen für jedes Experiment angepasst und optimiert werden. Die Menge an Antikörpern pro IP muss möglicherweise optimiert werden.
  3. Messen Sie die Chromatinkonzentration unter Verwendung eines Lysepuffers als Blindwert gemäß den Anweisungen eines verfügbaren DNA-Konzentrationsmesssystems (siehe Materialtabelle).
  4. Abhängig vom Probenvolumen und der Anzahl der geplanten IP ist das Gesamtvolumen der Probe zu erhöhen, indem 10 % Triton X-100 und 100x PIC (siehe Materialtabelle) zu Endkonzentrationen von 1 % bzw. 1x hinzugefügt werden. Es wird empfohlen, 100 μg Chromatin in einem Gesamtvolumen von 1.000 μl zu verwenden.
  5. Verteilen Sie das Volumen für jede IP auf ein separates 1,5-ml-Röhrchen mit geringer Retention (siehe Materialtabelle). Für die ChIP-qPCR geben Sie das entsprechende Probenvolumen in ein weiteres 1,5-ml-Röhrchen als Scheinkontrolle. Nehmen Sie 10 % der Lautstärke der IPs als Eingangsregler und lagern Sie sie bei -20 °C.
  6. Geben Sie 4 μg Antikörper (hier H3K4me3-Antikörper, siehe Materialtabelle) zu jedem jeweiligen IP hinzu. Fügen Sie dem Mock nichts hinzu. Inkubieren Sie die IP-Reaktionen und den Mock auf dem Rohrrotator bei 12 U/min und bei 4 °C über Nacht.

7. Wiederherstellung der Immunkomplexe mit magnetischen Kügelchen

HINWEIS: Vermeiden Sie immer das Austrocknen der Magnetperlen; Halten Sie sie mit Flüssigkeit bedeckt oder füllen Sie die Lösungen so schnell wie möglich auf. Arbeiten Sie immer eine Probe nach der anderen.

  1. Drehen Sie die magnetischen Kügelchen (siehe Materialtabelle) vorsichtig um, um sie zu mischen.
  2. Bereiten Sie 10 ml Blockierungslösung (Tabelle 1) frisch am Tag vor und mischen Sie sie vorsichtig.
  3. Schneiden Sie die Spitze einer Pipettenspitze ab, um den Durchmesser zu vergrößern, und geben Sie 50 μl Magnetkügelchen in separate Röhrchen (ein Röhrchen pro IP und eines für den Mock).
  4. Geben Sie 1 ml Blockierungslösung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie sie auf einem Rotator bei 12 U/min und 4 °C für 30 Minuten.
  5. Legen Sie die Kügelchen in der Blockierungslösung auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis sie sich getrennt haben. In der Zwischenzeit werden die IP-Reaktionen bei 2.000 x g für 3-5 s bei Raumtemperatur heruntergefahren, um alle Rückstände von den Wänden zu entfernen.
  6. Entfernen und entsorgen Sie mit einer Pipette den Überstand der Blockierungslösung und spülen Sie dann die Kügelchen mit einer der Proben oder dem Mock von der Wand. Geben Sie die Mischung zurück in das entsprechende Röhrchen mit geringer Retention und fahren Sie dann mit der nächsten Probe fort.
  7. Inkubieren Sie alle Röhrchen auf einem Rotator bei 12 U/min und 4 °C für 3 h.

