Pankreasgewebedissektion zur Isolierung lebensfähiger Einzelzellen

Summary

Metaplastische Zellen der Bauchspeicheldrüse sind Vorläufer bösartiger Zellen, aus denen Pankreastumoren entstehen. Die Isolierung intakter, lebensfähiger Pankreaszellen ist jedoch eine Herausforderung. Hier stellen wir eine effiziente Methode zur Dissoziation von Pankreasgewebe vor. Die Zellen können dann für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) oder für die zwei- oder dreidimensionale Co-Kultivierung verwendet werden.

Abstract

Die Bauchspeicheldrüse umfasst zwei Hauptsysteme: das endokrine System, das Hormone produziert und absondert, und das exokrine System, das etwa 90 % der Bauchspeicheldrüse ausmacht und Zellen umfasst, die Verdauungsenzyme produzieren und absondern. Die Verdauungsenzyme werden in den Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse produziert, in Bläschen, den sogenannten Zymogenen, gespeichert und dann über den Pankreasgang in den Zwölffingerdarm freigesetzt, um Stoffwechselprozesse in Gang zu setzen. Die von den Azinuszellen produzierten Enzyme können Zellen abtöten oder zellfreie RNA abbauen. Darüber hinaus sind Azinuszellen zerbrechlich, und gängige Dissoziationsprotokolle führen zu einer großen Anzahl toter Zellen und zellfreier Proteasen und RNasen. Daher ist eine der größten Herausforderungen bei der Verdauung von Bauchspeicheldrüsengewebe die Wiederherstellung intakter und lebensfähiger Zellen, insbesondere von Azinuszellen. Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll zeigt eine zweistufige Methode, die wir entwickelt haben, um diesen Bedarf zu decken. Das Protokoll kann zur Verdauung von normaler Bauchspeicheldrüse, Bauchspeicheldrüse mit prämalignen Läsionen oder Bauchspeicheldrüsentumoren mit einer großen Anzahl von Stroma- und Immunzellen verwendet werden.

Introduction

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der aggressivsten Krebsarten¹. Klinische Beweise stützen die Vorstellung, dass sich PDAC über viele Jahre hinweg aus Zellen des exokrinen Systems, einschließlich Azinuszellen, entwickelt, angetrieben durch Mutationen im KRAS-Proto-Onkogen².

Pankreastumoren umfassen viele verschiedene Zelltypen, und es wurde gezeigt, dass bösartige Zellen nur 20%-50% der Tumormasse ausmachen³. Verschiedene Zelltypen interagieren mit den Epithelzellen, unterstützen deren Transformation und fördern die Tumorbildung und das Tumorwachstum. Frühe Ereignisse verursachen eine azinäre Metaplasie, die zu mikroskopisch kleinen Läsionen führt, die als intraepitheliale Pankreasneoplasie (PanINs) bezeichnet werden und sich in einigen Fällen zu PDAC⁴ entwickeln können.

Es besteht ein dringender Bedarf, diese Wechselwirkungen zu untersuchen und auf entscheidende Signale abzuzielen. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ist eine leistungsfähige Methode, die die Genexpression mit einer Einzelzellauflösung aufdeckt und so die Veränderungen verfolgt, die Epithelzellen durchlaufen, und so die Erforschung der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ermöglicht.

