Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Tierärztliche Impfungen stellen einen entscheidenden Aspekt der Tierhaltung und -gesundheit dar, da sie zur Verbesserung der Ernährungssicherheit und des Tierwohls beitragen, indem sie Schutz vor Krankheiten bieten, die den Viehzuchtsektor weltweit betreffen¹. Eine wirksame In-vitro-Methode zur Beurteilung der Immunogenität möglicher Impfstoffkandidaten würde dazu beitragen, den Prozess der Impfstoffentwicklung und -produktion zu beschleunigen. Es ist daher notwendig, das Feld der Immuntests mit innovativen Methoden auf der Grundlage von In-vitro-Studien zu erweitern, da dies dazu beitragen würde, die Komplexität der Immunprozesse im Zusammenhang mit Immunisierung und Erregerinfektion aufzudecken. Derzeit werden In-vivo-Immunisierungs- und Provokationsstudien an Tieren, die regelmäßige Probenahmen (z. B. Blut und Milz) erfordern, verwendet, um die Immunogenität von Impfstoffkandidaten und Adjuvantien zu messen. Diese Tests sind teuer, zeitaufwändig und haben ethische Implikationen, da in den meisten Fällen die Euthanasie der Tiere am Ende der Studien durchgeführt wird.

Als Alternative zu In-vivo-Assays wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) verwendet, um impfstoffinduzierte Immunantworten in vitro^{zu untersuchen 2}. PBMCs sind eine heterogene Zellpopulation, die sich zu 70 % bis 90 % aus Lymphozyten, zu 10 % aus Monozyten und einer begrenzten Anzahl von dendritischen Zellen (DCs, 1 % bis 2 %) zusammensetzt3^. PBMCs beherbergen antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie B-Zellen, Monozyten und DCs, die den Organismus ständig auf der Suche nach Anzeichen von Infektionen oder Gewebeschäden patrouillieren. Lokal sezernierte Chemokine erleichtern die Rekrutierung und Aktivierung von APCs an diesen Stellen, indem sie an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Im Falle von Monozyten lenken Chemokine ihr Schicksal darauf, sich entweder in DCs oder Makrophagen zu differenzieren⁴. Sobald DCs auf einen Erreger treffen und ihn einfangen, wandern sie zu sekundären lymphatischen Organen, wo sie die prozessierten Pathogenpeptidantigene mit Hilfe von MHC-Oberflächenproteinen der Klasse I oder II CD8+ T-Zellen bzw. CD4⁺ T-Zellen präsentieren und so eine Immunantwort auslösen^{können 5,6}.

Die Schlüsselrolle, die DCs bei der Orchestrierung einer schützenden Immunantwort gegen verschiedene Krankheitserreger spielen, macht sie zu einem interessanten Forschungsziel für das Verständnis intrazellulärer Immunmechanismen, insbesondere bei der Entwicklung von Impfstoffen und Adjuvantien gegen Infektionserreger⁷. Da der Anteil der DCs, die aus PBMCs gewonnen werden können, eher gering ist (1%-2%), wurden stattdessen Monozyten verwendet, um DCs in vitro zu erzeugen ⁸. Diese von Monozyten abgeleiteten DCs (MoDCs) wurden zunächst als mögliche Behandlungsstrategie in der Krebsimmuntherapie entwickelt⁹. In jüngerer Zeit wurden MoDCs für die Impfstoffforschung verwendet 10,11,12^, und klassische Monozyten sind der vorherrschende Subtyp (89 %) für die MoDC-Produktion ¹³. Die Herstellung von MoDCs in vitro wurde zuvor durch die Zugabe von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) in Kombination mit anderen Zytokinen wie Interleukin-4 (IL-4), Tumornekrosefaktor α (TNF-α) oder IL-13^{erreicht 14,15,16}.

Der Erfolg eines In-vitro-MoDC-Assays hängt von der Fähigkeit antigenstimulierter reifer MoDCs ab, das Ausmaß und die Art der Immunantwort spezifisch für die Art des nachgewiesenen Antigens zu modulieren¹⁷. Die Art des Erregers, der von MoDCs erkannt und präsentiert wird, bestimmt die Differenzierung von CD4⁺ T-Helferzellen (Th) in Th1-, Th2- oder Th17-Effektorzellen und ist durch ein pathogenspezifisches sekretorisches Zytokinprofil gekennzeichnet. Eine Th1-Antwort wird gegen intrazelluläre Pathogene hervorgerufen und führt zur Sekretion von Interferon-gamma (IFN-γ) und Tumornekrosefaktor beta (TNF-β), was den phagozytischen Schutz moduliert. Eine Th2-Antwort wird gegen parasitäre Organismen ausgelöst und ist durch die Sekretion von IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 gekennzeichnet, die einen phagozytisch-unabhängigen humoralen Schutz initiiert. Th17 bietet einen neutrophilenabhängigen Schutz vor extrazellulären Bakterien- und Pilzinfektionen, die durch die Sekretion von IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 und TNF-α 18,19,20,21 vermittelt werden. Aufgrund früherer Studien wurde festgestellt, dass nicht alle Erreger innerhalb des erwarteten Zytokinprofils liegen. Zum Beispiel stimulieren dermale MoDCs als Reaktion auf eine parasitäre Leishmanieninfektion die IFN-γ Sekretion von CD4+ T-Zellen und CD8⁺ T-Zellen und induzieren so eine proinflammatorische Th1-Antwort²².

Es wurde auch gezeigt, dass MoDCs von Hühnern, die mit Salmonella-Lipopolysaccharid (LPS) geprimt wurden, eine variable Antwort gegen Salmonella typhimurium induzieren können, indem sie sowohl Th1- als auch Th2-Antworten aktivieren, während Salmonella gallinarum allein eine Th2-Antwort induziert, was die höhere Resistenz des letzteren gegenüber der MoDC-Clearance^{erklären könnte 23}. Die Aktivierung von MoDCs gegen Brucella canis (B. canis) wurde sowohl bei Hunden als auch bei menschlichen MoDCs berichtet, was bedeutet, dass dies einen zoonotischen Infektionsmechanismus darstellen könnte²⁴. Humane MoDCs, die mit B. canis geprimt sind, induzieren eine starke Th1-Antwort, die eine Resistenz gegen schwere Infektionen verleiht, während canine MoDCs eine dominante Th17-Antwort mit einer reduzierten Th1-Antwort induzieren, was in der Folge zur Etablierung einer chronischen Infektion führt²⁵. Bovine MoDCs zeigen eine erhöhte Affinität für das Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV), das mit Immunglobulin G (IgG) konjugiert ist, im Vergleich zu nicht-konjugierten FMDV allein, da die MoDCs als Antwort auf die erstgenannten einen Virus-Antikörper-Komplex bilden¹⁰. Zusammenfassend zeigen diese Studien, wie MoDCs verwendet wurden, um die Komplexität von Immunantworten während der Infektion mit Krankheitserregern zu analysieren. Die adaptiven Immunantworten können durch die Quantifizierung spezifischer Marker bewertet werden, die mit der Proliferation von Lymphozyten assoziiert sind. Ki-67, ein intrazelluläres Protein, das nur in sich teilenden Zellen nachgewiesen wird, gilt als zuverlässiger Marker für Proliferationsstudien²⁶, und in ähnlicher Weise entspricht CD25, das während der späten Phase der Aktivierung auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert wird, der Proliferation von Lymphozyten^27,28.

