Intrakranielle Kanülenimplantation für serielle lokoregionäre chimäre Antigenrezeptor (CAR) T-Zell-Infusionen in Mäusen

Trotz Verbesserungen in der Chemotherapie, Strahlentherapie und Chirurgie sind Tumore des Zentralnervensystems (ZNS) die tödlichste bösartige Erkrankung in der Pädiatrie¹, was den wichtigen Bedarf an neuen Ansätzen mit erfolgreicheren Ergebnissen unterstreicht. Mit bedeutenden Fortschritten auf dem Gebiet der Immuntherapie haben Ansätze der adoptiven Zelltherapie (ACT) vielversprechende Ergebnisse bei verschiedenen Krebsarten, insbesondere bei hämatologischen Malignomen, gezeigt². Die T-Zell-Therapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR), eine spezielle Art von ACT, macht sich die natürliche Fähigkeit des Immunsystems zunutze, schädliche Zellen zu erkennen und abzutöten, indem sie die Spezifität der T-Zellen umleitet, um tumorgerichtete T-Zellen zu erzeugen³. Die CAR-T-Zell-Therapie hat erhebliche Erfolge bei der Behandlung von Leukämien und Lymphomen gezeigt⁴, was sie zu einem vielversprechenden immuntherapeutischen Ansatz macht und ihre Erforschung bei soliden Tumoren fördert. Bisher hat die CAR-T-Zelltherapie in soliden Tumoren jedoch wenig klinische Erfolge erzielt und steht vor vielen Herausforderungen, wie z. B. einer ineffizienten Tumorpenetration, begrenzten zielgerichteten Antigenen und der suppressiven Tumormikroumgebung⁵.

Jüngste klinische Studien haben mit der Evaluierung der CAR-T-Zell-Therapie bei pädiatrischen ZNS-Tumoren begonnen und in vorläufigen Berichten den Wirksamkeitsnachweis erbracht und in vorläufigen Berichten einen frühen Nachweis der T-Zell-Aktivität erbracht ^6,7,8. Während sich die meisten ersten präklinischen Daten auf die intravenöse Verabreichung der CAR-T-Zellen konzentrierten, deuten neuere präklinische Befunde auf die Überlegenheit der lokoregionären Verabreichung im ZNS^{hin 9,10}, die auch in mehreren klinischen Studien erfolgreich eingesetzt wurde 6,7,8,11 . Bisherige präklinische Studien, die die lokoregionäre Verabreichung von CAR-T-Zellen in das ZNS einbezogen haben, stützten sich auf eine einzige intrakranielle Dosis von CAR-T-Zellen, die stereotaktisch verabreicht wurden ^9,10. Klinische Studien am Menschen erforderten jedoch wiederholte Infusionen von CAR-T-Zellen in das ZNS 6,7,8,11, was die Notwendigkeit unterstreicht^, mehrere wiederholte Infusionen in der präklinischen Entwicklung zu evaluieren. Ziel dieses Verfahrens ist es, serielle CAR-T-Zell-Infusionen mit einem Katheter in orthotopen Mausmodellen von pädiatrischen Hirntumoren erfolgreich zu testen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere chirurgische Eingriffe vermieden werden, um wiederholte intra-ZNS-Behandlungen durchzuführen. Kanülen wurden in erster Linie für die Probenahme von Neurotransmittern in der Mikrodialyse und die Verabreichung neuroaktiver Substanzen in den Neurowissenschaften und der Verhaltensforschung bei Nagetieren verwendet¹², wobei es nur wenige Berichte über ihre Verwendung für die Verabreichung von Krebstherapeutika gibt. Aufbauend auf den früheren Berichten verwendet dieses Protokoll ein stereotaktisch platziertes Verweilkanülensystem, um CAR-T-Zellen in Xenograft-Mausmodellen von ZNS-Tumoren zu verabreichen. Das Protokoll kann verwendet werden, um zusätzliche Therapeutika in Mausmodellen für neurologische oder neuroonkologische Erkrankungen zu testen, und kann hilfreich sein, um neue Therapeutika zu testen, bei denen die Umgehung der Blut-Hirn-Schranke entscheidend für die Wirksamkeit ist.

