Name: Intrakranielle Kanülenimplantation für serielle lokoregionäre chimäre Antigenrezeptor (CAR) T-Zell-Infusionen in Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Lernen Sie die intrakranielle Kanülenimplantation zur wiederholten lokoregionalen CAR-T-Zell-Therapie bei Mäusen kennen. Diese Methode ermöglicht präklinische Studien zu ZNS-Tumoren ohne mehrfach invasive Eingriffe.

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Finanziert wurde diese Arbeit von der Matthew Larson Foundation, der Grayson Saves Foundation, dem Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, der Kortney Rose Foundation, den National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 und 1K08CA263179-01 sowie dem Verteidigungsministerium W81XWH-21-1-0221.

Alle Protokollverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Children's Hospital of Philadelphia (IAC 19-000907) genehmigt, das von der AAALAC akkreditiert ist. In dieser Studie wurden 6-12 Wochen alte NOD scid gamma (NSG)-Mäuse mit orthotopen Xenotransplantattumoren verwendet. Das Protokoll kann jedoch bei jedem Mausstamm verwendet werden. NSG-Mäuse wurden unter sterilen Barrierebedingungen untergebracht und unter sterilen Biosicherheitswerkbänken operiert. Wenn menschliches Material wie Tumorzellen oder T-Zellen verwendet wird, müssen die Verfahren und die Handhabung in ABSL-2-Biosicherheitswerkbänken durchgeführt werden.
1. Vorbereitung der Maus auf die Operation
<ol><li>Die Maus wird in einer Induktionskammer mit Isofluran (2-4%) bei einer Sauerstoffflussrate von 1 l/min anästhesiert, bis eine ausreichende Anästhesieebene erreicht ist (ca. 5 min).</li>
	<li>Wiegen Sie die Maus mit einer Waage auf 0,1 g genau und verabreichen Sie subkutanes Buprenorphin (1 mg/kg) oder ein anderes Analgetikum mit langsamer Freisetzung (SR). HINWEIS: SR Buprenorphin bietet eine Analgesie für 72 Stunden.</li>
	<li>Rasieren Sie das Fell auf dem Kopf der Maus mit einer elektrischen Haarschneidemaschine oder Enthaarungsmitteln.</li>
	<li>Öffnen Sie mit einem Spatel vorsichtig die Unterseite des stereotaktischen Arms und führen Sie die Führungskanüle mit einer Pinzette ein. Ziehen Sie die Schraube am Arm fest, um die Kanüle so zu befestigen, dass etwa 1/2 bis 2/3 des weißen Kunststoffteils der Kanüle zusammen mit der gesamten 5 mm Metalllänge der Kanüle aus dem Boden der Öffnung herausragt.</li>
	<li>Setzen Sie die oberen Zähne der Maus ein und befestigen Sie sie in der Beißleiste des stereotaktischen Apparates. Ziehen Sie den Nasenkegel nach vorne und ziehen Sie ihn fest, um sicherzustellen, dass die Maus Isofluran einatmet.</li>
	<li>Montieren Sie die Maus mit Ear Cuffs oder Ear Bars auf dem erwärmten stereotaktischen Gerät und vermeiden Sie übermäßigen Druck. Anmerkungen: In die erwärmte Schale sollte ein Rektalthermometer eingesetzt sein, und die Warmhalteschale sollte sich anpassen, um während des Eingriffs eine normale Körpertemperatur der Maus aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Tragen Sie die sterile Augensalbe mit einem Applikator mit Wattespitze auf beide Augen auf.</li>
	<li>Wischen Sie die Operationsstelle mit Povidon-Jod auf einem Pad oder Applikator ab, gefolgt von einem Alkoholpad. Führen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal durch.</li>
	<li>Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, führen Sie eine Zehenquetschung mit einer Pinzette durch, um eine ausreichende Sedierung zu beurteilen.</li>
</ol>2. Chirurgischer Eingriff
HINWEIS: Bei allen Aspekten des chirurgischen Eingriffs werden sterilisierte Instrumente und aseptische Techniken verwendet. Die Mäuse werden während der gesamten Dauer des Eingriffs, etwa 10-20 Minuten, unter Narkose mit Isofluran (2-4%) behandelt.
