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In den letzten zehn Jahren ist das Interesse an der Anwendung der kohärenten Raman-Mikroskopie (CRM) in der Zell- und Gewebebildgebung gestiegen 1,2. CRM ist ein leistungsstarkes chemisches Bildgebungsverfahren mit zwei beliebten Varianten: der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und der stimulierten Raman-Streuung (SRS)-Mikroskopie. SRS wird im Vergleich zu CARS immer beliebter, da es weniger von Nicht-Raman-Hintergrundinterferenzen beeinflusst wird und eine lineare Abhängigkeit von der Konzentration3 aufweist. CRM erfasst molekulare Schwingungsinformationen ähnlich wie die Raman-Spektroskopie, bietet aber eine deutlich verbesserte Erfassungsgeschwindigkeit4. Dies wird durch kohärente Schwingungsanregung durch ein Paar gepulster Laser mit hoher Spitzenintensität erreicht. Da CRM eine ortsaufgelöste chemische Kartierung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht, hat es wichtige Anwendungen in der Krebsdiagnose, im Fettstoffwechsel, im Zellstoffwechsel, beim Medikamententransport und vielen anderen gefunden 5,6,7,8. Ein großer Engpass, der eine breite Einführung der Technik behindert, ist jedoch ihre technische Komplexität und das Fehlen standardisierter Protokolle. Obwohl kommerzielle Laser und Mikroskope bereits verfügbar sind, beinhalten fast alle Systeme, die derzeit in diesem Feld eingesetzt werden, verschiedene Stufen der Anpassung von Lasern, Optiken, Mikroskopen und Detektoren, was ein erhebliches Hindernis für Forscher darstellt, die daran interessiert sind, in das Feld einzusteigen oder diese Technologie zu übernehmen. Der fehlende Zugang behindert biologische Anwendungen zusätzlich. Das Ziel dieser Methodensammlung ist es, detaillierte Beispiele und Anleitungen zu Instrumenten, neuen Bildgebungsansätzen und in vitro/in vivo Zell- oder Gewebebildgebungsanwendungen bereitzustellen. Wir haben sieben Veröffentlichungen von Experten auf diesem Gebiet aufgenommen, die hier zusammengefasst sind.
Clark et al. präsentieren einen direkten Vergleich von hyperspektraler SRS und CARS in Bezug auf Empfindlichkeit, räumliche Auflösung und spektrale Auflösung9. Beide Techniken werden mit der spektralen Fokussierung von Femtosekundenlasern implementiert, einem häufig verwendeten Ansatz, bei dem die spektral chirpedierten Breitband-Femtosekundenlaser verwendet werden, um eine schmalbandige Raman-Auflösung zu erreichen. Ein direkter Vergleich ermöglicht die Beurteilung von Detektionsunterschieden und die optimale Auswahl der Modalität für verschiedene Anwendungen der chemischen Bildgebung.
De la Cadena et al. veröffentlichen eine neue Multiplex-SRS-Methode, mit der Breitband-SRS-Bilder schnell erfasst werden können10. Die Technik basiert auf einer kundenspezifischen differentiellen Mehrkanal-Lock-in-Verstärkererkennung, die die gleichzeitige Erkennung von bis zu 32 Kanälen ermöglicht. Darüber hinaus wird eine detaillierte Charakterisierung des Rauschens gezeigt und eine ausgewogene Detektionsmethode zur Eliminierung von Laserrauschen demonstriert. Dieses Protokoll bietet praktische Anleitungen für Benutzer, die am Aufbau von Multiplex-SRS-Systemen interessiert sind.
Shi et al. zeigen die Verwendung von hochmultiplexierten Raman-Farbstoffen in der SRS-Bildgebung11. Mit einer Präresonanzverstärkung zeigen sie, dass SRS eine Empfindlichkeit bieten könnte, die mit der Standard-Immunfluoreszenz vergleichbar ist. Diese Methode umgeht die Grenze der spektral auflösbaren Kanäle in der konventionellen Immunfluoreszenz und ermöglicht die gleichzeitige Überwachung vieler Proteine und die Untersuchung ihrer Wechselwirkungen. Detaillierte Anleitungen zur Probenverarbeitung und zur Raman-Farbstofffärbung werden bereitgestellt, um die Einführung dieser leistungsstarken Methode zu erleichtern.
Miao et al. stellen die Vibrationsbildgebung von geschwollenem Gewebe und Analyse (VISTA) vor, ein hochauflösendes Bildgebungsverfahren, das SRS mit Expansionsmikroskopie kombiniert12. VISTA umgeht Hindernisse, die mit der Fluoreszenzbildgebung verbunden sind, und ermöglicht eine markierungsfreie, superaufgelöste volumetrische Bildgebung in biologischen Proben mit einer räumlichen Auflösung von bis zu 78 nm. Darüber hinaus nutzen sie einen Deep-Learning-Algorithmus, um eine Segmentierung mehrerer Komponenten zu erreichen, einschließlich Proteinaggregaten in Zellen und Gehirngeweben.