Alle Protokollverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Children's Hospital of Philadelphia (IAC 19-000907) genehmigt, das von der AAALAC akkreditiert ist. In dieser Studie wurden 6-12 Wochen alte NOD scid gamma (NSG)-Mäuse mit orthotopen Xenotransplantattumoren verwendet. Das Protokoll kann jedoch bei jedem Mausstamm verwendet werden. NSG-Mäuse wurden unter sterilen Barrierebedingungen untergebracht und unter sterilen Biosicherheitswerkbänken operiert. Wenn menschliches Material wie Tumorzellen oder T-Zellen verwendet wird, müssen die Verfahren und die Handhabung in ABSL-2-Biosicherheitswerkbänken durchgeführt werden.

1. Vorbereitung der Maus auf die Operation

1. Die Maus wird in einer Induktionskammer mit Isofluran (2-4%) bei einer Sauerstoffflussrate von 1 l/min anästhesiert, bis eine ausreichende Anästhesieebene erreicht ist (ca. 5 min).
2. Wiegen Sie die Maus mit einer Waage auf 0,1 g genau und verabreichen Sie subkutanes Buprenorphin (1 mg/kg) oder ein anderes Analgetikum mit langsamer Freisetzung (SR).
   HINWEIS: SR Buprenorphin bietet eine Analgesie für 72 Stunden.
3. Rasieren Sie das Fell auf dem Kopf der Maus mit einer elektrischen Haarschneidemaschine oder Enthaarungsmitteln.
4. Öffnen Sie mit einem Spatel vorsichtig die Unterseite des stereotaktischen Arms und führen Sie die Führungskanüle mit einer Pinzette ein. Ziehen Sie die Schraube am Arm fest, um die Kanüle so zu befestigen, dass etwa 1/2 bis 2/3 des weißen Kunststoffteils der Kanüle zusammen mit der gesamten 5 mm Metalllänge der Kanüle aus dem Boden der Öffnung herausragt.
5. Setzen Sie die oberen Zähne der Maus ein und befestigen Sie sie in der Beißleiste des stereotaktischen Apparates. Ziehen Sie den Nasenkegel nach vorne und ziehen Sie ihn fest, um sicherzustellen, dass die Maus Isofluran einatmet.
6. Montieren Sie die Maus mit Ear Cuffs oder Ear Bars auf dem erwärmten stereotaktischen Gerät und vermeiden Sie übermäßigen Druck.
   Anmerkungen: In die erwärmte Schale sollte ein Rektalthermometer eingesetzt sein, und die Warmhalteschale sollte sich anpassen, um während des Eingriffs eine normale Körpertemperatur der Maus aufrechtzuerhalten.
7. Tragen Sie die sterile Augensalbe mit einem Applikator mit Wattespitze auf beide Augen auf.
8. Wischen Sie die Operationsstelle mit Povidon-Jod auf einem Pad oder Applikator ab, gefolgt von einem Alkoholpad. Führen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal durch.
9. Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, führen Sie eine Zehenquetschung mit einer Pinzette durch, um eine ausreichende Sedierung zu beurteilen.

2. Chirurgischer Eingriff

HINWEIS: Bei allen Aspekten des chirurgischen Eingriffs werden sterilisierte Instrumente und aseptische Techniken verwendet. Die Mäuse werden während der gesamten Dauer des Eingriffs, etwa 10-20 Minuten, unter Narkose mit Isofluran (2-4%) behandelt.

