Derzeitige Methoden zur Analyse der intrazellulären Dynamik polarisierter Einzelzellen sind oft manuell und nicht standardisiert. Dieses Manuskript stellt eine neuartige Bildanalyse-Pipeline zur Automatisierung der Mittellinienextraktion einzelner polarisierter Zellen und zur Quantifizierung des raumzeitlichen Verhaltens aus Zeitraffern in einer benutzerfreundlichen Online-Oberfläche vor.
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Methodenartikel
AMEBaS: Automatische Mittellinienextraktion und Hintergrundsubtraktion von ratiometrischen Fluoreszenz-Zeitraffern polarisierter Einzelzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zellpolarität ist ein makroskopisches Phänomen, das durch eine Ansammlung von räumlich konzentrierten Molekülen und Strukturen entsteht, die in der Entstehung spezialisierter Domänen auf subzellulärer Ebene gipfeln. Es ist mit der Entwicklung asymmetrischer morphologischer Strukturen verbunden, die wichtigen biologischen Funktionen wie Zellteilung, Wachstum und Migration zugrunde liegen. Darüber hinaus wurde die Störung der Zellpolarität mit gewebebezogenen Erkrankungen wie Krebs und Magendysplasie in Verbindung gebracht.
Derzeitige Methoden zur Bewertung der raumzeitlichen Dynamik von fluoreszierenden Reportern in einzelnen polarisierten Zellen beinhalten oft manuelle Schritte, um eine Mittellinie entlang der Hauptachse der Zellen zu verfolgen, was zeitaufwändig und anfällig für starke Verzerrungen ist. Obwohl die ratiometrische Analyse die ungleichmäßige Verteilung von Reportermolekülen mit Hilfe von zwei Fluoreszenzkanälen korrigieren kann, sind die Techniken der Hintergrundsubtraktion häufig willkürlich und nicht statistisch abgesichert.
Dieses Manuskript stellt eine neuartige Rechenpipeline vor, um das raumzeitliche Verhalten einzelner Zellen unter Verwendung eines Modells der Zellpolarität zu automatisieren und zu quantifizieren: Wachstum der Pollenröhren/Wurzelhaare und zytosolische Ionendynamik. Es wurde ein dreistufiger Algorithmus entwickelt, um ratiometrische Bilder zu verarbeiten und eine quantitative Darstellung der intrazellulären Dynamik und des Wachstums zu extrahieren. Der erste Schritt segmentiert die Zelle vom Hintergrund und erzeugt eine binäre Maske durch eine Schwellwerttechnik im Pixelintensitätsraum. Im zweiten Schritt wird ein Weg durch die Mittellinie der Zelle durch eine Skelettierungsoperation nachgezeichnet. Der dritte Schritt schließlich liefert die verarbeiteten Daten als ratiometrischen Zeitraffer und ergibt einen ratiometrischen Kymographen (d.h. ein räumliches 1D-Profil über die Zeit). Daten aus ratiometrischen Bildern, die mit genetisch kodierten fluoreszierenden Reportern aus wachsenden Pollenschläuchen aufgenommen wurden, wurden verwendet, um die Methode zu vergleichen. Diese Pipeline ermöglicht eine schnellere, weniger verzerrte und genauere Darstellung der raumzeitlichen Dynamik entlang der Mittellinie polarisierter Zellen und erweitert so das quantitative Instrumentarium, das zur Untersuchung der Zellpolarität zur Verfügung steht. Der AMEBaS-Python-Quellcode ist verfügbar unter: https://github.com/badain/amebas.git
Einleitung
Die Zellpolarität ist ein grundlegender biologischer Prozess, bei dem die konzertierte Wirkung einer Ansammlung von räumlich konzentrierten Molekülen und Strukturen in der Etablierung spezialisierter morphologischer subzellulärer Domänen gipfelt1. Zellteilung, Wachstum und Migration hängen von solchen Polaritätsstellen ab, während ihr Verlust mit Krebs bei epithelialen Gewebeerkrankungen in Verbindung gebracht wurde2.
Apikal wachsende Zellen sind ein dramatisches Beispiel für Polarität, bei der sich die Polaritätsstelle an der Spitze typischerweise auf extrazelluläre Signale umorientiert
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Protokoll
1. Interaktives Notebook-Protokoll
Das Jupyter-Notebook kann direkt im Web verwendet werden, indem Google Colab at https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb verwendet wird, auf dem die folgenden Anweisungen basieren. Alternativ ist das Jupyter-Notebook unter https://github.com/badain/amebas verfügbar, wo es heruntergeladen und für die lokale Ausführung in Jupyter konfiguriert werden kann (Anaconda kann einen einfachen und plattformübergreifenden Installationsprozess bereitstellen). Vollständige Testdaten sind bei Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350) zu finden, die ein- und ....
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Ergebnisse
Die AMEBaS-Pipeline automatisiert die Extraktion der Mittelliniendynamik polarisierter Einzelzellen aus fluoreszenzmikroskopischen Bildstapeln, wodurch sie weniger zeitaufwändig und weniger anfällig für menschliche Fehler ist. Die Methode quantifiziert diese Zeitspanner durch die Erzeugung von Kymographen und ratiometrischen Bildstapeln (Abbildung 1) in wachsenden Einzelzellen. Es kann so eingestellt werden, dass es an der Migration einzelner Zellen arbeitet, aber weitere Experimente sind no.......
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Diskussion
Die hier vorgestellte neuartige Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Analyse von fluoreszenzmikroskopischen Bildstapeln polarisierter Zellen zu rationalisieren und zu automatisieren. Aktuelle Methoden, die in der Literatur beschrieben werden, wie z. B. ImageJ Kymograph-Plugins, erfordern eine manuelle Verfolgung der Mittellinie der polarisierten Zelle von Interesse, eine Aufgabe, die nicht nur zeitaufwändig, sondern auch anfällig für menschliche Fehler ist. Da die Definition der Mittellinie in dieser Pipelin.......
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Offenlegungen
Die Autoren dieses Manuskripts erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich für die FAPESP-Zuschüsse 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 Grant GM131043 und die NSF-Zuschüsse MCB1714993, MCB1930165 für die finanzielle Unterstützung. Die Wurzelhaardaten wurden mit der Infrastruktur und unter der Aufsicht von Prof. Andrea Bassi und Prof. Alex Costa erstellt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
Referenzen
- Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