8. Waschen, Elution und Vernetzungsumkehr

  1. Bereiten Sie die Waschpuffer und den TE-Salzpuffer (Tabelle 1) während der Inkubation der Immunkomplexwiederherstellung vor.
  2. Platzieren Sie nach der Inkubation die IPs und das Mock auf dem Magnetgestell und warten Sie etwa 10-20 Sekunden, bis sich die Magnete getrennt haben.
  3. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml Waschpuffer mit wenig Salz hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Reaktionen, nehmen Sie dann die Röhrchen aus dem Magnetgestell und mischen Sie, bis die Kügelchen aufgehängt sind.
  4. Auf einem Rotator bei 12 U/min und 4 °C 5 min inkubieren.
  5. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell, entfernen Sie den Waschpuffer mit niedrigem Salzgehalt, fügen Sie dann 1 ml Waschpuffer mit hohem Salzgehalt hinzu und inkubieren Sie wie in Schritt 8.4.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 8.3-8.5 noch einmal für insgesamt vier Wäschen abwechselnd mit niedrigem und hohem Salzgehalt.
    HINWEIS: Der Waschpuffer mit hohem Salzgehalt ist sehr aggressiv und sollte in jedem Waschschritt nur genau 5 min verwendet werden.
  7. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie ihn mit 1 ml TE-Salzpuffer. Wiederholen Sie dies noch einmal. Spülen Sie nach dem zweiten Waschen alle Perlen von der Tubenkappe aus.
  8. Stellen Sie den Elutionspuffer (Tabelle 1) während der Wäschen her. Nach dem Verwerfen der zweiten TE-Salzpufferwäsche fügen Sie jeder Reaktion 210 μl Elutionspuffer hinzu.
  9. Suspendieren Sie die magnetischen Kügelchen und eluieren Sie bei 65 °C und schütteln Sie sie 15 Minuten lang bei 700 U/min.
  10. Legen Sie die Reaktionen auf das Magnetgestell, sammeln Sie das Eluat und geben Sie es in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen.
  11. Wiederholen Sie den Elutionsvorgang mit weiteren 210 μl Elutionspuffer und fügen Sie das Eluat zur ersten Charge hinzu, um ein endgültiges Volumen von 420 μl Eluierung pro IP und Mock zu erhalten.
  12. Nehmen Sie den Eingang aus dem Gefrierschrank und fügen Sie Elutionspuffer auf ein Gesamtvolumen von 420 μl hinzu.
  13. Reverse Cross-Linking aller Eluate und des Eingangs, indem sie über Nacht bei 65 °C und 700 U/min inkubiert werden.

9. Protein- und RNA-Verdauung und DNA-Reinigung

  1. Verdünnen Sie die SDS-Konzentration (siehe Materialtabelle) auf 0,5 %, indem Sie dem Eluat und dem Input 420 μl TE-Salzpuffer zusetzen.
  2. Für den RNA-Verdau 10 μl RNase-Cocktail zugeben (siehe Materialtabelle) und 30 min bei 42 °C bei 700 U/min inkubieren.
  3. Für den Proteinverdau 8 μl Proteinase K (siehe Materialtabelle) zu allen hinzufügen und 1 h bei 55 °C bei 700 U/min inkubieren.
  4. Befolgen Sie für die DNA-Aufreinigung das "Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol for MicroChIP"23 mit einigen Anpassungen:
    1. Bereiten Sie die Röhrchen mit Phasen-Lock-Gel vor (siehe Materialtabelle), indem Sie das Gel 1 Minute lang bei Raumtemperatur bei 20.000 x g bei 20.000 x g auf den Boden des Röhrchens schleudern.
    2. Geben Sie unter einem Abzug eine Probe und das gleiche Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) in jedes Röhrchen. Schütteln Sie die Tuben kräftig und wirbeln Sie sie kurz, bis sie eine schaumige weiße Schicht bilden.
      ACHTUNG: Das Gemisch ist giftig, ätzend und gesundheitsgefährdend.
    3. 10 min bei 4 °C und 20.000 x g schleudern. Prüfen Sie, ob die wässrige Phase klar ist.
    4. Die wässrige Phase mit einer Pipette in ein frisches Röhrchen überführen. Je nach voraussichtlichem Probenvolumen sind zwei frische Röhrchen pro Probe erforderlich. Übertragen Sie in diesem Fall die Hälfte der Probe aus dem ersten Röhrchen in ein zweites Röhrchen.
    5. Geben Sie 1/10 des Volumens in 3 M Natriumacetat (NaAc, z. B. 40 μl für eine 400 μl Probe) und 10 μl 5 mg/ml lineares Acrylamid zu jeder Probe und invertieren Sie es zum Mischen.
    6. Fügen Sie das 2-fache des Probenvolumens in 100 % Ethanol hinzu (z. B. 800 μl für eine Probe von 400 μl) und schütteln Sie es kräftig. Nicht vortexen, da dies die DNA beschädigen kann.
    7. Inkubieren bei -20 °C über Nacht oder bei -80 °C für 30 min.
    8. Kühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C ab und schleudern Sie die Proben dann 30 Minuten lang bei 15.000 x g , um die DNA zu pelletieren.
    9. Die Pellets vorsichtig dekantieren und anschließend mit 1 mL 70% EtOH waschen. Schleudern Sie 5 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C.
    10. Vorsichtig dekantieren und dann erneut einige Sekunden schleudern. Verwenden Sie eine Pipette, um das gesamte Ethanol zu entfernen. Wenn noch ein kleines Stück übrig ist, kann es helfen, sich wieder zu drehen.
    11. Resuspendieren Sie die Pellets in 30 μl nukleasefreiem Wasser (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Wenn es mehrere Röhrchen pro Probe gibt, resuspendieren Sie ein Pellet in 30 μl, geben Sie es in das nächste Röhrchen und resuspendieren Sie das nächste Pellet in denselben 30 μl.
  5. Messen Sie die DNA-Konzentration und lagern Sie die Probe dann bei -20 °C.