1. Heben Sie die Kopfhaut sanft mit einer Pinzette zwischen den Ohren an. Schneiden Sie mit einer sterilen Schere die angehobene Kopfhaut parallel zum Schädel ab und entfernen Sie einen ovalen Hautlappen (0,75-1 cm lang), um den Schädel freizulegen.
   Anmerkungen: Eine Schere wird einem Skalpell vorgezogen, um eine saubere, ovale Öffnung zu bieten und unnötige Schäden an der umgebenden Haut und dem umliegenden Gewebe zu vermeiden.
2. Schieben Sie die Faszien mit einem Skalpell oder Wattestäbchen und einem hämostatischen Wattekügelchen weg, um übermäßige Blutungen bei Bedarf zu verlangsamen.
   Anmerkungen: Die Verwendung der Holzseite einer sterilen Wattestäbchen kann auch Faszien wegschieben und helfen, übermäßige Blutungen zu vermeiden.
3. Identifizieren Sie die Orientierungspunkte Bregma und Lambda, die jeweiligen vorderen und hinteren Markierungen auf dem Schädel, wo sich die Schädelplatten treffen¹³.
   HINWEIS: Die Identifizierung kann verbessert werden, indem die Oberseite des freiliegenden Schädels mit Wasserstoffperoxid abgewischt wird.
4. Ritzen Sie den Schädel vorsichtig mit einem Skalpell ein, um eine Oberfläche zu schaffen, auf der das Acryl befestigt werden kann. Die Ritzung sollte mehrere lineare Linien mit einer Länge von ca. 0,5 bis 1 cm und einem Winkel von 90° zueinander umfassen.
5. Lokalisieren Sie die Kanüle mit dem stereotaktischen Arm an der gewünschten Orientierungsstelle (Bregma oder Lambda). Sobald Sie lokalisiert sind, heben Sie die Kanülenspitze 1-2 mm über die Schädeloberfläche und bewegen Sie sie zu den gewünschten Koordinaten. Bei intratumoralen Injektionen werden dabei die gleichen A/P- und M/L-Koordinaten wie bei der Tumorplatzierung verwendet.
6. Bohren Sie auf dem freiliegenden Schädel, weg von dem Bereich, in den die Kanüle eindringt, mit einer 18-G-Nadel oder einem chirurgischen Bohrer zwei Schraubenlöcher. Stellen Sie sicher, dass die Löcher so weit voneinander entfernt sind, dass genügend Platz für die Kanüle vorhanden ist. Drehen Sie mit einem Bohrer durch die Schraubenlöcher, bis sie am Schädel hängen bleiben. Setzen Sie zwei Schrauben ein und befestigen Sie sie mit einem Schlitzschraubendreher in den Löchern. Ziehen Sie dann die Schrauben vorsichtig nach oben, um sicherzustellen, dass sie befestigt sind.
   Anmerkungen: Setzen Sie die Schrauben erst ein, wenn sie bündig mit dem Schädel abschließen, da sie sonst das darunter liegende Mäusegehirn beschädigen können. Lassen Sie mindestens 1-2 mm Abstand zwischen der Schraube und dem Schädel.
7. Bohren Sie mit einer 18-G-Nadel oder einem chirurgischen Bohrer an den angegebenen Koordinaten durch den Schädel, um ein Loch für die einzuführende Kanüle zu schaffen.
8. Senken Sie die Kanüle mit dem stereotaktischen Arm auf die gewünschte D/V-Koordinate ab.
   HINWEIS: Die D/V-Koordinate der Kanülenimplantation muss die Projektionslänge des Dummys und der Behandlungskanülen berücksichtigen und kann oberflächlicher sein als die orthotope Injektion von Tumorzellen (Abbildung 1).
9. Füllen Sie in einer 12-Well-Platte aus Porzellan eine Vertiefung mit Acrylharzpulver (ca. 0,3 g) und 10-15 Tropfen (ca. 0,5-0,75 ml) Acrylharzflüssigkeit. Dadurch entsteht ein zähflüssiges, weiß gefärbtes Material. Ziehen Sie die Mischung in eine 1-ml-Spritze auf und verwenden Sie sie, um den Schädel zu beschichten und zu bedecken, wobei Sie die Zwischenräume um die Kanüle und die Schrauben ausfüllen.
   Anmerkungen: Das viskose Material härtet mit der Zeit zu Zement aus, daher sollte dieser Schritt sofort nach dem Mischen abgeschlossen werden.
10. Solange der Zement noch biegsam ist, lösen Sie die Schraube am stereotaktischen Arm und lösen Sie die Kanüle mit einem Spatel in der Öffnung unten vorsichtig aus der Halterung und ziehen Sie den stereotaktischen Arm langsam nach oben von der Maus weg.
11. Sobald der Zement vollständig getrocknet ist, führen Sie die Dummy-Kanüle in die Führungskanüle ein und befestigen Sie sie fest, indem Sie sie im Uhrzeigersinn drehen.
12. Sobald der Eingriff abgeschlossen ist, legen Sie die Maus wieder in ihren beheizten Käfig, um sie sorgfältig zu überwachen, eine angemessene Erholung sicherzustellen und alle Beobachtungen nach dem Eingriff aufzuzeichnen, einschließlich der Tatsache, dass die Maus das Bewusstsein vollständig wiedererlangt hat, bevor Sie in die Kolonie zurückkehren.
    Anmerkungen: Es wird im Allgemeinen empfohlen, nur die Hälfte des Käfigs auf ein Heizkissen zu stellen, damit sich das Tier auf die kühlere Seite bewegen kann, um eine Überhitzung zu vermeiden.
13. Verabreichen Sie bei Bedarf zusätzliche Analgetika, wenn die Mäuse postoperativ Verhaltensweisen zeigen, die auf Schmerzen hindeuten, wie z. B. Meloxicam 5 mg/kg, das bis zu 3 Tage lang einmal täglich subkutan verabreicht wird.

