Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Zusammenfassung

Die Methodik beschreibt die Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) und deren Anwendung für die In-vitro-Evaluierung von Antigenkandidaten während der Entwicklung potenzieller veterinärmedizinischer Impfstoffe bei Rindern.

Zusammenfassung

Dendritische Zellen (DCs) sind die potentesten antigenpräsentierenden Zellen (APCs) innerhalb des Immunsystems. Sie patrouillieren den Organismus auf der Suche nach Krankheitserregern und spielen eine einzigartige Rolle innerhalb des Immunsystems, indem sie die angeborene und die adaptive Immunantwort miteinander verbinden. Diese Zellen können phagozytieren und dann eingefangene Antigene den Effektor-Immunzellen präsentieren, was eine Vielzahl von Immunreaktionen auslöst. Diese Arbeit demonstriert eine standardisierte Methode zur In-vitro-Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs), die aus mononukleären Zellen (PBMCs) des peripheren Blutes von Rindern isoliert wurden, und ihre Anwendung bei der Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen.

Die magnetische Zellsortierung wurde verwendet, um CD14+-Monozyten aus PBMCs zu isolieren, und die Supplementierung des kompletten Nährmediums mit Interleukin (IL)-4 und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) wurde verwendet, um die Differenzierung von CD14⁺-Monozyten in naive MoDCs zu induzieren. Die Generierung unreifer MoDCs wurde durch den Nachweis der Expression von Major Histocompatibility Complex II (MHC II), CD86 und CD40 Zelloberflächenmarkern bestätigt. Ein kommerziell erhältlicher Tollwutimpfstoff wurde verwendet, um die unreifen MoDCs zu pulsieren, die anschließend mit naiven Lymphozyten kokultiviert wurden.

Die durchflusszytometrische Analyse der antigengepulsten MoDCs und der Lymphozyten-Cokultur ergab die Stimulation der T-Lymphozytenproliferation durch die Expression von Ki-67-, CD25-, CD4- und CD8-Markern. Die Analyse der mRNA-Expression von IFN-γ und Ki-67 mittels quantitativer PCR zeigte, dass die MoDCs das antigenspezifische Priming von Lymphozyten in diesem in vitro Co-Kultursystem induzieren können. Darüber hinaus zeigte die mittels ELISA untersuchte IFN-γ-Sekretion einen signifikant höheren Titer (**p < 0,01) in der Tollwut-Impfstoff-gepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur als in der nicht-antigengepulsten MoDC-Lymphozyten-Kokultur. Diese Ergebnisse zeigen die Validität dieses In-vitro-MoDC-Assays zur Messung der Immunogenität von Impfstoffen, was bedeutet, dass dieser Assay verwendet werden kann, um potenzielle Impfstoffkandidaten für Rinder zu identifizieren, bevor mit In-vivo-Studien fortgefahren wird, sowie bei der Bewertung der Immunogenität von Impfstoffen kommerzieller Impfstoffe.

Einleitung

Tierärztliche Impfungen stellen einen entscheidenden Aspekt der Tierhaltung und -gesundheit dar, da sie zur Verbesserung der Ernährungssicherheit und des Tierwohls beitragen, indem sie Schutz vor Krankheiten bieten, die den Viehzuchtsektor weltweit betreffen¹. Eine wirksame In-vitro-Methode zur Beurteilung der Immunogenität möglicher Impfstoffkandidaten würde dazu beitragen, den Prozess der Impfstoffentwicklung und -produktion zu beschleunigen. Es ist daher notwendig, das Feld der Immuntests mit innovativen Methoden auf der Grundlage von In-vitro-Studien zu erweitern, da dies dazu beitragen würde, die Komplexität der Immunproz....

Protokoll

Die Blutentnahme erfolgt durch einen zertifizierten Veterinärdienst nach den ethischen Richtlinien der Österreichischen Agentur für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (AGES) und unter Einhaltung der anerkannten Tierschutzstandards³². Die Studie wurde vom österreichischen Landwirtschaftsministerium ethisch genehmigt. Das Versuchsdesign für die Generierung von MoDCs und deren anschließende Anwendung ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Produktion naiver MoDCs

HINWEIS: Vollblutproben wurden von einem einzelnen pathogenfreien Kalb durch Jugularvene....

Ergebnisse

Diese Methodik beschreibt die In-vitro-Generierung von Rinder-MoDCs für die Evaluierung von Impfkandidatenantigenen vor der Durchführung von In-vivo-Studien. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Schema der bovinen MoDC-Generierung und die Anwendung der MoDCs für den In-vitro-Assay. Mit Hilfe der magnetischen Zellsortiertechnik war es möglich, etwa 26 Millionen CD14⁺-Myozyten aus den geernteten PBMCs zu gewinnen, die zuvor aus 50 ml Rinderblut .......