Ergebnisse

Gemäß dem obigen Protokoll wurde DNA, die mit der Trimethylierung von Histon-3-Lysin-4 (H3K4me3) assoziiert ist, immunpräzipitiert. Der Antikörper in ChIP-seq-Qualität wurde zuvor bei der Seeanemone Nematostella vectensis7 eingesetzt und hier durch die Immunfluoreszenzfärbung von E . diaphana-Gewebeschnitten validiert (Abbildung 3). Die DNA-Ausbeute hängt zwar von der Menge des Einsatzmaterials ab, lag aber regelmäßig bei etwa 100 ng/μL. Die gewonnenen DNA-Fragmente wurden mittels Sequenzierung und qPCR analysiert (Primerliste in Supplementary File 1).

Eine Sequenzierungstiefe von 40 Millionen Reads ergab ~17,6 Millionen einzigartig kartierte Reads. Nach Qualitätskontrollen wurden die Roh-Reads getrimmt und mit Hilfe von Bowtie24 auf das Genom von E. diaphana abgebildet (siehe Materialtabelle). Die modellbasierte Analyse der ChIP-Seq-Daten mit MACS (siehe Table of Materials) identifizierte insgesamt 19.107 Peaks25. Wie für H3K4me3 erwartet, befanden sich die meisten Peaks in der Nähe der transkriptionellen Startstelle (TSS), und die Häufigkeit der Peakzählung nahm auf beiden Seiten des TSS, insbesondere aber in Richtung des Genkörpers, stark ab (Abbildung 4).

Aus den Sequenzierungsdaten wurden drei Gene mit hohen Peaks um ihre TSS identifiziert, und qPCR-Primer wurden so konzipiert, dass sie auf mehrere Loci mit hohen Peaks innerhalb dieser Gene abzielen. Die qPCR-Daten wurden mit der Percentage-of-Input-Methode normalisiert (Abbildung 5). Es wurde eine hohe Anreicherung von H3K4me3 im Vergleich zu den Eingabe- und Mock-Steuerelementen beobachtet. Der prozentuale Anteil des Inputs schwankte zwischen 2,7 % und 10,7 %, wobei Unterschiede in der Anreicherung zwischen Genen und zwischen verschiedenen Loci innerhalb desselben Gens beobachtet wurden.