3. Präparation von CAR-T-Zellen

1. Messen Sie die Konzentration der vortransfizierten CAR-T-Zellen mit einem Zellzähler.
2. Vortransfizierte T-Zellen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.
3. Saugen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette auf einem Vakuum-Absaugsystem an und resuspendieren Sie das Pellet in phosphatae gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf die gewünschte Konzentration. Typische Verabreichungsvolumina betragen 2-5 μL. Typische Zelldosen betragen 0,5-5 x 10^{6 Zellen.}

4. CAR-T-Zell-Infusionen

1. Bereiten Sie die Behandlungskanüle vor, indem Sie die Oberseite durch ein kleines Stück PKG-Schlauch führen.
2. Füllen Sie die Behandlungsspritze mit der CAR-T-Zell-Suspension und führen Sie sie durch das andere Ende des PKG-Schlauchs ein, so dass die Oberseite der Behandlungskanüle bedeckt ist.
3. Die Maus wird mit Isofluran (2-4%) bei einer Sauerstoffflussrate von 1 l/min anästhesiert.
4. Stabilisieren Sie die Führungskanüle mit einer Pinzette an der Basis und schrauben Sie dann die Dummy-Kanüle vorsichtig ab und entfernen Sie sie, um den Zugang zur Führungskanüle zu ermöglichen.
   HINWEIS: Ein stereotaktischer Aufbau ist nicht erforderlich, kann aber zur Stabilisierung des Kopfes für die Behandlung verwendet werden.
5. Infundieren Sie die CAR-T-Zellen für 1 Minute und halten Sie die Behandlungskanüle nach Beendigung der Infusion für weitere 1 Minute an Ort und Stelle.
6. Nehmen Sie die Behandlungskanüle heraus und schrauben Sie die Dummy-Kanüle wieder fest.
7. Verabreichen Sie subkutanes Meloxicam (5 mg/kg) zur optionalen Schmerzkontrolle.

Erfolgreiche Kanülenimplantation in das ZNS der Maus
Mäuse mit erfolgreicher Kanülierung verfügen über eine sichere Führungskanüle, die die Aktivitäten des täglichen Lebens nicht beeinträchtigt (Abbildung 2A) und die leicht eine Behandlungskanüle passieren und Flüssigkeit ohne Widerstand abgeben kann (Abbildung 2B). Unserer Erfahrung nach bleiben die meisten Kanülen über 4 Wochen an Ort und Stelle, obwohl sich 0-25% im Laufe der Zeit lösen können. Die Überprüfung der korrekten Platzierung kann mit Evans-Blaufarbstoff, der in die Kanüle injiziert wird, bestätigt werden. Zum Beispiel zeigt eine Kanüle, die in den lateralen Ventrikel eingeführt wird, Evans-blauen Farbstoff im gesamten ventrikulären System, während sie durch die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit wandert, was die korrekte Platzierung bestätigt (Abbildung 2C). Kanülen, die in den Tumor eingeführt werden, zeigen Evans-Blau an der Stelle der Tumorimplantation.