Diskussion

Diese Studie demonstriert eine standardisierte In-vitro-Methode zur Generierung und Phänotypisierung von bovinen MoDCs und deren anschließende Verwendung zur Messung der Immunogenität eines kommerziellen Impfstoffs (z. B. RV). Rinder-MoDCs können als Werkzeug für das Screening potenzieller Impfantigene gegen Rinderkrankheiten und die Vorhersage ihrer potenziellen klinischen Auswirkungen auf der Grundlage von Immunreaktionen verwendet werden, bevor mit In-vivo-Tierversuchen fortgefahren wird. Die generie.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ACK Lysing Buffer	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	Ammonium-Chlorid-Kalium-Puffer für die Lyse von Rest-Erythrozyten in geernteten PBMC-Fraktion
BD Vacutainer Heparin-Röhrchen	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 ml, Additiv Natrium-Heparin 158 USP-Einheiten, Glasröhrchen, 16 x 100 mm Größe
Rinder-Dendritische Zellwachstumskit	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	Zytokin-Cocktail bestehend aus rekombinantem bovinem IL-4 und GM-CSF
bovinem IFN-& gamma; ELISA-Kit	Bio-Rad	MCA5638KZZ	Kit zur Messung der IFN- und Gamma-Expression in Kulturüberständen
CD14-Antikörper	Bio-Rad	MCA2678F	Maus Anti-Rinder CD14 monoklonaler Antikörper, Klon CC-G33, Isotyp IgG1
CD25 Antikörper	Bio-Rad	MCA2430PE	Maus Anti-Rinder CD25 monoklonaler Antikörper, Klon IL-A11, Isotyp IgG1
CD4 Antikörper	Bio-Rad	MCA1653A647	Monoklonaler Anti-Rinder-CD4-Antikörper der Maus, Klon CC8, Isotyp IgG2a
CD40 Antikörper	Bio-Rad	MCA2431F	Maus Anti-Rinder-CD40 monoklonaler Antikörper, Klon IL-A156, Isotyp IgG1
CD8 Antikörper	Bio-Rad	MCA837F	Maus Anti-Rinder-CD8 monoklonaler Antikörper, Klon CC63, Isotyp IgG2a
CD86 Antikörper	Bio-Rad	MCA2437PE	Maus Anti-Rinder CD86 monoklonaler Antikörper, Klon IL-A190, Isotyp IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Nachweissystem	Bio-Rad-Thermocycler		PCR-Maschine
Corning Zentrifugenröhrchen	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL und 50 mL, hochklarer Poypropylen-Konusboden, graduiert, sterial, Verschluss mit Schraubverschluss, Falkenröhrchen
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	Fixations-/Permeabilisierungskit mit BD golgiPlug, zur Verwendung für die Färbung von Durchflusszytometerzellen
Ethanol	Sigma Aldrich	1009832500	Absolute für die Analyse EMSURE  ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Fötales Kälberserum (FBS)	Gibco, Thermo Fisher	10500064	Qualifiziertes, hitzeinaktiviertes
Ficoll Plaque PLUS	GE Gesundheitswesen Life Sciences, USA	341691	Lymphozyten-Isolationsmedium
FlowClean Reinigungsmittel	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-		Durchflusszytometer Histogramm-Software
FlowTubes/ FACS  (Fluoreszenzaktivierte Einzelzellsortierung) Röhre	Falcon Corning	352235	5 ml, steriales Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden und Schnappverschluss für das Zellsieb, Verwendung in der Durchflusszytometrie
Fluoresceinisothiocynat-Dextran	Sigma Aldrich, Deutschland	60842-46-8	FITC-dextran MW
Gallios Durchflusszytometer	Beckman Coulter-Durchflusszytometermaschine
Hartschalen-PCR-Platten für 96 Brunnen	Bio-Rad	HSP9601	96 Well, flaches Profil, dünnwandig, mit Rand, weiß/klar
Humane CD14-Mikrokügelchen	Miltenyi Bioteck, Deutschland	130-050-201	2 mL Mikrokügelchen, konjugiert mit monoklonalen anti-humanen CD14-Antikörpern Isotyp IgG2a, verwendet für die Selektion von Rindermonozyten aus PBMCs
Kaluza	Beckman Coulter, Deutschland		Mehrfarbige Datenanalysesoftware für Durchflusszytometer