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Abbildung 3: Immunfluoreszenzfärbung von H3K4me3. Ein Gewebeschnitt von E. diaphana wurde mit (A) blauer Hoechst-Nukleinsäurefärbung und (B) einem gelben Fluorophor-markierten Sekundärantikörper gegen den Primärantikörper gegen H3K4me3 gefärbt. (C) Eine Überlappung von A und B , die eine Kolokalisation im Zellkern zeigt. Maßstabsleiste = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Hohe Peak-Zählfrequenz um die transkriptionelle Startstelle. Die Verteilung der Peak-Zählfrequenz der H3K4me3-Modifikation über stromaufwärts (-) und stromabwärts (+) 2.000 bp um die transkriptionelle Startstelle (TSS). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: H3K4me3 ChIP-qPCR bei Exaiptasia diaphana. Die Ergebnisse werden in Prozent (%) der Eingabe dargestellt. Für die ChIP-qPCR wurden Loci in der Nähe der transkriptionellen Startstelle der jeweiligen Gene (AIPGENE12312, AIPGENE26042 und AIPGENE5950) ausgewählt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung zwischen den Replikaten an, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Liste der für die qPCR verwendeten Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Gemäß dem obigen Protokoll wurde die gewonnene DNA erfolgreich für die ChIP-qPCR und ChIP-Seq verwendet. Das gleiche allgemeine Peakprofil für H3K4me3, das zuvor von anderen Organismen 26,27,28 berichtet wurde, wurde hier erhalten, mit dem höchsten Peak um das TSS und einer hohen Anreicherung an den erwarteten Stellen in der ChIP-qPCR. Die relativ hohe Anzahl von mehrfach kartierten Reads in den ChIP-Seq-Daten könnte durch PCR-Duplikate verursacht worden sein. Die Anzahl der eindeutig kartierten Reads könnte durch Änderungen am Protokoll zur Vorbereitung der DNA-Bibliothek erhöht werden, um PCR-Duplikate zu reduzieren. Es gibt mehrere Normalisierungsmethoden für ChIP-qPCR-Daten, wobei die hier vorgestellte Methode des prozentualen Anteils der Eingabe häufiger verwendet wird. Bei dieser Methode werden die IP- und Mock-Samples direkt auf die Eingabe normalisiert, mit dem Nachteil, dass die Eingabe während der ChIP anders verarbeitet wird als die IP- und Mock-Samples, was zu Fehlern führen kann. Die alternative Fold-Anreicherungsmethode normalisiert das Signal des IP basierend auf dem Signal des Mocks unter Verwendung der gleichen Primer-Sätze, wodurch ein Signal-über-Hintergrund-Verhältnis entsteht. Die Signalintensität der Mock-Stichprobe kann jedoch stark variieren, was wiederum große Auswirkungen auf die Daten hat. Eine ausführliche Diskussion der ChIP-qPCR und der Datennormalisierung findet sich in Haring et al.29.

Eine wesentliche Änderung der oben vorgestellten Methode im Vergleich zu gängigen ChIP-Protokollen ist die viel längere Vernetzungszeit, von etwa 15 Minuten für Histonproteine bis hin zu einer Inkubation über Nacht. Das Hauptziel dieser Anpassung ist es, das Eindringen des Fixiermittels Formaldehyd durch die Schleimschicht in das tiefere Gewebe von E. diaphana zu erleichtern, um die Protein-DNA-Wechselwirkungen im Zellkern zu erhalten. Die Optimierung dieses Schritts ist entscheidend, um eine ausreichende Vernetzung zu gewährleisten, um die Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erhalten, ohne dass die Vernetzung durch Ultraschall so stark erfolgt, dass die Scherung des Chromatins durch Beschallung unwirksam wird. Die Zugabe von Reinigungsmitteln wie SDS kann auch die Beschallungseffizienz erhöhen29. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine lange Inkubation mit Formaldehyd den Homogenisierungsschritt erleichtert und zu einer feiner und gleichmäßiger gemahlenen Probe im Vergleich zu frischen oder gefrorenen Anemonen führte, die vor dem Vernetzungsschritt homogenisiert wurden. Die empfohlenen Bereiche der Fragmentlängen variieren zwischen 100 bp und 1.000 bp29,30 und können vom Zielprotein abhängen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass jeder Benutzer die Beschallungsbedingungen optimiert, um die gewünschte Fragmentlänge mit so wenig Beschallungsleistung wie möglich zu erreichen, da eine Überbeschallung die Proteine denaturieren und somit das IP31 beeinträchtigen kann. Eine weitere Einschränkung von ChIP ist die benötigte Materialmenge, die insbesondere relativ kleine Organismen wie Anemonen betrifft; Dieses Problem wurde behoben, indem der Probenverlust zwischen den Schritten reduziert wurde. Nach der Homogenisierung der Probe wurde sie sofort lysiert, wodurch mehrere übliche Schritte der Kernpräparation entfielen. Der Probenpool von 20 Anemonen enthielt im Allgemeinen genügend Chromatin für drei IPs und sowohl Mock- als auch Input-Kontrollen. Die Menge des Ausgangsmaterials (d.h. die Anzahl der Anemonen) könnte in Zukunft weiter reduziert werden, insbesondere bei einer ChIP mit nur einem Zielprotein. Je nach der beabsichtigten nachgelagerten Methode sollten die Kontrollen angepasst werden; für ChIP-qPCR sollte erwogen werden, zusätzliche Kontrollen29 einzuschließen, während für ChIP-seq der Mock zugunsten einer Eingabekontrolle weggelassen werden kann.