Effektiver Transport von CAR-T-Zellen in das ZNS zur Behandlung von Xenograft-Tumoren.
Die Wirksamkeit des intrakraniellen Kanülensystems und die therapeutische Wirksamkeit von CAR-T-Zellen in Mausmodellen können durch eine Vielzahl von Mechanismen gemessen werden, einschließlich der biolumineszenten Bildgebung und des Gesamtüberlebens. GPC2-gerichtete CAR-T-Zellen wurden gegen murine Medulloblastom- und diffuse Mittelliniengliommodelle 7316-4509 bzw. 7316-3058 unter wiederholter CAR-T-Zell-Dosierung über das angegebene intrakranielle Kanülensystem getestet14. Die orthotope Tumorplatzierung und das Engraftment wurden durch biolumineszente Bildgebung bestätigt, und Kanülen wurden mit den gleichen Koordinaten wie die orthotope Tumorplatzierung in das Tumorbett eingebracht. Die Behandlungen bestanden aus ein- bis zweimal wöchentlichen GPC2-CAR-T-Zell-Infusionen über einen Zeitraum von 2-4 Wochen, insgesamt vier bis sechs Dosen. Nach der Behandlung induzierte die GPC2-gerichtete CAR-T-Zelltherapie eine signifikante Tumorregression im Medulloblastommodell 7316-4509 (p < 0,01) (Abbildung 3A) und ein signifikant verlängertes Überleben beim thalamischen diffusen Mittelliniengliom 7316-3058 (p < 0,05) (Abbildung 3B)14.

Abbildung 1: Führungskanüle mit Projektionspuppe und Behandlungskanülen. (A) Führungskanüle mit 0,5 mm Projektion und 2 mm Projektionsdummy-Kanülen. (B) Führungskanüle mit 0,5 mm Projektion und 2 mm Projektionsbehandlungskanülen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Behandlungskanülensystem für wiederholte Dosen von CAR-T-Zellen . (A) Kanüle, die in einen Mausschädel implantiert wurde und bei Nichtgebrauch eine Kappe aufsetzt. (B) Infusion von CAR-T-Zellen in einen pontinen Tumor über die Behandlungskanüle während der Narkose der Maus. (C) Überprüfung der Kanülenplatzierung im lateralen Ventrikel mit Evans-Blaufarbstoff. Der Farbstoff wurde durch die Kanüle eingeführt, gefolgt von Euthanasie und Gehirnexzision, wobei der Farbstoff in den gesamten Ventrikeln vorhanden war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: GPC2-gerichtete CAR-T-Zellen vermitteln Antitumorantworten und verlängern das Überleben in pädiatrischen Hirntumoren in vivo. (A) Quantifizierung der Biolumineszenz des orthotopen Medulloblastom-Xenotransplantats 7316-4509, das entweder mit GPC2- oder CD19-gerichteten mRNA-CAR-T-Zellen behandelt wurde. Die Dosierungen werden durch Pfeile in der Grafik angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert mit SD angezeigt, n = 9-11 Mäuse pro Arm. (B) Gesamtüberleben von Mäusen, denen thalamisches DMG-Xenotransplantat 7316-3058 implantiert wurde, die mit sechs wiederholten Dosen von 2 x 10 6 CAR-T-Zellen behandelt wurden. Die Dosierungen werden durch Pfeile in der Grafik angezeigt. n = 7 Mäuse pro Arm. **p < 0,01; *p < 0,05; ns = nicht signifikant. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Foster et al.14 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

JBF hält ein Patent im Zusammenhang mit Glypican 2 (GPC2)-gerichteten Immuntherapien. Alle anderen Autoren haben nichts zu offenbaren.