Diese Studie demonstriert eine standardisierte Methode zur In-vitro-Generierung von Rinder-MoDCs und deren Anwendung in einem In-vitro-Immunassay, der zur Prüfung der Immunogenität von Impfstoffen verwendet wird. Ein kommerziell erhältlicher Tollwutimpfstoff (RV) wurde verwendet, um die Wirksamkeit dieses Tests zu validieren. Die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten wurde mittels Durchflusszytometrie, quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) durch die Analyse etablierter Zellaktivierungsmarker wie Ki-67 und CD25 und der Sekretion von IFN-γ 28,29,30,31 gemessen. Während des MoDC-Assays werden keine Tier- oder Humanversuche durchgeführt.

Die Blutentnahme erfolgt durch einen zertifizierten Veterinärdienst nach den ethischen Richtlinien der Österreichischen Agentur für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (AGES) und unter Einhaltung der anerkannten Tierschutzstandards³². Die Studie wurde vom österreichischen Landwirtschaftsministerium ethisch genehmigt. Das Versuchsdesign für die Generierung von MoDCs und deren anschließende Anwendung ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Produktion naiver MoDCs

HINWEIS: Vollblutproben wurden von einem einzelnen pathogenfreien Kalb durch Jugularvenenpunktion mit heparinisierten Vacutainern gewonnen (für diese Studie wurden acht 9-ml-Blutröhrchen verwendet). Transportieren Sie das Blut in einer Kühlbox. Lagern Sie die Proben für die spätere Verwendung bei 2-4 °C oder verarbeiten Sie sie sofort. Halte das Blut in Rotation, um eine Blutgerinnung zu vermeiden. Sterilisieren Sie die Vakuumtainer mit 70% Ethanol. Alle folgenden Experimente wurden mit einer biologischen Probe und sechs technischen Replikaten durchgeführt.

1. Dichtegradientenzentrifugation zur Isolierung von PBMCs aus dem heparinisierten Blut
   1. Mischen Sie das Blut gut, indem Sie es 10x invertieren.
   2. Übertragen Sie mit einer 10-ml-Pipette 20 ml heparinisiertes Blut in ein steriles 50-ml-Röhrchen und verdünnen Sie es mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   3. Pipettieren Sie 15 ml Lymphozyten-Isolationsmedium in ein steriles 50-ml-Röhrchen.
      Anmerkungen: Lassen Sie das Lymphozyten-isolierende Medium vor dem Pipettieren Raumtemperatur erreichen.
   4. Kippen Sie das 50-ml-Röhrchen mit dem Lymphozyten-Isolationsmedium in eine 45°-Position. Richten Sie die Spitze einer 25-ml-Pipette senkrecht aus und schichten Sie die 30 ml Blut-PBS vorsichtig auf das Lymphozyten-Isolationsmedium, ohne die beiden zu vermischen. Bringen Sie das 50-ml-Röhrchen sehr langsam wieder in eine vertikale Position.
   5. Bei 800 × g für 35 min bei 20 °C mit maximaler Beschleunigung und ohne Bremsen zentrifugieren (Verzögerungsfunktion ausgeschaltet).
   6. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die PBMC-Schicht (die dünne weiße Schicht direkt nach der ersten Plasmaschicht) zu sammeln und in ein neues 50-ml-Röhrchen zu überführen.
      Anmerkungen: Bei der Dichtegradientenzentrifugation wird Vollblut in verschiedene Schichten getrennt. Dadurch siedeln sich die Erythrozyten unten als Pellet an, die mononukleären Zellen (PBMCs) siedeln sich an der Grenzschicht an und das Plasma bildet die oberste Schicht. Granulozyten befinden sich zwischen dem Pellet und der PBMC-Schicht.
   7. Waschen Sie die geernteten PBMCs 2x, indem Sie PBS bis zu einem Volumen von 40 ml hinzufügen und gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Anschließend bei 500 × g bei 4 °C für 7 min mit maximaler Beschleunigung und maximaler Verzögerung zentrifugieren.
   8. Den Überstand durch Dekantieren verwerfen, das Pellet in 15 ml 1x Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Puffer resuspendieren und bei Raumtemperatur 10-15 min inkubieren.
      Anmerkungen: Nicht länger als 15 Minuten inkubieren. Handelsüblicher ACK-Puffer wird verwendet, um die Lyse der in der PBMC-Fraktion vorhandenen roten Blutkörperchen (RBCs) zu gewährleisten.
   9. PBS bis zu einem Volumen von 40 ml zugeben und dann bei 500 × g und 4 °C für 7 min mit maximaler Beschleunigung und Verzögerung zentrifugieren.
   10. Verwerfen Sie den Überstand durch Umfüllen und wiederholen Sie Schritt 1.1.9.
   11. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml vollständigem Nährmedium (bei Raumtemperatur).
       HINWEIS: Das komplette Nährmedium besteht aus RPMI 1640 Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Magnetische Trennung der CD14^+/− -Zellen aus der PBMC-Population mittels CD14-konjugierter magnetischer Beads
   1. Zählen Sie die Zellen mit einem sauberen Hämozytometer-Zellzähler unter Verwendung von 10 μl Zellsuspension, gemischt mit 10 μl Trypanblaulösung (0,4 %).
      Anmerkungen: Trypanblauer Farbstoff ist eine giftige Chemikalie und potenziell krebserregend. Es sollte mit persönlicher Schutzausrüstung (PSA) gehandhabt werden, um Kontakt zu vermeiden, und Abfälle sollten in einem luftdichten Spezialbehälter für giftige Abfälle entsorgt werden. Tote Zellen erscheinen blau, während lebende Zellen unter dem Mikroskop klar erscheinen.
   2. 7 min bei 500 × g zentrifugieren.
   3. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer (FACS) mit einem Volumen von 40 μl pro 1 × 10^{7 Zellen} . Mit einer Pipette gründlich mischen.
      HINWEIS: Der FACS-Puffer besteht aus 2 % FBS und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die in PBS gelöst sind.
   4. Fügen Sie 5 μl CD14-Mikrokügelchenpuffer pro 1 × 10^{7 Zellen} hinzu und mischen Sie gründlich mit einer Pipette.
   5. Inkubation für 30 min bei 4-8 °C für die positive Selektion von bovinen CD14⁺ Monozyten³³. Vortex alle 15 Minuten während der Inkubationszeit.
   6. Optionaler Schritt (für die durchflusszytometrische Analyse): Zugabe von 10 μl CD14-FITC-Färbeantikörper (Fluorescein-Isothiocyanat) mit anschließender Inkubation für 15 min bei 4-8 °C. Weitere Informationen finden Sie in der Durchflusszytometrie-Analyse in Schritt 5.
   7. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie 7 Minuten lang bei 500 × g.
   8. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl FACS-Puffer pro 1 × 10^{8 Zellen} .
   9. Setzen Sie die immunomagnetische Zelltrennungssäule in den Separator (Magnetsäulenhalter) ein und platzieren Sie ein 15-ml-Sammelröhrchen unter dem Säulenauslass, um den Durchfluss aufzufangen.
   10. Waschen Sie die Säule mit 1 ml entgastem FACS-Puffer. Ersetzen Sie nach dem Spülen das gebrauchte 15-ml-Röhrchen durch ein neues.
   11. Die Zellsuspension (aus Schritt 1.2.8) wird durch die Säule geführt, indem jeweils 1 ×¹⁰ 8 Zellen in 500 μl Puffer pipettiert werden.
       Anmerkungen: Achten Sie darauf, beim Mischen der Zellen keine Luftblasen zu erzeugen, bevor Sie sie durch die Säule lassen.
   12. Spülen Sie die Säule 3x mit jeweils 3 ml entgastem FACS-Puffer.
   13. Sammeln Sie den Durchfluss und markieren Sie diese erste eluierte Fraktion als CD14⁻ -Zellfraktion (PBMCs minus CD14⁺ -Monozyten); Dies wird auch als naive Lymphozytenfraktion bezeichnet.
       HINWEIS: Die CD14⁻ -Zellen werden in einem vollständigen Nährmedium aufbewahrt, bis antigengepulste MoDCs hergestellt werden.
   14. Entfernen Sie die Spalte aus dem Trennzeichen.
   15. Legen Sie ein neues steriles 15-ml-Röhrchen unter die Säule, um das Abwasser aufzufangen.
   16. Pipettieren Sie 5 ml FACS-Puffer in die Säule und drücken Sie ihn sofort mit einem Kolben durch.
   17. Sammeln Sie den Durchfluss und markieren Sie diese zweite eluierte Fraktion als CD14⁺ -Zellfraktion. Dies wird auch als naive Monozytenfraktion bezeichnet.
   18. Fügen Sie den geernteten CD14⁺ -Monozyten ein komplettes Nährmedium hinzu, um 1 × 10⁶ Zellen/ml zu erhalten.
       Anmerkungen: Zählen Sie die lebenden Zellen in der eluierten CD14⁺ -Zellfraktion, um das Volumen des vollständigen Nährmediums abzuschätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen.
   19. Nehmen Sie eine sterile 24-Well-Platte und geben Sie 1 ml der Zellsuspension (1 × 10⁶ Zellen/ml) in jede Well.
3. Differenzierung der CD14⁺ naiven Monozyten in naive MoDCs durch Zugabe von 3% w/v Zytokincocktail (GM-CSF + IL-4) mit insgesamt 5 Tagen Inkubation
   1. Ergänzen Sie jede Vertiefung, die CD14⁺ -Monozyten enthält, mit 40 μl (3 % w/v) des im Kit enthaltenen Zytokincocktails.
   2. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ und bei 37 °C für 48 h.
   3. An Tag 2 wird die Hälfte des Inhalts jeder Vertiefung (500 μl) mit einer Pipette in einzelne 1,5-ml-Röhrchen übertragen und 7 Minuten lang bei 500 × g bei 4 °C zentrifugiert.
   4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl frischem Nährmedium.
   5. 500 μl dieser Zellsuspension aus Schritt 1.3.4 werden in jede dafür vorgesehene Vertiefung zurückübertragen, so dass das Endvolumen 1 ml beträgt.
   6. Reichern Sie jede Vertiefung mit 20 μl Zytokincocktail an.
   7. Die Kultur wird 72 h in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ und bei 37 °C inkubiert.
   8. Nach der Inkubation am 5. Tag nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator.
      HINWEIS: Jede Vertiefung enthält 1 ml einer Zellsuspension aus naiven MoDCs. Die Anzahl der MoDCs beträgt einen Prozentsatz (~20%) der ursprünglich plattierten Monozyten (1 × 10⁶/ml).