Die Gewebedissektion und der Verdau zu einzelnen Zellen ist der erste Schritt in einem scRNA-seq-Experiment. Mehrere Faktoren machen die Verdauung von Bauchspeicheldrüsengewebe zu einer besonderen Herausforderung: i) Azinuszellen machen mehr als 90 % der Bauchspeicheldrüse aus und Azinuszellen enthalten große Mengen an Verdauungsenzymen, einschließlich Proteasen und RNasen, die die Qualität von RNA-basierten Bibliotheken verringern; (ii) Azinuszellen sind sehr empfindlich und können lysieren, wenn Standardprotokolle verwendet werden; (iii) Azinuszellen exprimieren eine kleine Anzahl von Genen in sehr hohen Konzentrationen. Wenn diese Zellen während des Experiments lysiert werden, kann dies das beobachtete Genexpressionsprofil anderer Zellen kontaminieren. (iv) Pankreasgewebe, das aus Tumoren gewonnen wird, ist desmoplastisch, so dass es schwierig ist, es zu präparieren, ohne die Zellen zu schädigen. Obwohl die Aufrechterhaltung einer hohen Lebensfähigkeit aller Zelltypen erforderlich ist, erhöhen die große Anzahl und Empfindlichkeit der Azinuszellen die Komplexität zusätzlich. Diese Faktoren erschweren es, eine Einzelzellsuspension zu erreichen, die zu mehr als 80 % lebensfähig ist und keine Klumpen aufweist, wie es für scRNA-seq-Experimente erforderlich ist.

Hier haben wir ein Protokoll mit Trypsin C und Kollagenase P entwickelt, zusammen mit einer häufigen Gewebeüberwachung. Dies unterstützt die Dissoziation zu einzelnen Zellen bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hohen Lebensfähigkeit, um den Erfolg von scRNA-seq-Experimenten zu unterstützen ^5,6.

Protocol

Die gemeinsame Ethikkommission (Institutional Animal Care and Use Committee) der Hebräischen Universität (Jerusalem, Israel) und des Hadassah Medical Center (Jerusalem, Israel) genehmigte das Studienprotokoll für Tierschutz (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in mice"), und das hier vorgestellte Protokoll entsprach allen relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche und -forschung. Die Hebräische Universität ist ein von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiertes Institut.

ANMERKUNG: Der Mausstamm #007908, der Stamm #019378 und der Stamm #008179 stammen aus Jacksons Labor. PRT (Kras+/LSL-G12D; PTF1A-CRE^ER; Rosa26^LSL-tdTomato)-Mäuse wurden durch Kreuzung der oben genannten Stämme erzeugt. Für die Studie wurden Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter zwischen 6 Wochen und 15 Monaten verwendet. Tamoxifen wurde hergestellt, indem das Pulver in Maisöl aufgelöst wurde. Adulten Mäusen (im Alter von 6-8 Wochen, weiblich und männlich) wurde Tamoxifen an den Tagen 0 und 2 in einer Dosis von 400 mg/kg subkutan injiziert und zweimal wöchentlich nach der Injektion untersucht. Es war nicht möglich, Tumore zu messen, da sie intern lokalisiert waren; Daher wurde Euthanasie durchgeführt, wenn abnorme klinische Symptome gemäß dem ethischen Protokoll beobachtet wurden. Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Tamoxifen-Induktion unter Verwendung von Isofluran und Zervixluxation euthanasiert.

1. Pankreasdissektion

HINWEIS: Für eine optimale Ausbeute während der Extraktion und um eine gute Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten, ist eine schnelle Dissektion entscheidend. Um die Zeit für die Isolierung der Bauchspeicheldrüse zu verkürzen, müssen alle Instrumente und Geräte vor dem Einschläfern der Maus auf Eis bereitstehen.

1. Euthanasie der Maus durch CO_{2 -}Erstickung und Überprüfung mittels zervikaler Luxation. Ab diesem Schritt müssen alle Eingriffe mit sterilen Präparierinstrumenten durchgeführt werden.
2. Fixieren Sie die Maus und besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol. Machen Sie mit Schere und Pinzette einen V-förmigen Schnitt von 2,5 cm im Genitalbereich und gehen Sie nach oben, um die Bauchhöhle vollständig zu öffnen.
3. Finde den Magen auf der linken Seite der Maus. Lokalisieren Sie die Bauchspeicheldrüse, die sich in der Nähe der Milz befindet. Trennen Sie die Bauchspeicheldrüse mit zwei Pinzetten von Magen und Zwölffingerdarm (ohne zu reißen). Fahre fort und trenne die Bauchspeicheldrüse vom Dünndarm, dem Jejunum und dem Ileum.
4. Bewegen Sie die Bauchspeicheldrüse auf die rechte Seite der Maus. Trennen Sie die verbleibenden Verbindungen zwischen der Bauchspeicheldrüse und der Brusthöhle mit einer Pinzette, um die Bauchspeicheldrüse und die daran befestigte Milz vollständig zu lösen.
5. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse und breiten Sie sie zur Untersuchung in einer Petrischale auf Eis aus.
   HINWEIS: Bei diesem Schritt muss darauf geachtet werden, dass nur die Bauchspeicheldrüse entfernt wird und nicht das Mesenterialfettgewebe oder anderes angrenzendes Gewebe zusammen mit der Bauchspeicheldrüse entfernt wird, um eine zelluläre Kontamination zu vermeiden.