Obwohl die Antikörpervalidierung außerhalb des Rahmens dieses Protokolls liegt und daher hier nur kurz angesprochen wurde, ist sie ein kritischer Schritt vor der Durchführung von ChIP. Insbesondere bei der Verwendung kommerzieller Antikörper an wirbellosen Spezies kann die Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern für die gewünschten Ziele eine Einschränkung darstellen. Im ersten Schritt wurde die H3-N-terminale Schwanzsequenz von E. diaphana und anderen Modellorganismen, einschließlich Zebrafischen und Mäusen, verglichen und für hoch konserviert befunden12. Die Antikörperspezifität wurde dann mittels Immunfluoreszenz getestet, bei der die Signale der Nukleinsäure und des Antikörpers kolokalisiert wurden. Das aus den Sequenzierungsdaten gewonnene Peak-Profil von H3K4me3 um das TSS gibt weitere Sicherheit hinsichtlich der Spezifität des Antikörpers.

Eine weitere Überlegung in Bezug auf die Antikörperspezifität ist die Möglichkeit einer Wechselwirkung mit den symbiotischen Dinoflagellaten, die E. diaphana sowie viele andere Anthozoen in ihren Zellen beherbergen. Transkriptomanalysen in Dinoflagellaten der Gattungen Lingulodinium32 und Symbiodinium33 haben histonkodierende Gene gefunden, darunter Kernhiston H3 und mehrere H3-Varianten bei niedrigen Expressionsniveaus, und das Ausmaß der funktionellen Konservierung des Histoncodes ist unklar34. Marinov und Lynch34 verglichen die Sequenzkonservierung von N-terminalen Schwänzen der H3-Variante innerhalb und zwischen Dinoflagellaten-Arten, und Symbiodiniaceae-Arten zeigten eine hohe Divergenz um Lysin 4 in der Schwanzsequenz, insbesondere wenn man die Kongruenz benachbarter Aminosäuren zu Lysin 4 als Faktor berücksichtigt. Es wurde auch gezeigt, dass sich diese Region von anderen Modellarten wie Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster und Saccharomyces cerevisiae unterscheidet, die mit der Sequenz von E. diaphanaübereinstimmen 12. Daher ist das Risiko einer unbeabsichtigten Wechselwirkung des Antikörpers gegen H3K4me3 mit dem Dinoflagellaten H3 gering. Darüber hinaus sind die Sequenzen nur auf das Genom von E. diaphana ausgerichtet, und die qPCR-Primer sollten spezifisch für E. diapana-Sequenzen sein, um eine zusätzliche Filtrationsschicht für unbeabsichtigt ausgefällte Sequenzen zu bieten.