2. MoDC-Assay zur endozytären Aktivität

HINWEIS: Der Antigen-Aufnahme-Assay oder der endozytäre Aktivitäts-Assay misst die Fähigkeit naiver MoDCs, Fremdmaterial zu internalisieren. Der Assay wird mit naiven MoDCs durchgeführt, die mit einem 3%igen w/v-Zytokincocktail und einer Inkubationszeit von 5 Tagen kultiviert wurden, wie zuvor beschrieben³⁴.

1. Ernten Sie die naive MoDC-Zellsuspension von der 24-Well-Platte und übertragen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Sammeln Sie auch alle verbleibenden Zellen, indem Sie die Vertiefungen mit PBS spülen.
2. 500 × g 7 Min. zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Nährmedium, das mit 1 % FBS angereichert ist.
3. Zählen Sie die lebenden MoDC-Zellen, um das Volumen des Mediums abzuschätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen (2 × 10⁵ Zellen/ml).
4. Die naiven MoDCs werden in 100 μl komplettem Nährmedium in einer 24-Well-Platte mit einer Endzellkonzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml kultiviert.
5. Ergänzen Sie jede Vertiefung mit 1 mg/ml FITC-konjugiertem Dextran (Fluoreszenzsonde, die als Endozytose-Tracer verwendet wird).
   HINWEIS: Das FITC-Dextran fungiert als Fluoreszenzsonde und wird als Endozytose-Tracer verwendet.
6. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang im Dunkeln bei 5 % CO₂ und 37 °C.
   HINWEIS: Für die Hintergrundkontrolle werden die zusätzlichen MoDC-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/ml) mit 1 mg/ml FITC-Dextran auf Eis inkubiert, da diese Art der Inkubation das Eindringen des Tracermoleküls (FITC-dextran) in die Zellen verhindert.
7. Nach der Inkubation wird die 24-Well-Platte sofort auf Eis übertragen, um die Endozytose von FITC-Dextran zu stoppen.
8. Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem FACS-Puffer.
9. Ernte, zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl FACS-Puffer.
10. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität des FITC-Dextrans in den Zellen mittels Durchflusszytometrie. Weitere Informationen finden Sie in der Durchflusszytometrie-Analyse in Schritt 5.2.

3. Generierung von antigengepulsten MoDCs

HINWEIS: Ein kommerziell erhältlicher und klinisch zugelassener Impfstoff gegen das Tollwutvirus (RV) kann die Differenzierung von naiven MoDCs zu reifen antigenpräsentierenden MoDCs induzieren. Verwenden Sie 0,1 % (~1 μl) einer einzelnen RV-Impfdosis, um antigengepulste MoDCs zu erzeugen. Weiterhin ist es bevorzugt, RV-gepulste MoDCs in der gleichen Kulturplatte herzustellen, die (in Schritt 1.3.8) zur Erzeugung naiver MoDCs verwendet wird, da die Übertragung der naiven MoDCs auf eine neue 24-Well-Platte diese negativ beeinflusst.

1. Ab Schritt 1.3.8) 1 μl/ml RV-Suspension zu 1 ml naiver MoDC-Kultur in der 24-Well-Platte zugeben und 48 h bei 5 % CO₂ und 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Naive MoDCs, die ohne RV-Stimulation kultiviert wurden, werden als Hintergrundkontrolle (und als unspezifische Stimulation für die Co-Kultur mit Lymphozyten in den nächsten Schritten) verwendet.
2. Nach der Inkubation, an Tag 7, wird die 24-Well-Platte mit den antigengepulsten MoDCs 10 Minuten lang auf Eis gelegt.
3. Fügen Sie 1 ml eiskaltes PBS pro Vertiefung hinzu. Mischen Sie jede Vertiefung gründlich durch Pipettieren und übertragen Sie die Suspension in ein 15-ml-Röhrchen.
4. Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml eiskaltem PBS, um die verbleibenden Zellen in jeder Vertiefung zu sammeln.
5. Füllen Sie den Inhalt in die entsprechenden Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 × g für 7 Minuten.
6. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet (antigengepulste MoDCs) in vollständigem Nährmedium und stellen Sie das Volumen auf eine endgültige Zellkonzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml ein.
   Anmerkungen: Zählen Sie die lebenden Zellen, um das Volumen des Mediums abzuschätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen. Verwenden Sie RV-gepulste MoDCs ab Tag 7 für das MoDC-Lymphozyten-Kokultursystem.

