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Methodenartikel

Echtzeit-Quantifizierung der Auswirkungen von IS200/IS605-Familien-assoziiertem TnpB auf die Transposonaktivität

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DOI:

10.3791/64825

⸱

20. Januar 2023

 ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Microbiology Program, University of California, 3Biophysics Program, University of California

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll skizziert, um Live-Echtzeit-Bildgebung durchzuführen, um zu quantifizieren, wie das akzessorische Protein TnpB die Dynamik der Transposition in einzelnen lebenden Escherichia coli-Zellen beeinflusst.

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll skizziert, um eine Live-Echtzeit-Bildgebung der transponierbaren Elementaktivität in lebenden Bakterienzellen unter Verwendung einer Reihe von fluoreszierenden Reportern durchzuführen, die mit der Transposition gekoppelt sind. Insbesondere wird gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung verwendet werden kann, um die Auswirkungen des akzessorischen Proteins TnpB auf die Aktivität des transponierbaren Elements IS608, einem Mitglied der IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente, zu bewerten. Die IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente sind reichlich vorhandene mobile Elemente, die mit einem der unzähligen Gene in der Natur, tnpB, verbunden sind. Sequenzhomologien deuten darauf hin, dass das TnpB-Protein ein evolutionärer Vorläufer von CRISPR/Cas9-Systemen sein könnte. Darüber hinaus hat TnpB erneut Interesse geweckt, da gezeigt wurde, dass es als Cas-ähnliche RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease wirkt. Die Auswirkungen von TnpB auf die Transpositionsraten von IS608 werden quantifiziert, und es wird gezeigt, dass die Expression von TnpB von IS608 zu ~5x erhöhter Transposonaktivität im Vergleich zu Zellen ohne TnpB-Expression führt.

Einleitung

Transposable Elements (TEs) sind genetische Elemente, die innerhalb ihres Wirtsgenoms durch Exzision mobilisieren oder kopieren und anschließend genomische Reintegration katalysieren. TEs existieren in allen Lebensbereichen, und die Transposition strukturiert das Wirtsgenom um und mutiert kodierende und Kontrollregionen1. Dies erzeugt Mutationen und Diversität, die eine wichtige Rolle in der Evolution2,3, der Entwicklung4,5 und mehreren menschlichen Krankheiten6, einschließlich Krebs7, spielen.

Unter Verwendung neuartiger genetischer Konstrukte, die Aspekte der Transpositionsaktivität an fluoreszierende Reporter koppeln, beschrieben unsere früheren Arbeiten die Entwicklung eines experimentellen Systems basierend auf dem bakteriellen TE IS608, einem Vertreter der weit verbreiteten IS200/IS605-Familie von TEs, das die Echtzeitvisualisierung der Transposition in einzelnen lebenden Zellen ermöglicht8 (Abbildung 1). Das TE-System ist in Abbildung 1A dargestellt. Die TE umfasst die Transposase-kodierende Sequenz, tnpA, flankiert von Left End (LE) und Right End (RE) imperfect palindromic repeats (IPs), die die Erkennungs- und Exzisionsstellen für TnpA sind. tnpA wird unter Verwendung des Promotors PLTetO1 exprimiert, der durch den Tet-Repressor unterdrückt wird und mit Anhydrotetracyclin (aTc)9 induzierbar ist. Der TE teilt die -10- und -35-Sequenzen eines konstitutiven PlacI Q1-Promotors10 für den blauen Reporter mCerulean3 11 auf. Wie in Abbildung 1C gezeigt, kann der TE herausgeschnitten werden, wenn die Produktion von tnpA induziert wird, was zu einer Rekonstitution des Promotors führt. Die produzierte Zelle exprimiert mCerulean3 und fluoresziert blau. Der N-Terminus von TnpA ist mit dem gelben Reporter Venus12 verschmolzen, was die Messung der TnpA-Spiegel durch gelbe Fluoreszenz ermöglicht.

IS608 und andere Mitglieder der IS200/IS605-Familie von Transposons kodieren typischerweise auch für ein zweites Gen der bisher unbekannten Funktion, tnpB13. Die TnpB-Proteine sind eine enorm häufige, aber unvollkommen charakterisierte Familie von Nukleasen, die von mehreren bakteriellen und archaealen TEs14,15 kodiert werden, die oft nur aus tnpB16 bestehen. Darüber hinaus haben neuere Studien das Interesse an TnpB erneuert, indem sie festgestellt haben, dass TnpB als CRISPR / Cas-ähnliche programmierbare RNA-gesteuerte Endonuklease fungiert, die unter verschiedenen Bedingungen entweder dsDNA- oder ssDNA-Brüche erzeugt17,18. Es bleibt jedoch unklar, welche Rolle TnpB bei der Regulierung der Umsetzung spielen könnte. Um die Auswirkungen von TnpB auf die IS608-Transposition in Echtzeit zu visualisieren, wurde eine Version des Transposons, einschließlich der kodierenden Region von TnpB mit einer N-terminalen Fusion zum rot fluoreszierenden Protein mCherry, erstellt.

