Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.
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Methodenartikel
Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in insulinsezernierende Betazellen liefert Material für die Untersuchung der Betazellfunktion und der Diabetesbehandlung. Es besteht jedoch nach wie vor eine Herausforderung bei der Gewinnung von aus Stammzellen gewonnenen Betazellen, die native menschliche Betazellen adäquat nachahmen. Aufbauend auf früheren Studien wurden hPSC-abgeleitete Inselzellen generiert, um ein Protokoll mit verbesserten Differenzierungsergebnissen und Konsistenz zu erstellen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein Pankreas-Vorläufer-Kit in den Phasen 1-4, gefolgt von einem Protokoll, das aus einer zuvor 2014 veröffentlichten Arbeit (im Folgenden als "R-Protokoll" bezeichnet) während der Phasen 5-7 modifiziert wurde. Detaillierte Verfahren für die Verwendung des Pankreas-Vorläufer-Kits und der Mikrotiterplatten mit einem Durchmesser von 400 μm zur Erzeugung von Pankreas-Vorläuferclustern, das R-Protokoll für die endokrine Differenzierung in einem statischen 96-Well-Suspensionsformat sowie die In-vitro-Charakterisierung und funktionelle Bewertung von hPSC-abgeleiteten Inseln sind enthalten. Das vollständige Protokoll dauert 1 Woche für die anfängliche hPSC-Expansion, gefolgt von ~5 Wochen, um insulinproduzierende hPSC-Inseln zu erhalten. Personal mit grundlegenden Stammzellkulturtechniken und Ausbildung in biologischen Assays kann dieses Protokoll reproduzieren.
Einleitung
Betazellen der Bauchspeicheldrüse schütten Insulin aus, das auf einen Anstieg des Blutzuckerspiegels reagiert. Patienten, die aufgrund der autoimmunen Zerstörung von Betazellen bei Typ-1-Diabetes (T1D)1 oder aufgrund einer Betazelldysfunktion bei Typ-2-Diabetes (T2D)2 keine ausreichende Insulinproduktion aufweisen, werden in der Regel mit der Gabe von exogenem Insulin behandelt. Trotz dieser lebensrettenden Therapie kann sie nicht genau mit der exquisiten Kontrolle des Blutzuckers mithalten, wie sie durch die dynamische Insulinsekretion aus echten Betazellen erreicht wird. Daher leiden die Patienten häufig unter den Folg....
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Protokoll
Dieses Protokoll basiert auf der Arbeit mit hPSC-Leitungen, einschließlich H1, HUES4 PDXeG und Mel1 INSGFP/W, unter speiserfreien Bedingungen. In diesem Abschnitt wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung beschrieben, wobei im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" unterstützende Daten aus der Differenzierung von Mel1 INSGFP/W aufgeführt sind. Wir empfehlen, dass weitere Optimierungen erforderlich sind, wenn Sie mit anderen hPSC-Linien arbeiten, die hier nicht aufgeführt sind. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Reagenzien und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1....
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Ergebnisse
Wir haben eine Hybridstrategie entwickelt, um Stammzellen in sieben Schritten in insulinsezernierende hPSC-Inseln zu differenzieren, die ein Pankreas-Vorläuferkit für die ersten vier Stadien in planarer Kultur verwendet, gefolgt von einem modifizierten Protokoll, das auf einer zuvor beschriebenen Methode6 in einer statischen Suspensionskultur für die letzten drei Stadien aufbaut (Abbildung 1). Bei diesem Protokoll ist die Sicherstellung einer nahezu konfluenten (90%-1.......