4. MoDC-Lymphozyten-Kokultur

HINWEIS: Das In-vitro-MoDC-Lymphozyten-Kokultursystem bestimmt die Fähigkeit von MoDCs, antigenspezifische Lymphozyten zu primen. Die verschiedenen Behandlungsgruppen von Zellen nach 16 Tagen Co-Kultur umfassen spezifische, unspezifische und Kontrollzellen. Die spezifische Gruppe ist definiert als Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kokultiviert werden; die unspezifische Gruppe ist definiert als Lymphozyten, die mit nicht-antigengepulsten MoDCs kokultiviert werden; und die Kontrollgruppe ist definiert als Lymphozyten, die ohne MoDCs kultiviert wurden.

1. Der eluierten naiven Lymphozytenfraktion (CD14⁻ Zellen) wird ein komplettes Nährmedium zugegeben, um eine Zellkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml zu erreichen.
   HINWEIS: Zählen Sie die lebenden Zellen in der CD14⁻ -Zellkultur, die seit ihrer Entnahme in einem vollständigen Nährmedium in einer 24-Well-Platte gehalten wurden, um das Volumen des Mediums abzuschätzen, das erforderlich ist, um die gewünschte Zellzahl zu erreichen.
2. Nehmen Sie an Tag 7 eine sterile 24-Well-Platte und besetzen Sie die Wells mit 1 ml naiver Lymphozytenzellsuspension (2 × 10^{6 Zellen} /ml) plus 1 ml antigengepulster oder nicht-antigengepulster MoDC-Suspension (1 × 10⁵ Zellen/ml).
   HINWEIS: Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung beträgt 2 ml mit einem Verhältnis von 1:20 MoDCs zu Lymphozyten pro Vertiefung.
3. Die Platte wird 48 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert.
4. Kulturanreicherung und Restimulation mit antigengepulsten MoDCs
   1. Nach der Inkubation der antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Co-Kultur wird an Tag 9 jede Vertiefung mit 20 ng/ml rekombinantem IL-2 ergänzt und für weitere 120 h (5 Tage Inkubation) inkubiert.
   2. Übertragen Sie am 14. Tag 1 ml der Co-Kultur in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie 7 Minuten lang bei 500 × g .
   3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml antigengepulsten oder nicht gepulsten MoDCs (1 × 10⁵ Zellen/ml). Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und übertragen Sie die Zellsuspensionen zurück in die dafür vorgesehenen Vertiefungen.
      Anmerkungen: In diesem Schritt beträgt das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung 2 ml.
   4. Mit der Inkubation bei 5 % CO₂ und 37 °C für 48 h fortfahren. Nach der Inkubation am 16. Tag ist die Co-Kultur bereit für die Analyse mittels Durchflusszytometrie, qPCR und ELISA.
      HINWEIS: Für jede 2 ml in jeder Vertiefung der MoDC-Lymphozyten-Kokultur wird 1 ml resuspendierte Zellen für die Durchflusszytometrie gefärbt, 1 ml wird für die RNA-Extraktion verwendet und die Überstände aus beiden werden für ELISA verwendet.

5. Durchflusszytometrische Analyse

Anmerkungen: Färben Sie die Zellen mit geeigneten Markern/mAb, bevor Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer laufen lassen. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu den Reagenzien (Färbe-mAb- und Isotypkontrollen), dem Kit, dem Gerät und der Software, die für die Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden.