Ergänzend zu detaillierteren Bulk-Level-Studien, die vom Kuhlman-Labor19 durchgeführt wurden, wird hier gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung der Transposonaktivität den Einfluss von TnpB oder anderen akzessorischen Proteinen auf die Transpositionsdynamik quantitativ aufdecken kann. Durch die Fusion von TnpB zu mCherry werden die einzelnen transpositionalen Ereignisse durch blaue Fluoreszenz identifiziert und mit Expressionsniveaus von TnpA (gelbe Fluoreszenz) und TnpB (rote Fluoreszenz) korreliert.

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Protokoll

1. Vorbereitung von Bakterienkulturen

  1. E. coli-Stamm MG1655 mit Plasmidtransposon-Konstrukten (zuvor beschrieben in Kim et al.8) über Nacht in LB mit den entsprechenden Antibiotika (25 μg/ml Kanamycin, siehe Materialtabelle) bei 37 °C züchten.
    HINWEIS: Die Sequenzen der verwendeten Konstrukte und die zugehörigen Sequenzen sind als GenBank20-Zugangsnummern OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 und OP717085 verfügbar.
  2. Um ein exponentielles Wachstum im stationären Zustand zu erreichen, verdünnen Sie Kulturen ≥100-fach in das M63-Medium (100 mMKH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg / ml Thiamin [Vitamin B1]), ergänzt mit einer Kohlenstoffquelle (0,5% w/v Glukose hier) und geeigneten Antibiotika (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Züchten Sie Kulturen bei 37 °C, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD600) ~0,2 erreicht. Die Kulturen sind einsatzbereit.

2. Objektträgervorbereitung

  1. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie M63 mit 0,5% w/v Glucose und 1,5% w/v Agarose in der Mikrowelle kochen, um die Agarose zu schmelzen und sicherzustellen, dass sie vollständig geschmolzen und gut gemischt ist.
  2. Lassen Sie die Mischung auf ~55 °C abkühlen, bevor Sie Antibiotika und Induktoren (25 μg/ml Kanamycin und 10 ng/μL Anhydrotetracyclin [aTc], siehe Materialtabelle) hinzufügen.
  3. Legen Sie einen Objektträger auf die Werkbank. Stapeln Sie zwei weitere Folien senkrecht zur ersten und legen Sie eine weitere oben parallel zur unteren Folie auf. Stellen Sie sicher, dass zwischen den unteren und oberen Folien ein Spalt vorhanden ist, der einer Objektträgerstärke entspricht. Pipettieren Sie ~1 mL der M63-Agarosemischung langsam in diesen Spalt zwischen den Objektträgern, um ein kleines Gelquadrat zu erzeugen.
  4. Sobald das Gel erstarrt ist (~10-15 min), schieben Sie den oberen Objektträger, um ihn zu entfernen. Schneiden Sie das Agarosettenkissen mit einer Rasierklinge oder einem Messer ab. Dann pipetten Sie 2,5 μL der Kultur (Schritt 1.3) und legen Sie das Deckglas darauf.
  5. Verschließen Sie den Raum zwischen Objektträger und Deckglas mit Epoxidharz (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Epoxidharz trocknen und die Zellen setzen sich mindestens 1 h bei 37 °C auf dem Agarosepad ab.

3. Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie

  1. Die vorbereitete Probe (Schritt 1.3) wird auf ein Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) in einer auf 37 °C erhitzten und gehaltenen Umgebung gelegt.
    1. Stellen Sie die Belichtungszeiten entsprechend der Kamera ein, die für die Bildaufnahme verwendet wird. Stellen Sie die Beleuchtungsintensität ein, um das Photobleichen zu minimieren.
      HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde eine Expositionszeit von 2 s für jede Wellenlänge verwendet.
    2. Suchen Sie für jede Wellenlänge ein Sichtfeld (FOV) mit minimaler Fluoreszenz. Erfassen Sie Bilder, die während der Analyse für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden sollen.
  2. Richten Sie ein Protokoll ein, um Bilder in einem Raster bei verschiedenen Wellenlängen und in regelmäßigen Zeitintervallen zu erfassen.
    1. Kodieren Sie Zeitrafferaufnahmen in das Protokoll. Stellen Sie die Erfassungsfrequenz auf das gewünschte Zeitintervall (hier 20 min) und die gesamte Zeitrafferdauer auf die gewünschte Länge (24 h) ein.
    2. Kodieren Sie geeignete Wellenlängen in das Protokoll (abhängig vom verwendeten Konstrukt).
      HINWEIS: Der mCherry-Anregungspeak liegt bei 587 nm und der Emissionspeak bei 610 nm21; mVenus liegt bei 515 nm und 527 nm12, während mCerulean3 bei 433 nm und 475 nm11 liegt.
    3. Legen Sie die Rastergröße fest, die zwischen der gewünschten Anzahl von FOVs erfasst werden soll.
      HINWEIS: Die hier gezeigten repräsentativen Daten verwendeten 8 x 8 FOVs.