Espinoza et al. stellen den Einsatz der zweifarbigen Echtzeit-SRS-Bildgebung von Proteinen und Lipiden für gewebediagnostische Anwendungenvor 13. Die zweifarbige SRS-Bildgebung kann H&E-äquivalente Bilder für Pathologieanwendungen erzeugen. Dieses Protokoll beschreibt die Details der Implementierung einer orthogonalen Modulationstechnik und spektralen Fokussierung für die simultane zweifarbige SRS-Bildgebung. Die Umwandlung von zweifarbigen SRS-Bildern in Pseudo-H&E-Bilder wird auch mit Hirngewebe von Mäusen demonstriert, um Anwendungen für die Gewebediagnose zu veranschaulichen.
Yuan et al. veröffentlichen ein flexibles Kammersystem für die Langzeit-SRS-Bildgebung von lebenden Zellen14. Die meisten der vorhandenen Beobachtungskammern für lebende Zellen sind für Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung ausgelegt. Sie sind mit der SRS-Detektion nicht kompatibel, da ein Objektiv und ein Kondensator mit hoher NA erforderlich sind. Die Autoren demonstrieren eine 24-Stunden-Zeitraffer-SRS-Bildgebung mit der flexiblen Kammer, die Temperatur, CO2 und Luftfeuchtigkeit konstant hält.
Schließlich demonstrieren Wu et al. simultane in vivo Zwei-Photonen-Fluoreszenz (TPEF) und SRS-Bildgebung15. Zwei separate Lasersysteme werden kombiniert, um eine optimale Empfindlichkeit für beide Bildgebungsmodalitäten zu erreichen und komplementäre Informationen zu liefern. Im lebenden Organismus Die SRS-Bildgebung von Gewebe stellt besondere Herausforderungen dar, da depolarisiertes, rückgestreutes Licht epi-detektiert werden muss. In diesem Protokoll werden die Details des optimalen Aufbaus eines TPEF-SRS-Mikroskops erläutert und erläutert, wie es für die In-vivo-Bildgebung des Rückenmarks der Maus verwendet werden kann.
Diese Sammlung von Publikationen repräsentiert den aktuellen Stand der Technik in der CRM-Instrumentierung und den technischen Fortschritt. Forscher, die sich sowohl für die Methodenentwicklung als auch für die Anwendung interessieren, werden diese Sammlung nützlich finden, um Setups zu vergleichen und Benchmarks (Empfindlichkeit, Auflösung usw.) für den Aufbau oder die Optimierung ihrer eigenen Systeme zu erstellen. Die in diesen Protokollen enthaltenen Leitlinien und Best Practices werden in die bestehenden und zukünftigen In-vitro - und In-vivo-Anwendungen einfließen. Die großflächige Einführung der CRM-Technologie wartet noch auf wichtige und innovative Anwendungen und die Kommerzialisierung kompletter CRM-Lösungen. Nichtsdestotrotz ist die Standardisierung von Bildgebungsansätzen und Benchmarks unerlässlich, um Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit zu gewährleisten und eine breitere Implementierung von CRM16 zu ermöglichen.
Der Bereich CRM wächst in rasantem Tempo. Die technischen Entwicklungen, die die Grenzen der Empfindlichkeit, Spezifität und Auflösung überschreiten, treiben die Technologie weiterhin in neue Gebiete. Zum Beispiel beginnt die räumliche Auflösung von SRS die Beugungsgrenze17,18 zu überschreiten. Die Empfindlichkeit der elektronischen Vorresonanz SRS nähert sich nun der der Fluoreszenz19 an. Im Vergleich zur Fluoreszenz hat CRM deutliche Vorteile. Zum Beispiel ermöglichte die Verwendung der Deuterium-Verfolgung zum ersten Mal die In-vivo-Untersuchung der metabolischen Dynamik kleiner Moleküle mit einer subzellulären Auflösung20. Mit kleinen Tags ist es möglich, eine hochgradig gemultiplexte Raman-Detektion von 24 oder mehr markierten Zielen21 durchzuführen. Die Fortschritte in der künstlichen Intelligenz ermöglichen neue Funktionen für CRM, indem sie den hohen Informationsgehalt und die molekularspezifischen Merkmale nutzen, um Objekte mit subtilen räumlichen und spektralen Merkmalsunterschieden zu segmentieren und zu klassifizieren22. Zusammengenommen sind diese technischen Fortschritte im Bereich CRM bereit, die Anwendungen sowohl in der biologischen als auch in der biomedizinischen Bildgebung zu beschleunigen und zu erweitern.