1. Färbeprotokoll für Durchflusszytometer
   HINWEIS: Führen Sie eine Zelloberflächenfärbung für die PBMCs und naiven Lymphozyten und Monozyten mit anti-CD14 mAb durch (Schritt 1.2.6). Für die Zelloberflächenfärbung von naiven MoDCs verwenden Sie anti-CD86-spezifisches, anti-CD40-spezifisches und anti-MHC II-spezifisches mAb. Für die Zelloberflächenfärbung von Zellen ab Tag 16 Co-Kulturen verwenden Sie anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; Verwenden Sie für die intrazelluläre Färbung Anti-Ki-67 mAb. Des Weiteren werden die Zellen entweder mit negativer Isotypkontrolle mAb oder ohne mAb (FMO: fluoreszierend minus eins) gefärbt. Der Hauptunterschied bei der Färbung von Oberflächen- und intrazellulären Markern besteht darin, dass bei Zelloberflächenmarkern die Zellen vor der Lebend-/Totfärbung (L/D) oder anderen Prozessen mit spezifischem Oberflächen-mAb gefärbt werden müssen. Die intrazelluläre Färbung wird jedoch nach der L/D-Färbung durchgeführt und erfordert einen Fixations- und Permeabilisierungsschritt, um eine intrazelluläre Penetration zu ermöglichen.
   1. 1 ml Zellsuspension mit einer Pipette in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen überführen und 10 Minuten bei 500 × g zentrifugieren.
      HINWEIS: Bewahren Sie nach der Zentrifugation bei der Verarbeitung der Zellen aus der MoDC-Lymphozyten-Kokultur den Überstand für die ELISA-Analyse auf.
   2. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml PBS und füllen Sie es in ein 15-ml-Röhrchen. Sammeln Sie die verbleibenden Zellen mit 1 ml PBS und kombinieren Sie diese mit dem resuspendierten Pellet.
   3. Geben Sie 10 ml PBS in das 15-ml-Röhrchen mit den Zellen, mischen Sie es durch Pipettieren und zentrifugieren Sie es 7 Minuten lang bei 850 x g.
   4. Verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt 5.1.3.
   5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit der Restsuspension (ca. 180 μl), die nach dem Dekantieren des Überstands übrig bleibt.
   6. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden und versiegeln Sie die Wells, um ein Verschütten zu vermeiden.
   7. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.400 × g für 5 Minuten. Schnippen Sie nach dem Zentrifugieren mit der Platte über einen Abfallbehälter, um die Vertiefungen der Flüssigkeit zu entleeren, und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier, um sicherzustellen, dass überschüssige Flüssigkeit entfernt wird.
   8. Fügen Sie 25 μl Oberflächenfärbe-Mastermix pro Vertiefung hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer Pipette, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C für 30 Minuten.
      Anmerkungen: Um eine Mastermischung für die Oberflächenfärbung für eine einzelne Vertiefung herzustellen, fügen Sie 2,5 μl Oberflächen-mAb zu 20 μl FACS-Puffer hinzu.
   9. Fügen Sie 200 μl FACS-Puffer pro Well hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 1.400 × g . Entleeren Sie nach dem Zentrifugieren die Vertiefungen der Flüssigkeit durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
   10. Fügen Sie 100 μl L/D-Färbelösung pro Vertiefung hinzu. Mit einer Pipette gründlich mischen, anschließend bei 4 °C für 15 min im Dunkeln inkubieren.
       Anmerkungen: Lösen Sie für eine einzelne Vertiefung 0,25 μl L/D-Farbstoff in 100 μl FACS-Puffer auf. Der L/D-Farbstoff hilft bei der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
   11. Fügen Sie 100 μl FACS-Puffer hinzu. Decken Sie die Vertiefungen mit dem Deckel ab und zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang für 1.400 × g . Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
   12. Wiederholen Sie Schritt 5.1.11.
   13. Fügen Sie 50 μl Fixierungslösung pro Vertiefung hinzu (im Lieferumfang enthalten) und mischen Sie sie mit einer Pipette, bevor Sie die Platte 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
   14. Fügen Sie 150 μl des 1x Permeabilisations-Waschpuffers (PW) hinzu, der mit dem Kit geliefert wurde, und decken Sie die Vertiefungen mit dem Deckel ab.
       Anmerkungen: Um 10 ml 1x PW-Puffer herzustellen, verdünnen Sie 1 ml 10x Dauerwellenpuffer in 10 ml dH₂O.
   15. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.400 × g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
   16. Fügen Sie 200 μl 1x PW hinzu, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.400 × g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
   17. Für die intrazelluläre Färbung werden 25 μl intrazellulärer Färbemastermix (anti-humanes Ki-67 mAb) pro Well hinzugefügt. Gut mischen und die Platte 30 Minuten bei 4 °C oder auf Eis im Dunkeln inkubieren.
       Anmerkungen: Um eine intrazelluläre Färbemastermischung für eine einzelne Vertiefung herzustellen, fügen Sie 1 μl Ki-67 mAb zu 24 μl 1x PW hinzu. Der intrazelluläre Färbemarker wird nur bei der Verarbeitung von Zellen ab Tag 16 Co-Kultur verwendet. Die intrazelluläre Färbung erfolgt nicht während der Verarbeitung von PBMCs, naiven Lymphozyten, Monozyten und naiven MoDCs.
   18. Nach der Inkubation werden 200 μl 1x PW in jede Vertiefung gegeben. Mit einer Pipette mischen und 1.400 × g 5 Minuten lang zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
   19. Fügen Sie 200 μl FACS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie anschließend 5 Minuten lang bei 1.400 × g . Entsorgen Sie den Überstand durch Umfüllen und klopfen Sie die Platte auf saugfähiges Papier.
   20. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer und übertragen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in separate sterile Durchflusszytometerröhrchen. Verwenden Sie 300 μl FACS-Puffer pro Well, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Die Zellen sind nun bereit für die durchflusszytometrische Analyse.
2. Ausführen der Probe auf einem Durchflusszytometer
   HINWEIS: Die Proben wurden auf einem Durchflusszytometer (mit 488 nm, 638 nm und 405 nm Lasern) gemäß dem Handbuch des Herstellers durchgeführt³⁵. Weitere Informationen, Fehlerbehebung und Anpassung des Protokolls finden Sie im Handbuch.
   1. Führen Sie routinemäßige Reinigungsverfahren vor und nach dem Lesen der Proben durch.
      Anmerkungen: Überspringen Sie keine Position, während Sie die Röhrchen in das Gerät einlegen.
      1. Verwenden Sie für den Reinigungszyklus insgesamt vier Röhrchen, wobei das erste Röhrchen Fließreinigungsreagenz und die restlichen drei Röhrchen_dH2Oenthalten. Jedes Röhrchen enthält 3 ml. Erfassen Sie während des Reinigungslaufs ca. 1 Minute lang Daten mit einer mittleren Durchflussrate, indem Sie 100.000 Ereignisse pro Röhre unter 330 V für Vorwärtsstreuung (FSC) gegenüber 265 V für Seitenstreuung (SSC) erfassen.
         Anmerkungen: Während der Reinigung sollten keine Ablagerungen oder zellulären Ereignisse gemeldet werden. Führen Sie in diesem Fall den Reinigungsschritt erneut durch. Stellen Sie beim Ausführen der Proben sicher, dass sich alle Proben vor der Erfassung der Daten in einer homogenen Suspension befinden, da dies eine genaue Messung gewährleistet.
   2. Um das Zytometer anzuschließen und einzuschalten, klicken Sie auf die Anwendungsschaltfläche in der linken Ecke der Titelleiste. Wählen Sie im Dropdown-Menü der Anwendung die Option Zytometrie und klicken Sie auf die Option Einschalten.
      HINWEIS: Im Dropdown-Menü der Anwendung können Benutzer mit der Option " Öffnen" die vorprogrammierten Assays durchsuchen, während mit der Option "Neues Protokoll " neue Protokolle erstellt werden können.
   3. Legen Sie zunächst die Negativkontrollprobe in den Mehrfachröhrchenhalter. Wählen Sie Neues Protokoll und beobachten Sie den Arbeitsvorrat auf der linken Seite des Arbeitsbereichs/Bildschirms.
   4. Definieren Sie im Arbeitsvorrat die Position der Probe im Mehrfachröhrchenhalter und geben Sie der Probe einen Namen und ein Protokoll zur Identifizierung.
   5. Passen Sie im Hardware-Bedienfeld auf der linken Seite des Arbeitsbereichs mehrere Parameter an und wählen Sie sie aus, z. B. die Detektoren (FSC, SSC und 10 Fluoreszenzbereiche), die Spannungen (V) und Verstärkungen der Photomultiplier sowie die Fläche, Höhe und Breite (AHW) des Signals.
      HINWEIS: Die folgenden Einstellungen für die Detektoren wurden je nach verwendetem Experiment und Instrument ausgewählt: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
   6. Passen Sie über das Bedienfeld zur Instrumentenerfassung unter der Titelleiste die Optionen für Durchflussrate (mittel), Zeit (5 min) und Ereignisse (siehe Schritt 5.2.8) an, die erkannt werden sollen. Klicken Sie auf die Option Single erfassen, damit das Gerät das Sample zeichnen/ausführen kann und die Echtzeitvorschau der erkannten Ereignisse angezeigt wird.
   7. Passen Sie in der Echtzeitvorschau den Schwellenwert für die Fluoreszenz (Spannung und Verstärkung) und die Zellgröße an, um schließlich Gates um die gewünschte Zellpopulation zu zeichnen und gleichzeitig zelluläre Trümmer auszuschließen.
      HINWEIS: FSC hilft bei der Unterscheidung von Zellen anhand ihrer Größe und ermöglicht so die Unterscheidung zwischen Zellen des Immunsystems wie Monozyten und Lymphozyten. Monozyten sind größer und weisen im Vergleich zu Lymphozyten eine höhere FSC-Intensität auf.
   8. Erfassen Sie insgesamt etwa 5.000 lebende MoDC-, 50.000 lebende Lymphozyten- und 50.000 lebende Monozytenereignisse.
   9. Sobald alle Parameter in Bezug auf die Negativkontrollprobe eingestellt sind, klicken Sie auf Stopp und speichern Sie das Protokoll.
   10. Laden Sie nun alle Proben auf den Mehrrohrlader. Definieren Sie jede Probe im Arbeitsvorrat und wenden Sie die in Bezug auf die Negativkontrolle angepassten Parameter auf alle Proben innerhalb des Experiments an. Klicken Sie auf die Option Erfassen , damit alle Stichproben im Experiment nacheinander ausgeführt werden können.
   11. Sobald die Daten aus allen Proben erfasst sind, speichern Sie sie und wandeln Sie sie mit einer geeigneten Datenanalysesoftware, die die Erstellung sequenzieller biparametrischer und monoparametrischer Histogramme ermöglicht, in lesbare Daten um.