4. Bildanalyse

  1. Führen Sie die Hintergrundsubtraktion für jeden Farbkanal durch, indem Sie die entsprechenden Hintergrundbilder verwenden, die in Schritt 3.1.2 erfasst wurden. Für alle Analyseschritte verwenden wir Standardmodule der Open-Source-Plattform Fiji22 (siehe Materialtabelle).
  2. Nähern Sie sich der Gesamtpopulation zu jedem Zeitpunkt an, indem Sie den mCerulean-Kanal schwellieren und den Schwellenwertbereich durch die durchschnittliche Zellfläche dividieren.
  3. Um die eindeutigen Exzisionsereignisse zu zählen, nehmen Sie die Zeitableitung des mCerulean3-Kanals. Tun Sie dies, indem Sie aufeinanderfolgende Bilder im mCerulean3-Kanal subtrahieren. Die Exzisionsereignisse werden in der Zeitableitung als heller Fluoreszenzblitz detektiert.
    1. Schwelle des Stapels von Exzisionsereignissen, um unerwünschte Fluoreszenz zu eliminieren. Beachten Sie, dass dieser Prozess Teile der Exzisionen selbst ausschließt. Um dies zu beheben, erweitern Sie die Bilder, um die Exzisionen auf ihre ursprüngliche Größe wiederherzustellen.
      HINWEIS: Analysen mit ähnlichen Schwellenwert- und Bildanalysetechniken können auch an den anderen Fluoreszenzkanälen durchgeführt werden (z. B. Korrelation von Exzisionsereignissen mit Transposase-TnpA [gelbe Venusfluoreszenz] und TnpB [rote mCherry-Fluoreszenz].

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Ergebnisse

Diese Methode zur Visualisierung der Transposonaktivität in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht bei geringerem Durchsatz als Massenfluoreszenzmessungen die direkte Visualisierung der Transposonaktivität in einzelnen lebenden Zellen. Transposon-Exzisionsereignisse führen zur Rekonstitution des Promotors für mCerulean3 (Abbildung 1), was die Identifizierung von Zellen ermöglicht, die Transposonaktivität durch hellblaue Fluoreszenz durchlaufen (Abbildung 2, TnpB+: Supplement...

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Diskussion

Die hier vorgestellte einzigartige Methode zur Echtzeit-Bildgebung der Aktivität transponierbarer Elemente in lebenden Zellen ist ein empfindlicher Assay, der die Transposition in lebenden Zellen und in Echtzeit direkt nachweisen und diese Aktivität mit der Expression akzessorischer Proteine korrelieren kann. Während der Durchsatz geringer ist, als dies mit Massenmethoden erreicht werden kann, erreicht diese Methode detaillierte Messungen der TE-Aktivität und Proteinexpression in einzelnen lebenden Zellen.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Finanzielle Unterstützung für diese Forschung wurde durch Startkapital der University of California bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 Tonnen klares EpoxidDevcon31345
AgaroseSigma-Aldrich5066
AmmoniumsulfatSigma-AldrichAX1385-1
AnhydrotetracyclinhydrochloridSigma-Aldrich37919
Argon LaserMelles Griot35-IMA-840-015
Blauer Filter WürfelChromaBsp.: Z457/10X, EM: ET485/30M
D(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Eclipse Ti-E MikroskopNikonAbgekündigt
Eppendorf epTIPS Boxen und Nachfüllfächer, Volumen: 0,1 bis 10 & Mikro; L, Länge: 3,4 cm, 1,33 Zoll, PP (Polypropylen)Eppendorf North America Biotools22491504
Eppendorf epTIPS Boxen und Nachfüllschalen, Volumen: 50 bis 1000 &Mikro; L, Länge: 7,1 cm, 2,79 Zoll, PP (Polypropylen)Eppendorf North America Biotools22491555
Eisensulfat Acs 500 gFisher Scientific706834
FidschiFidschi (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Brühe, Miller (granuliert)Fisher ScientificBP9723-2 
GlasdeckelSlide Fisher Scientific12-542B 
KanamycinsulfatSigma-Aldrich1355006
Magnesiumsulfat Cert AcFisher ScientificXXM63SP3KG
MikroskopheizungWorld Precision Instruments96810-1
Kaliumphosphat MonobasischFisher Scientific17001H
ProScan III StufePrior
Roter Filter WürfelChromaBsp.: ET560/40X, Em: ET645/75M
Saphir 561 LP LaserCoherent1170412
Objektträger,Mikroskop Fisher Scientific125535B
ThiaminhydrochloridSigma-Aldrich (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 Laser LaunchNikon
Gelbfilter WürfelChromaBsp.: Z514/10X, EM: ET535/30M

Referenzen

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11(2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896(2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

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