Hier stellen wir ein effektives, einfaches und schnelles 3D-Kulturprotokoll für die Bildung von Sphäroiden von zwei Zebrafisch-Zelllinien (Danio rerio) vor: ZEM2S (Embryo) und ZFL (normaler Hepatozyten).
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Methodenartikel
Eine 3D-Kultivierungsmethode von Sphäroiden embryonaler und Leberzebrafischzelllinien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fischzelllinien sind vielversprechende In-vitro-Modelle für die Ökotoxizitätsbewertung; Herkömmliche Monolayer-Kultursysteme (2D-Kulturen) haben jedoch bekannte Einschränkungen (z. B. die Langlebigkeit der Kultur und die Aufrechterhaltung einiger in vivo zellulärer Funktionen). Daher wurden 3D-Kulturen, wie z. B. Sphäroide, vorgeschlagen, da diese Modelle gewebeähnliche Strukturen reproduzieren und die In-vivo-Bedingungen besser erfassen können. Dieser Artikel beschreibt ein effektives, einfaches und schnelles 3D-Kulturprotokoll für die Bildung von Sphäroiden mit zwei Zebrafisch-Zelllinien (Danio rerio): ZEM2S (Embryo) und ZFL (normaler Hepatozyten). Das Protokoll besteht darin, die Zellen in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedriger Befestigung zu plattieren. Nach 5 Tagen unter orbitalem Schütteln (70 U/min) bildet sich ein einzelnes Sphäroid pro Well. Die gebildeten Sphäroide weisen eine stabile Größe und Form auf, und diese Methode vermeidet die Bildung mehrerer Sphäroide in einer Vertiefung. Daher ist es nicht notwendig, Sphäroide ähnlicher Größe von Hand auszuwählen. Die Einfachheit, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit dieser Sphäroidmethode machen sie für In-vitro-Tests mit hohem Durchsatz nützlich.
Einleitung
Sphäroide sind kleine Zellkügelchen, die entstehen, wenn Zellen in engem Zell-zu-Zell-Kontakt in 3D-Kultur kultiviert werden. Die Fähigkeit von Sphäroiden, die in vivo Gewebeumgebung nachzuahmen, wurde bereits in einer Vielzahl von Zelllinien und Primärzellen untersucht 1,2. Obwohl Sphäroide für Toxizitätsstudien an Säugetieren gut entwickelt sind, ist die Entwicklung von Sphäroiden für Toxizitätsstudien mit Nicht-Säugetieren (z. B. Fischen) noch im Gange3. Für Fischzelllinien wurden Sphäroide durch eine Vielzahl verschiedener Methoden entwickelt, wie z. B. orbitales Schütteln ....
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Protokoll
Die wichtigsten Schritte zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden von ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden sind in Abbildung 1 dargestellt.
Anmerkungen: Einzelheiten zu allen in diesem Protokoll verwendeten Materialien finden Sie in der Materialtabelle und in Tabelle 1 zu den in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Nährmedien.
1. Zellkulturmedium und Monolayerkulturen
- Beide Zelllinien (ZFL, ZEM2S) werden als Monolayer in einem Inkubator bei 28 °C ohne CO2 gezüchtet und in einem Subkultiv....
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Ergebnisse
Auf diese Weise werden einzelne Sphäroide pro Vertiefung mit stabiler Größe und Form gebildet. Abbildung 2 zeigt den Entstehungsprozess einzelner Sphäroide von ZFL- und ZEM2S-Zellen in einer Vertiefung einer ULA-Platte unter orbitalem Schütteln (70 rpm). Die ZFL- und ZEM2S-Zelllinien verhalten sich in der 3D-Kultur unterschiedlich. Die ZEM2S-Zelllinie weist Merkmale auf, die die Fähigkeit verleihen, seit dem ersten Tag des Orbitaschüttelns leicht eine kugelförmige Form zu bilden (Abbildung <.......
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Diskussion
Dies ist eine einfache, leichte und schnelle Methode zur Erzeugung von Sphäroiden aus Leber- und Embryozelllinien von Zebrafischen. Diese Methode wurde von dieser Gruppe auf der Grundlage von Modifikationen bestehender 3D-Sphäroidmethoden entwickelt, um Probleme zu überwinden, die in wissenschaftlichen Studien im Zusammenhang mit der Sphäroidbildung berichtet wurden, sowie Unsicherheiten in der Datengenauigkeit von 3D-Sphäroid-Assays. Die berichteten Probleme liegen beispielsweise in Schwierigkeiten bei der Handhabung, d.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
In Gedenken an Dr. Márcio Lorencini, einen Mitautor dieser Arbeit, einen exzellenten Forscher auf dem Gebiet der Kosmetik, der sich der Förderung der kosmetischen Forschung in Brasilien verschrieben hat. Die Autoren danken dem Multi-User-Labor in der Abteilung für Physiologie (UFPR) für die Verfügbarkeit von Geräten und für die finanzielle Unterstützung der Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES, Brasilien) (Finance Code 001) und der Grupo Boticário.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96-Well-Mikrotiterplatte mit klarem Boden und ultraniedriger Befestigung, einzeln verpackt, mit Deckel, steril | Corning | 7007 | |
| DMEM, Pulver, hoher Glukosegehalt, Pyruvat | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, Pulver | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Bildverarbeitung und -analyse in Java ( ImageJ) 1,52p Software | National Institutes of Health, USA | Erhältlich bei: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, Pulver | Gibco | 41300021 | |
| Orbital Shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm Rotationsdurchmesser |
| Dulbeccos PBS (10x) mit Calcium und Magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen | Gibco | 12657-029 | |
| Natriumbicarbonat, Pulver Bioreagenz für die Molekularbiologie | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypanblau-Färbung (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S Zelllinie | ATCC | CRL-2147 | Diese Zelllinie wurde freundlicherweise von Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL-Zelllinie | BCRJ | 256 |
Referenzen
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
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Nachdrucke und Genehmigungen