6. Analyse der Expression von Boten-RNA (mRNA)

1. RNA-Extraktion
   HINWEIS: Extraktion der Gesamt-RNA aus der antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur (spezifisch), der nicht-antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur (unspezifisch), der Lymphozytenkultur ohne MoDCs (Kontrolle) und aus naiven Lymphozyten (CD14⁻ -Zellen, die vor der Co-Kultivierung isoliert wurden). Für die RNA-Extraktion wird Ethanol mit RNase-freiem Wasser hergestellt. Weitere Informationen zum Extraktionskit und zu den Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle .
   1. 1 ml Zellsuspension von der MoDC-Lymphozyten-Cokulturplatte (~1 × 10⁶ Zellen/ml) mit einer Pipette in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen übertragen und 10 Minuten lang bei 500 × g zentrifugieren.
   2. Speichern Sie den Überstand für ELISA. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml PBS und überführen Sie es in ein 15-ml-Röhrchen. Sammeln Sie alle verbleibenden Zellen mit 1 ml PBS.
   3. 10 min bei 500 × g zentrifugieren.
      Anmerkungen: Alle Proben sollten behutsam wie lebende Zellen behandelt werden, bis die Zelllyse mit dem im Kit enthaltenen Lysepuffer durchgeführt wird. Durch den Zelltod werden RNasen freigesetzt, die die für die nachgeschaltete Quantifizierung benötigten RNA-Templates schnell hydrolysieren. RLT-Puffer lysiert Zellen in einer Lösung, die RNasen hemmt.
   4. Geben Sie 350 μl Lysepuffer in jede leere Vertiefung und inkubieren Sie sie 2-3 Minuten lang, um die adhärenten Zellen zu lysieren, die in den vorherigen Schritten nicht geerntet wurden.
   5. Sobald die Zentrifugation in Schritt 6.1.3 abgeschlossen ist, ist der Überstand zu verwerfen und das Zellpellet mit den 350 μl Lysepuffer zu vermischen, die in Schritt 6.1.4 hinzugefügt wurden.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt ist es möglich, die Röhrchen bei −80 °C zu lagern oder mit der RNA-Extraktion fortzufahren (folgende Schritte).
   6. In Schritt 6.1.5 werden 350 μl 70%iges Ethanol in das Lysat pipetiert. Das Endvolumen pro Probe beträgt 700 μl.
   7. Setzen Sie die Extraktionssäule in ein 2-ml-Sammelröhrchen ein (im Lieferumfang enthalten).
   8. Übertragen Sie die 700 μl Probe pro Extraktionssäule und zentrifugieren Sie 15 s lang bei 10.000 × g . Entsorgen Sie den Durchfluss im Auffangrohr und setzen Sie ihn wieder in die Schleudersäule ein.
   9. Geben Sie in der Extraktionskolonne 350 μl strengen Waschpuffer (im Kit enthalten) hinzu und zentrifugieren Sie 15 s lang bei mehr als 10.000 × g . Verwerfen Sie den Durchfluss.
   10. Geben Sie 80 μl DNase I-Inkubationsmischung pro Probe auf die Membran der Extraktionskolonne und lassen Sie sie 15 Minuten bei 20-30 °C aushärten.
       Anmerkungen: Um eine DNase I-Inkubationsmischung pro Probe herzustellen, fügen Sie 10 μl DNase I-Stammlösung zu 70 μl DNase-Puffer hinzu, um ein Endvolumen von 80 μl zu erhalten. Mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen und anschließend kurz in der Zentrifuge schleudern.
   11. Waschen Sie die Extraktionssäule mit 350 μl strengem Waschpuffer und zentrifugieren Sie anschließend 15 Minuten lang bei 10.000 × g . Entsorgen Sie den Durchfluss nach dem Zentrifugieren im Sammelröhrchen.
   12. Waschen Sie die Extraktionssäule 2x mit jeweils 500 μl Feinwaschpuffer und zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 15 s und ein zweites Mal für 2 min. Verwerfen Sie den Durchfluss nach jeder Zentrifugation.
   13. Zentrifugieren Sie die Säule 1 Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit, um die Membran zu trocknen, und entsorgen Sie das Sammelröhrchen.
   14. Setzen Sie die Extraktionssäule in ein neues 1,5-ml-Sammelröhrchen ein.
   15. Pipettieren Sie 50 μl RNase-freies Wasser auf die Säulenmembran und inkubieren Sie es 3-5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
       HINWEIS: Bei RNA-Konzentrationen unter 100 ng ist das Elutionsvolumen auf 30 μl zu reduzieren und die Extraktionssäulenmembran mit dem Produkt aus der ersten Elution erneut zu eluieren, um das Endprodukt zu konzentrieren.
   16. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 10.000 × g , um die RNA zu eluieren.
   17. Messen Sie die RNA-Konzentration, indem Sie die Absorption bei 260 nm mit 0,5-2 μl Probe nachweisen. Stellen Sie die endgültige RNA-Konzentration mit RNase-freiem Wasser auf 0,1-1 μg/μl ein.
   18. Lagern Sie die RNA-Aliquots für die spätere Verwendung bei −80 °C.
2. Synthese komplementärer DNA
   1. Synthetisieren Sie komplementäre DNA (cDNA) aus extrahierter Template-RNA gemäß dem Protokoll des Herstellers, das mit dem Kit geliefert wird (Einzelheiten finden Sie in der Materialtabelle ).
      HINWEIS: Eine Zusammenfassung der Reagenzien und der verwendeten Volumina ist in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt. Ein vollständiges Protokoll ist in der Zusatzdatei 1 aufgeführt.
3. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit
   1. Für die qPCR werden die cDNA-Proben in dreifacher Ausführung durchgeführt. Quantifizierung der bovinen mRNA-Transkriptspiegel für Ki-67 und IFN-γ unter Verwendung spezifischer Primer-Sets in Bezug auf das GAPDH-Gen , wie in Tabelle 3 dargestellt.
      HINWEIS: Ein vollständiges Protokoll finden Sie in der Zusatzdatei 1.

7. Enzyme-linked immunosorbent assay

1. Die gesammelten Kulturüberstände, die reich an sekretorischen Proteinen sind, werden für die Quantifizierung von IFN-γ mittels ELISA aufbereitet.
   Anmerkungen: Einzelheiten zur Verwendung des Kits finden Sie in der Materialtabelle . Ein vollständiges Protokoll ist in der Zusatzdatei 1 aufgeführt.

8. Statistische Analyse

1. Analysieren Sie die Daten und erstellen Sie grafische Illustrationen der Versuchsplanung mit kommerzieller Software. Verwenden Sie für die vergleichende Analyse einen ungepaarten nichtparametrischen Test. Betrachten Sie P-Werte < 0,05 als statistisch signifikant.

Diese Methodik beschreibt die In-vitro-Generierung von Rinder-MoDCs für die Evaluierung von Impfkandidatenantigenen vor der Durchführung von In-vivo-Studien. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Schema der bovinen MoDC-Generierung und die Anwendung der MoDCs für den In-vitro-Assay. Mit Hilfe der magnetischen Zellsortiertechnik war es möglich, etwa 26 Millionen CD14+-Myozyten aus den geernteten PBMCs zu gewinnen, die zuvor aus 50 ml Rinderblut isoliert wurden. Die eluierte Zellfraktion frei von CD14+ Monozyten war reich an Lymphozyten und wurde als Quelle für naive CD4+ und CD8+ T-Zellen (CD14− Lymphozytenzellfraktion) verwendet.