MACS Säule	Miltenyi Bioteck, Deutschland	130-042-401	Magnetisch aktivierte Zellsortierung oder immunmagnetische Zelltrennungssäule zur Trennung verschiedener CD14-Zellpopulationen auf Basis von Zelloberflächenantigenen
MHC Klasse II DQ DR Polymorpher Antikörper	Bio-Rad	MCA2228F	Maus Anti-Schaf MHC Klasse II DQ DR Polymorph:FITC, Klon 49.1, Isotyp IgG2a, kreuzreaktiv mit
Rinder-Mikrozentrifugenröhrchen	Sigma Aldrich	HS4325	1,5 mL, konischer Boden, graduiert, steriale Röhre
Microsoft Power Point		Microsoft-Die	grafischen Illustrationen des Versuchsdesigns
Maus IgG1 Negativkontrolle: FITC für CD14, CD40 Antikörper	Bio-Rad	MCA928F	Isotypkontrolle CD14 und CD40 monoklonale Antikörper
Maus IgG1 Negativkontrolle: PE für CD86 Antikörper	Bio-Rad	MCA928PE	Isotypkontrolle CD86 monoklonale Antikörper
Maus IgG1 Negativkontrolle: RPE für CD25 Antikörper	Bio-Rad	MCA928PE	Isotypkontrolle CD25 monoklonaler Antikörper
Maus-IgG2a-Negativkontrolle: FITC für MHC-Klasse-II-Antikörper	Bio-Rad	MCA929F	Isotypkontrolle für monoklonale MHC-Klasse-II-Antikörper
Nobivac Tollwut	MSD Tiergesundheit,	UK-1	& Mikro; L/ml zellkultivierter inaktivierter Impfstoff mit > 2 I.E./mL Tollwutvirusstamm
Optische Dichtungen	Bi0-Rad	TCS0803	0,2 mL flaches PCR-Röhrchen 8-Kappen-Streifen, optisch, ultraklar, kompatibel für qPCR-Maschine
Penicillin-Streptomycin	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7,4, 1x Konzentration
Prism - GraphPad 5 Software	Dotmatics-Statistical		software
Aufgereinigter Anti-humaner Ki-67 Antikörper	Biolegend, USA	350501	Monoklonaler Antikörper, kreuzreaktiv mit Kuh, Klon ki-67
Aufgereinigter Maus IgG1 k Isotyp Ctrl Antikörper	Biolegend	400101	Isotypkontrolle für monoklonalen Ki-67 Antikörper
READIDROP Propidium Iodid	BD Bio Sciences	1351101	Marker für lebende/tote Zellen für die Durchflusszytometrie, Amin-reaktiver Farbstoff
Rekombinantes humanes IL-2-Protein	R& D System, USA	202-IL-010/CF	Interleukin-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit zur Extraktion von Gesamt-RNA; RLT-Puffer = Lysepuffer; RW1-Puffer = stringenter guanidinhaltiger Waschpuffer; RDD-Puffer = DNase-Puffer; RPE-Puffer = Schonwaschpuffer; RNaseOUT = RNase-Hemmer.
RPMI 1640 Medium	Sigma Aldrich	R8758	Zellkulturmedien mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat
SMART-servier medical art	Les Laboratories Servier-Lizenziert		unter einer Creative Commons Attribution 3.0 unported Lizenz
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR Mix enthält dNTPs, Ss07d Fusionspolymerase, MgCl2, SYBR Green I Supermix = Supermix, ROX Normalisierungsfarbstoffe.
SuperScript III Erststrangsynthesesystem	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	Kit für cDNA-Synthese
Gewebekultur Testplatte 24	TPP, Schweiz	92024	24-Well-Platte, sterilisiert durch Strahlung, wachstumsverstärkt behandelt, Volumen 3,18 mL
Trypanblau-Lösung	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0,4%, 100 mL, Farbstoff zur Beurteilung der Zellviabilität
UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	0,1 µ m membranfiltriertes destilliertes Wasser
VACUETTE Heparin-Blutentnahmeröhrchen	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE Heparin-Blutentnahmeröhrchen haben eine grüne Oberseite und enthalten sprühgetrocknetes Lithium-, Natrium- oder Ammoniumheparin an den Innenwänden und werden in der klinischen Chemie, Immunologie und Serologie eingesetzt. Das Antikoagulans Heparin aktiviert Antithrombin, wodurch die Gerinnungskaskade blockiert wird und so eine Vollblut-/Plasmaprobe entsteht.
Wasser	Sigma Aldrich	W3500-1L	Steril gefiltertes, bioreaktives Reagenz für Zellkultur