Dabei wird die intraperitoneale Injektion von Leukämiezellen genutzt, um eine akute myeloische Leukämie (AML) bei Mäusen zu etablieren und zu propagieren. Diese neue Methode ist bei der seriellen Transplantation von AML-Zellen wirksam und kann als Alternative für diejenigen dienen, bei denen Schwierigkeiten und Inkonsistenzen bei der intravenösen Injektion bei Mäusen auftreten können.
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Methodenartikel
Intraperitoneale Transplantation zur Erzeugung akuter myeloischer Leukämie bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es besteht ein ungedeckter Bedarf an neuartigen Therapien zur Behandlung der akuten myeloischen Leukämie (AML) und des damit verbundenen Rezidivs, an dem persistierende Leukämiestammzellen (LSCs) beteiligt sind. Ein experimentelles AML-Nagetiermodell zur Erprobung von Therapien, die auf der erfolgreichen Transplantation dieser Zellen durch retroorbitale Injektionen in Empfängermäusen basieren, ist mit Herausforderungen verbunden. Das Ziel dieser Studie war es, eine einfache, zuverlässige und konsistente Methode zu entwickeln, um ein robustes murines AML-Modell auf intraperitonealer Route zu generieren. Im vorliegenden Protokoll wurden Knochenmarkszellen mit einem Retrovirus transduziert, das humanes MLL-AF9-Fusions-Onkoprotein exprimiert. Die Effizienz von liniennegativen (Lin-) und Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) Populationen als Spender-LSCs bei der Entwicklung der primären AML wurde getestet und die intraperitoneale Injektion als neue Methode zur Erzeugung von AML eingeführt. Der Vergleich zwischen intraperitonealen und retroorbitalen Injektionen wurde bei seriellen Transplantationen durchgeführt, um die beiden Methoden zu vergleichen und gegenüberzustellen. Sowohl Lin- als auch LSK-Zellen, die mit dem humanen MLL-AF9-Virus transduzierten, transplantierten gut in das Knochenmark und die Milz der Empfänger, was zu einer ausgewachsenen AML führte. Die intraperitoneale Injektion von Spenderzellen etablierte AML bei Empfängern nach serieller Transplantation, und die Infiltration von AML-Zellen wurde im Blut, Knochenmark, Milz und Leber der Empfänger durch Durchflusszytometrie, qPCR und histologische Analysen nachgewiesen. Daher ist die intraperitoneale Injektion eine effiziente Methode der AML-Induktion durch serielle Transplantation von Spenderleukämiezellen.
Einleitung
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine Form der hämatologischen Malignität unterschiedlicher Ätiologie mit schlechter Prognose1. Die Generierung von AML-Tiermodellen legt den Grundstein für das Verständnis ihrer komplexen Variationen und Pathobiologie, um neue Therapien zu entdecken2. Die Leukämiegenese bei Mäusen umfasst die Transplantation von Spenderzellen, die Fusions-Onkoproteine exprimieren, einschließlich Fusionen, an denen das MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) beteiligt ist, um AML stark zu induzieren und die Krankheit beim Menschen nachzuahmen3. Bei der Transplantation von MLL-Gen-as....
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Protokoll
Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Pennsylvania State University vorab genehmigt.
1. Herstellung von Puffern und Reagenzien
- Bereiten Sie Ampicillin-supplementierte (AP) LB-Agarplatten (sterile 10-cm-Platten) vor. Lösen Sie dazu 10 g LB-Brühe mit Agar in 400 ml destilliertem Wasser auf, rühren Sie um und bringen Sie das Volumen auf 500 ml. Sterilisieren Sie die Lösung durch Autoklavieren, lassen Sie die Lösung abkühlen, geben Sie 0,5 ml Ampicillin (Vorrat: 150 mg/ml) in die Lösung und schütteln Sie sie, um sie zu mischen. Geben Sie sofort 18 ml der Lösung auf eine sterile 10....
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Ergebnisse
Vergleich der Transplantationseffizienz von murinen AML-Zellen unter Verwendung von r.o. und i.p. Transplantationswegen
Zuvor wurde die Etablierung von 1° AML in Empfängermäusen berichtet, die retroorbital mit MLL-AF9-transduzierten LSK-Zellen transplantiert wurden, und die Transplantationsfähigkeit von 1° AML-Zellen wurde durch serielle Transplantation nachgewiesen30. Die vorliegende Studie ist die erste, die die Möglichkeit der Verwendung von Knochenmark-Linzellen .......
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Diskussion
Diese oben beschriebenen Studien liefern unterstützende Hinweise darauf, dass die Transplantation von Lin- Zellen bei der Erzeugung von 1° muriner AML mit LSK-Zellen vergleichbar ist. Darüber hinaus zeigen die aktuellen Daten auch, dass die i.p. Injektion im Vergleich zur intravenösen (oder r.o.) Injektion eine effiziente und bequeme Methode zur Etablierung einer murinen AML ist.
Zusätzlich zu LSK-Zellen wurde berichtet, dass andere Populationen wie der Granulozyten-Monozyten-Vorläu.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Die Autoren danken der Core Facility für Durchflusszytometrie des Huck-Instituts und der Core Facility für Histopathologie des Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, für die rechtzeitige technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des American Institute for Cancer Research (KSP), des Penn State College of Agricultural Sciences, des Penn State Cancer Institute, des USDA-NIFA-Projekts 4771, der Beitrittsnummer 00000005 zu K.S.P. und R.F.P. unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| a-Kompetente Zellen auswählen | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammoniumchlorid (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V & Gemini-Bioprodukte mit niedrigem Endotoxingehalt | Cat# 700-102P | ||
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, hoher Glukosegehalt, kein Glutamin | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Dinatriumsalz (EDTA-2Na), Dihydrat, Molekularbiologie | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fötales Rinderserum - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-Transferrin, Rind | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulinlösung human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-Glutamin 200 mM (100&mal;) Lösung | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB Brühe, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Bouillon mit Agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Maus Anti-Maus CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Maus Interleukin-3 (IL-3) | Gemini Bio-Produkte | Cat# 300-324P | |
| Maus Interleukin-6 (IL-6) | Gemini Bio-Produkte | Cat# 300-327P | |
| Maus Stammzellfaktor (SCF) | Gemini Bio-Produkte | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Lösung, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) Zellen | ATCC | CRL-3214 | |
| Kaliumbicarbonat (KHCO3), Granulat | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Ratte Anti-Maus CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Katze # 105812 | |
| Ratte Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Katze # 558162 | |
| rekombinanter Maus Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Rekombinantes humanes Fibronektin-Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagenz | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagenz | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypanblau-Lösung, 0,4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Maus Hämatopoetisches Kit zur Isolierung von Vorläuferzellen | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals< | |||
| em>Ai14TdTomato | Jackson Laboratory | Stamm # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J Mäuse& nbsp; | Jackson Laboratory | Stamm # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J Mäuse | Jackson Laboratory | Stamm # 000664 | |
| Instrumente und Software | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 Durchflusszytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys Softwareprogramm | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism Version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Echtzeit-PCR-System | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemilumineszenz-Fluoreszenz-Bildgebung | G:Box Chemi |
Referenzen
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
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Nachdrucke und Genehmigungen