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Diskussion
In dieser Arbeit wird ein siebenstufiges Hybridprotokoll beschrieben, das die Erzeugung von hPSC-Inseln ermöglicht, die in der Lage sind, Insulin bei Glukoseprovokation innerhalb von 40 Tagen nach der Kultur in vitro zu sezernieren. Es wird angenommen, dass die effiziente Induktion des definitiven Endoderms unter diesen mehreren Schritten einen wichtigen Ausgangspunkt für die endgültigen Differenzierungsergebnisse darstellt18,27,28
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Offenlegungen
Timothy J. Kieffer war während der Erstellung dieses Manuskripts Mitarbeiter von ViaCyte. Die anderen Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Danksagungen
Wir bedanken uns für die Unterstützung von STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF und den Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao und Shenghui Liang wurden mit dem Michael Smith Health Research BC Trainee Award ausgezeichnet. Mitchell J.S. Braam ist Stipendiat des Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima ist Stipendiatin des Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship und des CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Wir danken Dr. Edouard G. Stanley vom MCRI und der Monash University für die gemeinsame Nutzung der Mel1 INS GFP/W-Linie und dem Inselkern des Alberta Diabetes Institut....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3,3',5-Trijod-L-thyronin (T3) | Sigma | T6397 | Schilddrüsenhormon |
| 4% PFA-Lösung | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Sollte im Abzug gehandhabt |
| werden 96-Well, Ultralow Attachment, flacher Boden | Corning Costar (VWR) | CLS3474 | Flachboden; für statische Suspensionskultur in den letzten drei |
| Stufen Accutase | STEMCELL Technologies | 07920 | Dissoziationsreagenz für Zellen der Stufe 4 |
| Aggrewell400 Platten | STEMCELL Technologies | 34415 | 400 µ Mikrotiterplatten mit m Durchmesser |
| Aggrewell800 Platten | STEMCELL Technologies | 34815 | 800 µ Mikrotiterplatten mit m Durchmesser |
| Alexa Fluor 488 Ziege anti-Human FOXA2 (Ziegen-IgG) | R& D Systems | IC2400G | 1:100 in der Durchflusszytometrie; wird für die Analyse von Zellen im Stadium 1 |
| verwendet Alexa Fluor 488 Ziegen-IgG-Isotyp-Kontrolle | R& D Systems | IC108G | 1:100 in der Durchflusszytometrie |
| Alexa Fluor 488 Maus Anti-Human-SST (Maus IgG2B) | BD Sciences | 566032 | 1:250 in der Durchflusszytometrie; wird für die Analyse von Zellen im Stadium 7 |
| verwendet Alexa Fluor 488 Maus IgG2B Isotypkontrolle | R& D Systems | IC0041G | 1:500 in der Durchflusszytometrie |
| Alexa Fluor 647 Maus Anti-Humanes C-Peptid (Maus IgG1κ) | BD Pharmingen | 565831 | 1:2.000 in der Durchflusszytometrie; wird für die Untersuchung von Zellen im Stadium 7 |
| verwendet Alexa Fluor 647 Maus Anti-Human INS (Maus IgG1κ) | BD Sciences | 565689 | 1:2.000 in der Durchflusszytometrie |
| Alexa Fluor 647 Maus anti-Human NKX6.1 (Maus IgG1κ) | BD Sciences | 563338 | 1:33 in der Durchflusszytometrie; wird für die Analyse von Zellen im Stadium 4 |
| verwendet Alexa Fluor 647 Maus Anti-Human SOX17 (Maus IgG1κ) | BD Sciences | 562594 | 1:50 in der Durchflusszytometrie; wird für die Analyse von Zellen im Stadium 1 |
| verwendet Alexa Fluor 647 Maus IgG1κ Isotypkontrolle | BD Sciences | 557714 | 1:50 in der Durchflusszytometrie |
| ALK5i II | Cayman Chemicals | 14794 | TGF-beta-Signalinhibitor |
| Anti-Adhärenz-Spüllösung | STEMCELL Technologies | 7010 | Mikrotiter-Spüllösung |
| Assay-Kammer | Cellvis | D35-10-1-N | Für statische GSIS- und konfokale Bildgebung |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | BP1600-100 | Für Immunfärbeverfahren |
| CK19-Antikörper | DAKO | M0888 | 1:50 in Ganzfassung Immunfluoreszenz |
| D-Glucose | Sigma | G8769 | Mittlere Ergänzung |
| DAPI | Sigma | D9542 | Für nukleare Gegenfärbung |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Matrix-Verdünnungslösung |
| Esel Anti-Ziege Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A21432 | 1:500 in ganzer Montierung Immunfluoreszenz |