2. Enzymatische und mechanische Dissoziation der Bauchspeicheldrüse

1. Bereiten Sie die folgenden Puffer im Voraus vor.
   1. Dissoziationspuffer 1: 4 ml Trypsin C + 6 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (siehe Tabelle 1) für jede Probe.
   2. Dissoziationspuffer 2: 9 ml Hanks′ ausgewogene Salzlösung (HBSS) 1x; 4% Rinderserumalbumin (BSA); 1 ml Kollagenase P (10 mg/ml); 200 μl Trypsin-Inhibitor (10 mg/ml); und 200 μl DNase I (10 mg/ml) (siehe Tabelle 1).
   3. Waschpuffer: 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml Trypsin-Hemmer (10 mg/ml); und 1 ml DNase 1 (10 mg/ml).
   4. Enzymaktivitätsstopp-Lösung: HBSS 1x mit 5 % fötalem Kälberserum (FBS) und 150 g DNase I (0,2 mg/ml).
2. Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-ml-Röhrchen auf Eis. Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse in 10% FBS in HBSS 1x. Das Fettgewebe schwimmt und die Bauchspeicheldrüse sinkt ab. Dies ist eine einfache Möglichkeit, das kontaminierende weiße Fettgewebe, das noch an der Bauchspeicheldrüse haftet, sichtbar zu machen und schnell zu entfernen.
3. Übertragen Sie das Pankreasgewebe der Maus in eine sterile Petrischale, die 5 ml HBSS 1x auf Eis enthält. Schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Noyes-Schere und einem Skalpell in kleine Stücke von 1 bis 3 mm³ (Abbildung 2A). Bei mehr als einer Probe sollten die Proben auf Eis in 10% FBS/HBSS 1x aufbewahrt werden.
4. Übertragen Sie das Gewebe in ein Zentrifugenröhrchen. Bei 350 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an und entsorgen Sie ihn, um Zellfragmente und Blutzellen zu entfernen.
5. Die Stücke werden in Dissoziationspuffer 1 mit 0,02 % Trypsin, C-0,05 % EDTA für 10 Minuten bei 37 °C unter Rühren (180 U/min) resuspendiert. Sofort mit 10% FBS/Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) waschen. 5 min bei 350 g bei 4 °C zentrifugieren.
6. Erneut waschen, indem das Pellet in 10 ml Waschpuffer resuspendiert und vor dem nächsten Dissoziationsschritt bei 350 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert wird.
7. Die Bauchspeicheldrüse wird im Dissoziationspuffer 2 für 15 min bei 37 °C unter Rühren (180 U/min) inkubiert.
8. Nach 15 Minuten wird die mechanische Dissoziation durchgeführt, indem die Pankreasfragmente in sterilen Pipetten abnehmender Größe (serologische Pipetten mit 25, 10 und 5 ml) 10 Mal kräftig auf und ab pipettiert und wieder auf 37 °C gebracht werden.
   1. Wiederholen Sie nach weiteren 5 Minuten die mechanische Dissoziation und verwenden Sie Lichtmikroskopie, um die Dissoziation entsprechend der Menge der Einzelzellsuspension zu überwachen. Wenn in diesem Stadium weniger als 90 % der Suspension aus isolierten Einzelzellen bestehen, ist in der Regel eine längere Inkubationszeit erforderlich. Verwenden Sie Trypanblau, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen.
   2. Fahren Sie mit der Inkubation fort und nehmen Sie alle 5 Minuten Proben, um die Dissoziation nachzuweisen.
      HINWEIS: Die Gesamtinkubationszeit hängt vom Gewebe ab und kann von Probe zu Probe variieren. Die Inkubation und Gewebedissoziation sollte beendet sein, wenn 90% der Zellen in einzelne Zellen getrennt sind oder wenn eine Verringerung der Lebensfähigkeit festgestellt wird.
9. Nachdem das Pankreasgewebe gut dissoziiert ist (entsprechend dem Verschwinden von Pankreasfragmenten und der zunehmenden Trübung der Lösung) (Abbildung 2), stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch zweimaliges Waschen mit Enzymaktivitätsstopplösung für 5 Minuten bei 4 °C. Halten Sie die Zellsuspension ab diesem Schritt auf Eis.
10. Führen Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Nylonnetz und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit unter dem Mikroskop. Kleinere Größen von Nylonnetzen können die Lebensfähigkeit der Zellen verringern.
11. Resuspendieren und waschen Sie das Pellet mit 5-10 ml eiskalter, gepufferter Waschlösung. Zähle die Zellen.
12. Wenn mehrere rote Blutkörperchen beobachtet werden, behandeln Sie die Zellen mit einem Erythrozyten-Lysepuffer für 2 Minuten bei Raumtemperatur. In Fällen, in denen Klumpen beobachtet werden, sollte die Probe erneut mit Trypsin behandelt werden, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Die Lebensfähigkeit wird mit Trypanblau unter dem Mikroskop nachgewiesen, und wenn die Lebensfähigkeit weniger als 80 % beträgt, sollten lebende Zellen mit dem magnetisch aktivierten Zellsortierungskit (MACS) zur Entfernung toter Zellen mit MACS-MS-Säulen isoliert werden (siehe Tabelle 1).