Das vorgestellte ChIP-Protokoll liefert ausreichend DNA für die qPCR sowie für die Sequenzierung der nächsten Generation, und obwohl wahrscheinlich eine individuelle Optimierung durch jeden Benutzer erforderlich sein wird, bietet es einen Ausgangspunkt für die verstärkte Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in benthischen Nesseltieren, möglicherweise im Zusammenhang mit Symbiose und Umweltveränderungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 kb Plus DNA LadderInvitrogen10787018
100% Ethanol
15 mL Falcon Röhrchen
16% Formaldehyd Lösung (w/v), MethanolfreiThermo scientific28906
5 mL Röhrchen
5PRIME Phase Lock RöhrchenQuantabio2302820Phase Lock Gel - leichte
AGANI Nadel 25 GTerumoAN*2516R1
Agarose
Rinderserum AlbuminSigma-AldrichA7030
BowtieOpen Source, erhältlich von https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
Branson Sonifier 250BransonSonicator 
Zentrifuge Eppendorf5430 RMit Rotoren für 15 mL und 1,5 mL Röhrchen
ChIP-Grade Antikörper (hier polyklonaler H3K4me3 Antikörper)DiagenodeC15410003
Complete EDTA-freier Proteasehemmer CocktailRoche118735800012 Tabletten/mL Wasser für 100x Vorrat
Deckglasvwr48393 194
Einwegspatelvwr80081-188
DNA-Aufreinigungskit (hier QIAGEN QIAquick PCR-Aufreinigungskit)QIAGEN28104
Dounce GewebemühleWheatonfester Stößel
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) 1xgibco14190-094
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-Aldrich3609
EGTASigma-Aldrich324626
Elektrophoresesystem
Ethidiumbromid
FASTQC v0.11.9Software
Gel Doc EZ DokumentationssystemBio-Rad1708270Gel Imaging
System GlycinSigma-Aldrich50046
Injekt-F Tuberkulin-Spritze 1 mLB. Braun9166017V
Lineares Acrylamid (5 mg/ml)InvitrogenAM9520
1,5-ml-Röhrchen
Magnetisches Trenngestellfür 1,5-ml-Röhrchen
Mikroskop
Objektträger
Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS)Open Source
Mörser und Stößel, Porzellan
NanoDrop 2000c SpektralphotometerThermo scientific ND-2000C
N-LauroylsarcosinSigma-Aldrich61739
Nukleasefreies Wasser
Pasteur-Pipette
Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol Gemisch (25:24:1)Sigma-Aldrich77617
Proteinase K (20 mg/ml)AmbionAM2546
Purple Loading Farbstoff 6xNew England BioLabsB7024S
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen
RNase Cocktail EnzymmischungInvitrogenAM2286RNase A = 500 U/ml, RNase T1 = 20000 U/ml
NatriumacetatSigma-AldrichS2889
NatriumchloridSigma-AldrichS9888
NatriumdesoxycholatSigma-Aldrich30970
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
TAE Puffer
ThermomixerEppendorf5384000012
Tris BaseSigma-Aldrich10708976001
Triton X-100 LösungSigma-Aldrich93443
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061Gefahr: kann Krebs erzeugen. Im Verdacht, die Fruchtbarkeit oder das ungeborene Kind zu schädigen
Schlauchrotator SB3Stuart
UltraPure SDS Lösung, 10%Invitrogen15553027
Vakuumpumpe
mit geringer Retention