Die naive Monozytenfraktion bestand zu 98 % aus CD14+ Monozytenzellen, wie nach CD14-Zellfärbung und Durchflusszytometrie beobachtet wurde (Abbildung 2A,B). Die gereinigten naiven Monozytenzellen differenzierten sich bei einer Kultivierung in Gegenwart des 3%igen Zytokincocktails (GM-CSF und IL-4) mit anschließender Inkubation von 5 Tagen zu einem DC-ähnlichen Phänotyp. Aus einer Ausgangskultur von 26 Millionen CD14+ Monozyten konnten nach 5 Tagen Inkubation insgesamt ca. 12 Millionen MoDCs gewonnen werden. Die naiven MoDCs waren funktionell in der Lage, Antigene aufzunehmen, wie bei der durchflusszytometrischen Analyse von FITC-Dextran beobachtet wurde (Abbildung 3). Darüber hinaus wurden die naiven MoDCs phänotypisch charakterisiert, indem die Expression von MHC-Klasse-II- und co-stimulatorischen CD86- und CD40-Zelloberflächenmarkern untersucht wurde, was den DC-ähnlichen Phänotyp validierte (Abbildung 4).

Die antigengepulste Stimulation naiver MoDCs wurde erreicht, indem diese 2 Tage lang in Gegenwart von inaktiviertem RV kultiviert wurden. Die Aktivierung naiver Lymphozyten (der CD14− -Zellfraktion) erfolgte durch antigengepulste MoDC-Lymphozyten-Co-Kultivierung mit anschließender Supplementierung von IL-2. Während der MoDC-Lymphozyten-Kokultur an Tag 9 wurde eine morphologische Veränderung in den RV-gepulsten MoDCs beobachtet, da sie eine Dendritenausdehnung zeigten, was ein Merkmal der MoDC-Reifung ist (Abbildung 5). An Tag 14 wurde die Aktivierung der Lymphozyten durch die Restimulation der Kokultur durch die Zugabe von neu produzierten RV-gepulsten MoDCs desselben Tieres verstärkt.

Im Vergleich zur nicht-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur konnte eine signifikante Zunahme (p < 0,01) der Lymphozytenproliferation durch die Hochregulation der Ki-67- und CD25-Aktivierungsmarker sowohl auf den CD4+- als auch auf den CD8+-T-Zellen an Tag 16 in der gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur nachgewiesen werden (Abbildung 6). Die CD8+ T-Zellen aus den reifen RV-gepulsten MoDC-Kokulturen zeigten eine achtfache Hochregulation (p < 0,01) von Ki-67 im Vergleich zur unspezifischen Gruppe (Abbildung 7A). Die CD4+ T-Zellen in der gleichen Co-Kultur zeigten einen siebenfachen Anstieg (p < 0,01) in Ki-67 im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung 7B). Dies demonstriert die Fähigkeit von RV-geprimten MoDCs, das RV-Antigen erfolgreich naiven Lymphozyten zu präsentieren und sie anschließend in einem In-vitro-Zustand zu aktivieren, ähnlich wie es in einem lebenden Tier der Fall ist. Neben der Analyse der Zellen mittels Durchflusszytometrie wurden die Kokulturen auch einer qPCR und einem ELISA unterzogen, um die RV-spezifische Lymphozytenaktivierung mittels RNA-Transkription (Ki-67 und IFN-γ) bzw. extrazellulärer Sekretion (IFN-γ) zu quantifizieren (Abbildung 8). Diese zusätzlichen Nachweismethoden können auch als Bestätigungstests verwendet werden, um die Ergebnisse der Durchflusszytometrie weiter zu validieren. Die mittels qPCR nachgewiesene RNA-Expression für Ki-67 und IFN-γ und die mittels ELISA nachgewiesenen IFN-γ-Spiegel zeigten ähnliche Anstiegsmuster, was auf eine Lymphozytenproliferation hinweist, in der antigenspezifischen Kokultur im Vergleich zur unspezifischen Behandlungsgruppe. Daher korrelierten die qPCR- und ELISA-Ergebnisse mit den Ergebnissen der Durchflusszytometrie. Die qPCR zeigte einen Anstieg der IFN-γ-Expression um >30 % und einen Anstieg der Ki-67-Expression um >5 % in allen Kokulturen, die GAPDH als Kalibrator verwendeten (Abbildung 8A,B). Eine signifikant höhere Konzentration an sezerniertem IFN-γ (**p > 0,01) wurde mittels ELISA unter Verwendung von Kulturüberständen aus der RV-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur gemessen als in der unspezifischen Behandlungsgruppe (Abbildung 8C).

