Es wird ein Protokoll skizziert, um Live-Echtzeit-Bildgebung durchzuführen, um zu quantifizieren, wie das akzessorische Protein TnpB die Dynamik der Transposition in einzelnen lebenden Escherichia coli-Zellen beeinflusst.
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Methodenartikel
Echtzeit-Quantifizierung der Auswirkungen von IS200/IS605-Familien-assoziiertem TnpB auf die Transposonaktivität
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hier wird ein Protokoll skizziert, um eine Live-Echtzeit-Bildgebung der transponierbaren Elementaktivität in lebenden Bakterienzellen unter Verwendung einer Reihe von fluoreszierenden Reportern durchzuführen, die mit der Transposition gekoppelt sind. Insbesondere wird gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung verwendet werden kann, um die Auswirkungen des akzessorischen Proteins TnpB auf die Aktivität des transponierbaren Elements IS608, einem Mitglied der IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente, zu bewerten. Die IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente sind reichlich vorhandene mobile Elemente, die mit einem der unzähligen Gene in der Natur, tnpB, verbunden sind. Sequenzhomologien deuten darauf hin, dass das TnpB-Protein ein evolutionärer Vorläufer von CRISPR/Cas9-Systemen sein könnte. Darüber hinaus hat TnpB erneut Interesse geweckt, da gezeigt wurde, dass es als Cas-ähnliche RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease wirkt. Die Auswirkungen von TnpB auf die Transpositionsraten von IS608 werden quantifiziert, und es wird gezeigt, dass die Expression von TnpB von IS608 zu ~5x erhöhter Transposonaktivität im Vergleich zu Zellen ohne TnpB-Expression führt.
Einleitung
Transposable Elements (TEs) sind genetische Elemente, die innerhalb ihres Wirtsgenoms durch Exzision mobilisieren oder kopieren und anschließend genomische Reintegration katalysieren. TEs existieren in allen Lebensbereichen, und die Transposition strukturiert das Wirtsgenom um und mutiert kodierende und Kontrollregionen1. Dies erzeugt Mutationen und Diversität, die eine wichtige Rolle in der Evolution2,3, der Entwicklung4,5 und mehreren menschlichen Krankheiten6, einschließlich Krebs7, spiele....
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Protokoll
1. Vorbereitung von Bakterienkulturen
- E. coli-Stamm MG1655 mit Plasmidtransposon-Konstrukten (zuvor beschrieben in Kim et al.8) über Nacht in LB mit den entsprechenden Antibiotika (25 μg/ml Kanamycin, siehe Materialtabelle) bei 37 °C züchten.
HINWEIS: Die Sequenzen der verwendeten Konstrukte und die zugehörigen Sequenzen sind als GenBank20-Zugangsnummern OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 und OP717085 verfügbar. - Um ein exponentielles Wachstum im stationären Zustand zu erreichen, verdünnen Sie Kulturen ≥100-fach in das M63-Medium (100 mMKH 2 ....
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Ergebnisse
Diese Methode zur Visualisierung der Transposonaktivität in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht bei geringerem Durchsatz als Massenfluoreszenzmessungen die direkte Visualisierung der Transposonaktivität in einzelnen lebenden Zellen. Transposon-Exzisionsereignisse führen zur Rekonstitution des Promotors für mCerulean3 (Abbildung 1), was die Identifizierung von Zellen ermöglicht, die Transposonaktivität durch hellblaue Fluoreszenz durchlaufen (Abbildung 2, TnpB+: Supplement.......
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Diskussion
Die hier vorgestellte einzigartige Methode zur Echtzeit-Bildgebung der Aktivität transponierbarer Elemente in lebenden Zellen ist ein empfindlicher Assay, der die Transposition in lebenden Zellen und in Echtzeit direkt nachweisen und diese Aktivität mit der Expression akzessorischer Proteine korrelieren kann. Während der Durchsatz geringer ist, als dies mit Massenmethoden erreicht werden kann, erreicht diese Methode detaillierte Messungen der TE-Aktivität und Proteinexpression in einzelnen lebenden Zellen.
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Finanzielle Unterstützung für diese Forschung wurde durch Startkapital der University of California bereitgestellt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2 Tonnen klares Epoxid | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammoniumsulfat | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracyclinhydrochlorid | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blauer Filter Würfel | Chroma | Bsp.: Z457/10X, EM: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Mikroskop | Nikon | Abgekündigt | |
| Eppendorf epTIPS Boxen und Nachfüllfächer, Volumen: 0,1 bis 10 & Mikro; L, Länge: 3,4 cm, 1,33 Zoll, PP (Polypropylen) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxen und Nachfüllschalen, Volumen: 50 bis 1000 &Mikro; L, Länge: 7,1 cm, 2,79 Zoll, PP (Polypropylen) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Eisensulfat Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fidschi | Fidschi (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Brühe, Miller (granuliert) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glasdeckel | Slide Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycinsulfat | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesiumsulfat Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Mikroskopheizung | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Kaliumphosphat Monobasisch | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stufe | Prior | ||
| Roter Filter Würfel | Chroma | Bsp.: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Saphir 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Objektträger, | Mikroskop Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiaminhydrochlorid | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Gelbfilter Würfel | Chroma | Bsp.: Z514/10X, EM: ET535/30M |
Referenzen
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Micro....
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Nachdrucke und Genehmigungen