| Esel Anti-Ziege Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A21447 | 1:500 im ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| Esel Anti-Maus Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A31570 | 1:500 im ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| Esel Anti-Maus Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A31571 | 1:500 im ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A31572 | 1:500 im ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A31573 | 1:500 im ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| Esel Anti-Schaf Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21448 | 1:500 im ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| DPBS | Sigma | D8537 | Ohne Ca2+ und Mg2+ |
| ELISA, Insulin, human | Alpco | 80-INSHU-E01.1 | Für die Messung von Humaninsulin |
| Fettsäurefrei BSA | Proliant | 68700 | Medium-Supplement |
| Fixierungs- und Permeabilisierungslösungskit | BD Sciences | 554714 | Fix/Perm und 10x Perm/Wash-Lösungen enthalten |
| Schonendes Zelldissoziationsreagenz | STEMCELL Technologies | 7174 | Für die Klumpenpassage von hPSCs während der Erhaltungskultur |
| Glucagon-Antikörper | Sigma | G2654 | 1:400 in der ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| GLUT1 Antikörper | Thermo Fisher Scientific | PA1-37782 | 1:200 in der ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050061 | L-Glutamin |
| Supplement Glycerin | Thermo Fisher Scientific | G33-4 | Zur Gewebereinigung und -montage |
| GSi XX | Sigma Millipore | 565789 | Kerbhemmer |
| Heparin | Sigma | H3149 | Mittlere Ergänzung |
| ITS-X (100x) | Thermo Fisher Scientific | 51500056 | Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin; mittlere Ergänzung |
| LDN193189 | STEMCELL Technologies | 72147 | BMP-Antagonist |
| MAFA-Antikörper | Abcam | ab26405 | 1:200 in Ganzfassung Immunfluoreszenz |
| Matrigel, hESC-qualifiziert | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | Extrazelluläre Matrix für die Beschichtung von Gefäßoberflächen |
| MCDB131 Medium | Life Technologies | 10372019 | Basismedium |
| mTeSR1 Komplettes Kit | STEMCELL Technologien | 85850 | Stammzellmedium und 5x Supplement enthalten |
| N-Cys (N-Acetylcystein) | Sigma | A9165 | Antioxidationsmittel |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | Medium Supplement |
| NEUROD1 Antikörper | R& D Systems | AF2746 | 1:20 im Ganzmount Immunfluoreszenz |
| NKX6.1 Antikörper | DSHB | F55A12-c | 1:50 im ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| Pankreas Polypeptid Antikörper | R& D Systems | AF6297 | 1:200 in Whole Mount Immunfluoreszenz |
| PBS | Sigma | D8662 | mit Ca2+ und Mg2+ |
| PDX1 Antikörper | Abcam | ab47267 | 1:200 in Whole Mount Immunfluoreszenz |
| PE Maus Anti-Human GCG (Maus IgG1κ) | BD Sciences | 565860 | 1:2.000 in der Durchflusszytometrie; verwendet für die Untersuchung von Zellen der Stufe 7 |
| PE Maus anti-human NKX6.1 (Maus IgG1k) | BD Sciences | 563023 | 1:250 in der Durchflusszytometrie |
| PE Maus anti-human PDX1 (Maus IgG1k) | BD Sciences | 562161 | 1:200 in der Durchflusszytometrie; verwendet für die Analyse von PE |
| Maus IgG1 & kappa Zellen der Stufe 4; Isotypkontrolle | BD Sciences | 554680 | 1:2.000 in der Durchflusszytometrie |
| PE Maus-Humanes Chromogranin A (CHGA, Maus IgG1k) | BD Sciences | 564563 | 1:200 in der Durchflusszytometrie |
| R428 | Cayman Chemicals | 21523 | AXL Tyrosinkinase-Inhibitor |
| Retinoidsäure, all-trans | Sigma | R2625 | Lichtempfindlicher |
| RIPA-Lysepuffer, 10x | Sigma | 20-188 | Für die Hormonextraktion |
| SANT-1 | Sigma | S4572 | SHH-Inhibitor |
| SLC18A1 Antikörper | Sigma | HPA063797 | 1:200 in der gesamten Immunfluoreszenz |
| Somatostatin-Antikörper | Sigma | HPA019472 | 1:100 im Ganzmount Immunfluoreszenz |
| STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit | STEMCELL Technologies | 05120 | Basalmedien und Ergänzungen enthalten |
| Synaptophysin-Antikörper | Novus | NB120-16659 | 1:25 im ganzen Mount Immunfluoreszenz |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Zur Permeabilisierung |
| Trolox | Sigma Millipore | 648471 | Vitamin-E-Analogon |
| TrypLE Enzym Express | Life Technologies | 12604-021 | Zelldissoziationsenzymreagenz für Einzelzell-Passing hPSCs |
| Trypsin1/2/3 Antikörper | R& D Systems | AF3586 | 1:25 in Ganzfassung Immunfluoreszenz |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | ROCK-Inhibitor |
| Zinksulfat | Sigma | Z0251 | Mittlere Ergänzung |
Referenzen
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