Referenzen

  1. Pörtner, H. -O. 2022: Summary for Policymakers. Climate Change 2022: Impacts, Adaptation, and Vulnerability. Contribution of Working Group II to the Sixth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2022).
  2. Cziesielski, M. J., Schmidt-Roach, S., Aranda, M. The past, present, and future of coral heat stress studies. Ecology and Evolution. 9 (17), 10055-10066 (2019).
  3. Eirin-Lopez, J., Putnam, H. Marine environmental epigenetics. Annual Review of Marine Science. 11, 335-368 (2021).
  4. Rädecker, N. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9 (214), (2018).
  5. Baumgarten, S. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. PNAS. 112 (38), 11893-11898 (2015).
  6. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  7. Schwaiger, M. Evolutionary conservation of the eumetazoan gene regulatory landscape. Genome Research. 24 (4), 639-650 (2014).
  8. Zhang, X., Jacobs, D. A broad survey of gene body and repeat methylation in cnidaria reveals a complex evolutionary history. Genome Biology and Evolution. 14 (2), evab284(2022).
  9. Schwaiger, M. An ancestral Wnt-Brachyury feedback loop in axial patterning and recruitment of mesoderm-determining target genes. Nature Ecology & Evolution. 6 (12), 1921-1939 (2022).
  10. Ozment, E., et al. Cnidarian hair cell development illuminates an ancient role for the class IV POU transcription factor in defining mechanoreceptor identity. Elife. 10, e74336(2021).
  11. Baumgarten, S., et al. Evidence for miRNA-mediated modulation of the host transcriptome in cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Molecular Ecology. 27 (2), 403-418 (2018).
  12. Li, Y. DNA methylation regulates transcriptional homeostasis of algal endosymbiosis in the coral model Aiptasia. Science Advances. 4 (8), eaat2142(2018).
  13. Rodriguez-Casariego, J. A., Cunning, R., Baker, A. C., Eirin-Lopez, J. M. Symbiont shuffling induces differential DNA methylation responses to thermal stress in the coral Montastraea cavernosa. Molecular Ecology. 31 (2), 588-602 (2021).
  14. Putnam, H. M., Davidson, J. M., Gates, R. D. Ocean acidification influences host DNA methylation and phenotypic plasticity in environmentally susceptible corals. Evolutionary Applications. 9 (9), 1165-1178 (2016).
  15. Weizman, E., Levy, O. The role of chromatin dynamics under global warming response in the symbiotic coral model Aiptasia. Communications Biology. 2, 282(2019).
  16. Liew, Y. J. Epigenome-associated phenotypic acclimatization to ocean acidification in a reef-building coral. Science Advances. 4 (6), eaar8028(2018).
  17. Liew, Y. J. Intergenerational epigenetic inheritance in reef-building corals. Nature Climate Change. 10 (3), 254-259 (2020).
  18. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), e91101(2014).
  19. Huang, C., et al. Identification of long non-coding RNAs in two anthozoan species and their possible implications for coral bleaching. Scientific Reports. 7, 5333(2017).
  20. Rodriguez-Casariego, J. A., et al. Coral epigenetic responses to nutrient stress: Histone H2A.X phosphorylation dynamics and DNA methylation in the staghorn coral Acropora cervicornis. Ecology and Evolution. 8 (23), 12193-12207 (2018).
  21. Bodega, B., et al. A cytosolic Ezh1 isoform modulates a PRC2-Ezh1 epigenetic adaptive response in postmitotic cells. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 444-452 (2017).
  22. Jordán-Pla, A., Visa, N. Considerations on experimental design and data analysis of chromatin immunoprecipitation experiments. Chromatin Immunoprecipitation., edited by Visa, N., Jordán-Pla, A. Visa, N., Jordán-Pla, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 9-28 (2017).
  23. ENCODE. Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol for MicroChIP. , Stanford University. Available from: https://www.encodeproject.org/documents/ (2023).
  24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, R25(2009).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nature Protocols. 7, 1728-1740 (2012).
  26. Howe, F. S., Fischl, H., Murray, S. C., Mellor, J. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. BioEssays. 39 (1), e201600095(2017).
  27. Zhang, Z., Shi, L., Dawany, N., Kelsen, J., Petri, M. A., Sullivan, K. E. H3K4 tri-methylation breadth at transcription start sites impacts the transcriptome of systemic lupus erythematosus. Clinical Epigenetics. 8, 14(2016).
  28. Li, X. High-resolution mapping of epigenetic modifications of the rice genome uncovers interplay between DNA methylation, histone methylation, and gene expression. The Plant Cell. 20, 2-276 (2008).
  29. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2014).
  30. Landt, S. G. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  31. Raha, D., Hong, M., Snyder, M. ChIP-Seq: A method for global identification of regulatory elements in the genome. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, Unit 21.19.1-Unit 21.19.14 (2010).
  32. Roy, S., Morse, D. A full suite of histone and histone modifying genes are transcribed in the dinoflagellate Lingulodinium. PLoS One. 7 (4), e34340(2012).
  33. Bayer, T., et al. Symbiodinium transcriptomes: Genome insights into the dinoflagellate symbionts of reef-building corals. PLoS One. 7 (4), e35269(2012).
  34. Marinov, G. K., Lynch, M. Diversity and divergence of dinoflagellate histone proteins. G3 Genes, Genomes, Genetics. 6 (2), 397-422 (2016).

Nachdrucke und Genehmigungen

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ChIP-SeqEpigenetik der CnidariaHistonmodifikationenProtein-DNA-InteraktionenH3K4-Trimethylierungquantitative PCRChromatinextraktionimmunfluoreszenzzytochemische Färbung
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