Abbildung 1: Experimentelles Design des bovinen MoDC-basierten In-vitro-Assays. (A) Ernte und Zellsortierung der CD14+-Monozyten- und CD14−-Lymphozytenzellfraktionen aus bovinen PBMCs. Rinderblut wird durch Dichtegradientenzentrifugation zur Gewinnung von PBMCs verarbeitet, gefolgt von einer magnetischen Zellsortierung mit Hilfe von immunmagnetischen Zelltrennsäulen und der anschließenden Kultivierung der geernteten CD14+-naiven Monozytenzellfraktion in supplementiertem RPMI 1640-Medium. (B) Die Herstellung von MoDCs unter Verwendung eines 3%igen Zytokincocktails (GM-CSF + IL-4) mit 5 Tagen Inkubation und MoDC-Lymphozyten-Kokultur. An Tag 0 werden die Monozyten in Gegenwart des Zytokincocktails kultiviert und 48 h inkubiert, um die Differenzierung zu induzieren. An Tag 2 wird die Kultur mit dem gleichen Zytokincocktail restimuliert, gefolgt von einer Inkubation für 72 h, was zur Produktion naiver MoDCs führt. An Tag 5 wird das Impfantigen (Tollwutimpfstoff) in die naive MoDC-Zellkultur gegeben, gefolgt von einer 48-stündigen Inkubation. An Tag 7 erfolgt die Co-Kultivierung von antigengepulsten MoDCs mit naiven Lymphozyten (die CD14−-Zellfraktion), gefolgt von der Inkubation. An Tag 9 wird IL-2 der Co-Kultur hinzugefügt. An Tag 14 erfolgt die Anreicherung/Restimulation der aktivierten/geprimten Lymphozyten durch Zugabe von antigengepulsten MoDCs, gefolgt von einer Inkubation für 48 h. Schließlich werden an Tag 16 die Zellen und der Kulturüberstand für den Lymphozytenproliferationstest entnommen. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; PBMCs = mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; GM-CSF = Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Morphologie und Reinheit von bovinen CD14+ -Monozyten, die aus PBMCs mit anti-CD14-konjugierten Mikrokügelchen gewonnen wurden. (A) Morphologie von bovinen Monozyten, die 4 h bei 37 °C in einem kompletten Nährmedium zur Entfernung von Mikrokügelchen inkubiert, auf polylysinbeschichteten Objektträgern fixiert und mit modifizierter Giemsa-Färbung gefärbt wurden. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Durchflusszytometrisches Histogramm mit der eluierten CD14+ -Zellfraktion mit einem Reinheitsgrad von 98,6 %, beobachtet unter Verwendung eines Anti-CD14-Antikörpers (rot) und eines FITC-konjugierten IgG1-Isotyp-Kontrollantikörpers der Maus (grün). Abkürzungen: PBMCs = periphere mononukleäre Blutzellen; FITC cont = Fluorescein-Isothiocyanat-Kontrolle. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Endozytäre Aktivität von bovinen MoDCs, die in vitro generiert wurden. Durchflusszytometrisches Histogramm, das die Aufnahme des Tracermoleküls (FITC-dextran) nach Tag 5 naiver MoDCs zeigt. MoDCs inkubierten bei 37 °C für 60 min mit dem Tracermolekül (blau) und MoDCs inkubierten auf Eis mit dem Tracermolekül (grau) als Hintergrundkontrolle. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Phänotypisierung von in vitro generierten bovinen MoDC-spezifischen Zelloberflächenmarkern. Durchflusszytometrische Histogramme für (A) Gating-Strategien von MoDCs und für (B) Tag 5 naive MoDCs, die mit drei verschiedenen DC-spezifischen mAbs (blau) gefärbt wurden, einschließlich der folgenden: Anti-Schaf-MHC II mAb, Anti-bovines CD86 mAb und Anti-bovines CD40 mAb. Alle verglichen mit den entsprechenden Isotyp-Kontrollen (rot). Abkürzungen: DC = dendritische Zellen; MODCs = von Rindermonozyten abgeleitete DCs; MHC II = Haupthistokompatibilitätskomplex II. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Zeichen der Reifung von in vitro produzierten MoDCs während der MoDC-Lymphozyten-Kokultur. Beobachtung der charakteristischen erweiterten dendritischen Struktur durch antigengepulste MoDCs mit inverser Mikroskopie an Tag 9 der MoDC-Lymphozyten-Kokultur. (A) Reife MoDCs innerhalb eines hochgradig konfluierenden Bereichs von kokultivierten Lymphozyten. (B) Reife MoDCs sind in einem Gebiet mit weniger Lymphozyten in Kokultur leicht zu unterscheiden. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzung: MODCs = bovine moncyte-derived dendritic cells. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Sequentielle Gating-Strategie für Punktdiagramme gegen die Expression von Ki-67 und CD25 durch Lymphozyten in der Kokultur von MoDC-Lymphozyten. (A) Die vollständige Gating-Strategie für Zellen, die ab Tag 16 MoDC-Lymphozyten-Kokultur geerntet wurden. (B) Die Ki-67-Expression von CD4+-gesteuerten Lymphozyten und (C) von CD8+-Lymphozyten im Vergleich zur FMO-Kontrolle (ohne mAb) und zur IgG1-k-Isotyp-Kontroll-mAb der FMO-Kontrolle (ohne mAb). Die CD25-Expression auf gated (D) CD8+ und (E) CD4+ Lymphozyten im Vergleich zu Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-mAb. Die Behandlungsgruppe repräsentiert spezifisch Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kokultiviert wurden, während die Kontrollgruppe Lymphozyten repräsentiert, die in Abwesenheit von MoDCs kultiviert wurden. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; FMO = fluoreszierend minus eins; RV = Tollwutimpfstoff. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Durchflusszytometrische Datenanalyse der Ki-67- und CD25-Expression durch CD4+- und CD8+-Lymphozyten nach Priming mit dem Antigen. Ki-67- und CD25-Expression ab Tag 16 Co-Kultur. Die Behandlungsgruppe (spezifisch) ist definiert als Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kultiviert wurden; die unspezifische Gruppe entspricht Lymphozyten, die mit nicht-antigengepulsten MoDCs kultiviert wurden; die Kontrollgruppe entspricht Lymphozyten, die ohne MoDCs kultiviert wurden. Die horizontalen Balken stellen den Mittelwert von sechs technischen Repliken dar. (A) Intrazelluläre Expression des Ki-67-Markers durch CD8 T-Zellen und (B) durch CD4 T-Zellen. (C) Zelloberflächenexpression des CD25-Markers durch CD8 T-Zellen und (D) durch CD4 T-Zellen. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; RV = Tollwutimpfstoff. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Aktivierung des Th1-Markers (IFN-γ und Ki-67) durch MoDCs, die mit dem Tollwutvirus-Antigen geprimt wurden, nachgewiesen durch qPCR und ELISA. Daten von einem Tier mit sechs technischen Replikaten. Die horizontalen Balken stellen den Mittelwert dar. Drei PCR-Replikate zeigten Faltungsveränderungen im Vergleich zu naiven Lymphozyten nach Normalisierung mit einem GAPDH-Referenzgen . (A) IFN-γ-Ausdruck , (B) Ki-67-Ausdruck . (C) Vergleich der IFN-γ Sekretion im Kulturüberstand zwischen drei Behandlungsgruppen, wie sie mittels ELISA nachgewiesen wurden. Die spezifische Gruppe ist definiert als Lymphozyten, die mit RV-gepulsten MoDCs kultiviert wurden; die unspezifische Gruppe entspricht Lymphozyten, die mit nicht-antigengepulsten MoDCs kultiviert wurden; die Kontrollgruppe entspricht Lymphozyten, die ohne MoDCs kultiviert wurden. Abkürzungen: MODCs = bovine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen; RV = Tollwutimpfstoff. Diese Abbildung wurde von Kangethe et al., 201811 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Zusammensetzung des Mastermixes (RNA-Primer-Mix).

Tabelle 2: Der 2x PCR-Reaktionsmix. Abkürzungen: RT = reverse transkriptase; DTT = Dithiothreitol.

Tabelle 3: Primer-Sets für die Amplifikation50.

Tabelle 4: qPCR-Mastermix

Tabelle 5: IFN-γ Standard-Verdünnungsreihe

Ergänzendes Dossier 1: Protokolle für die Synthese komplementärer DNA, quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) in Echtzeit und ELISA-Assay (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Die Antigenaufnahmefähigkeit von MoDCs mit unterschiedlichen Konzentrationen des Zytokincocktails und mit 3 oder 5 Tagen Kultur. Unterschiedliche Konzentrationen (5 % w/v und 3 % w/v) des Zytokincocktails, der GM-CSF und IL-4 enthält, wurden entweder mit 3 oder 5 Tagen Kultur getestet, um die beste Kombination zur Erzeugung von Hochleistungs-Antigenaufnahme-MoDCs (unter Verwendung des Tracermoleküls FITC-dextran) zu ermitteln. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: CD4- und CD8-Priming mit Diptherie-Toxoid (DT) und Blauzungenvirus-Serotyp 4 (BTV). Die Expression von Ki-67 durch CD8-Zellen nach Pulsieren mit (A) DT und (C) BTV und die Expression von Ki-67 durch CD4-Zellen nach Pulsieren mit (B) DT und (D) BVT an Tag 16. Es wurden Vergleiche mit Kulturen durchgeführt, die mit DT und BVT (spezifisch), (C,D) mit CD40L gepulst wurden, sowie mit unspezifischen Priming- und Kontrollbehandlungen. Die horizontalen Balken geben den Mittelwert an. *p < 0,05, **p < 0,01 nach einem Mann-Whitney-Test. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.