Results

In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit⁵ haben wir das oben beschriebene Protokoll angewendet, um die frühen Stadien der PDAC-Entwicklung anhand eines Mausmodells zu untersuchen. Die Maus wurde genetisch so verändert, dass sie die Kassetten Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato⁷ enthält, die die Expression von konstitutiv aktivem KRAS in Azinuszellen nach Tamoxifen-Injektion ermöglichen.

Nach der...

Discussion

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für die Dissoziation von Bauchspeicheldrüsengewebe vor. Das Protokoll ist einfach, leicht anzuwenden und bietet ein Werkzeug zur Isolierung lebensfähiger Einzelzellen aus Bauchspeicheldrüsengewebe in verschiedenen Stadien des Malignitätsprozesses, einschließlich solider Tumore. In früheren Studien wurden verschiedene Arten von Kollagenasen verwendet, um die Bauchspeicheldrüse zu verdauen ^8,9. Die Verwendung einer sehr s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenz oder Ressource
70 & Mikro; M Nylon-Mesh	Corning	Katze##431751
BSA	Sigma Aldrich	Kat# A7906
Kollagenase P	Roche	Kat# 11213857001
Kritischer kommerzieller Assay
DAPI	Sigma Aldrich	Kat#MBD0015
Dnase I	Roche	Katze# 10104159001
Experimentelle Modelle: Organismen/ Stämme
Fötales Rinderserum Südamerikanisches	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks' Balanced Salt	Solution Biological industries	cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D Mäuse	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS Kit zur Entfernung toter Zellen	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	Biological industries	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER Mäuse	Jackson Laboratory	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice	Jackson Laboratory	JAX007908
Trypsin C-EDTA 0,05%	Biologische Industrie	cat# 03-053-1A
Trypsin Inhibitor		Roche cat#T6522