<ol><li>Heben Sie die Kopfhaut sanft mit einer Pinzette zwischen den Ohren an. Schneiden Sie mit einer sterilen Schere die angehobene Kopfhaut parallel zum Schädel ab und entfernen Sie einen ovalen Hautlappen (0,75-1 cm lang), um den Schädel freizulegen. Anmerkungen: Eine Schere wird einem Skalpell vorgezogen, um eine saubere, ovale Öffnung zu bieten und unnötige Schäden an der umgebenden Haut und dem umliegenden Gewebe zu vermeiden.</li>
	<li>Schieben Sie die Faszien mit einem Skalpell oder Wattestäbchen und einem hämostatischen Wattekügelchen weg, um übermäßige Blutungen bei Bedarf zu verlangsamen. Anmerkungen: Die Verwendung der Holzseite einer sterilen Wattestäbchen kann auch Faszien wegschieben und helfen, übermäßige Blutungen zu vermeiden.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Orientierungspunkte Bregma und Lambda, die jeweiligen vorderen und hinteren Markierungen auf dem Schädel, wo sich die Schädelplatten treffen13. HINWEIS: Die Identifizierung kann verbessert werden, indem die Oberseite des freiliegenden Schädels mit Wasserstoffperoxid abgewischt wird.</li>
	<li>Ritzen Sie den Schädel vorsichtig mit einem Skalpell ein, um eine Oberfläche zu schaffen, auf der das Acryl befestigt werden kann. Die Ritzung sollte mehrere lineare Linien mit einer Länge von ca. 0,5 bis 1 cm und einem Winkel von 90° zueinander umfassen.</li>
	<li>Lokalisieren Sie die Kanüle mit dem stereotaktischen Arm an der gewünschten Orientierungsstelle (Bregma oder Lambda). Sobald Sie lokalisiert sind, heben Sie die Kanülenspitze 1-2 mm über die Schädeloberfläche und bewegen Sie sie zu den gewünschten Koordinaten. Bei intratumoralen Injektionen werden dabei die gleichen A/P- und M/L-Koordinaten wie bei der Tumorplatzierung verwendet.</li>
	<li>Bohren Sie auf dem freiliegenden Schädel, weg von dem Bereich, in den die Kanüle eindringt, mit einer 18-G-Nadel oder einem chirurgischen Bohrer zwei Schraubenlöcher. Stellen Sie sicher, dass die Löcher so weit voneinander entfernt sind, dass genügend Platz für die Kanüle vorhanden ist. Drehen Sie mit einem Bohrer durch die Schraubenlöcher, bis sie am Schädel hängen bleiben. Setzen Sie zwei Schrauben ein und befestigen Sie sie mit einem Schlitzschraubendreher in den Löchern. Ziehen Sie dann die Schrauben vorsichtig nach oben, um sicherzustellen, dass sie befestigt sind. Anmerkungen: Setzen Sie die Schrauben erst ein, wenn sie bündig mit dem Schädel abschließen, da sie sonst das darunter liegende Mäusegehirn beschädigen können. Lassen Sie mindestens 1-2 mm Abstand zwischen der Schraube und dem Schädel.</li>
	<li>Bohren Sie mit einer 18-G-Nadel oder einem chirurgischen Bohrer an den angegebenen Koordinaten durch den Schädel, um ein Loch für die einzuführende Kanüle zu schaffen.</li>
	<li>Senken Sie die Kanüle mit dem stereotaktischen Arm auf die gewünschte D/V-Koordinate ab. HINWEIS: Die D/V-Koordinate der Kanülenimplantation muss die Projektionslänge des Dummys und der Behandlungskanülen berücksichtigen und kann oberflächlicher sein als die orthotope Injektion von Tumorzellen (Abbildung 1).</li>
	<li>Füllen Sie in einer 12-Well-Platte aus Porzellan eine Vertiefung mit Acrylharzpulver (ca. 0,3 g) und 10-15 Tropfen (ca. 0,5-0,75 ml) Acrylharzflüssigkeit. Dadurch entsteht ein zähflüssiges, weiß gefärbtes Material. Ziehen Sie die Mischung in eine 1-ml-Spritze auf und verwenden Sie sie, um den Schädel zu beschichten und zu bedecken, wobei Sie die Zwischenräume um die Kanüle und die Schrauben ausfüllen. Anmerkungen: Das viskose Material härtet mit der Zeit zu Zement aus, daher sollte dieser Schritt sofort nach dem Mischen abgeschlossen werden.</li>
	<li>Solange der Zement noch biegsam ist, lösen Sie die Schraube am stereotaktischen Arm und lösen Sie die Kanüle mit einem Spatel in der Öffnung unten vorsichtig aus der Halterung und ziehen Sie den stereotaktischen Arm langsam nach oben von der Maus weg.</li>
	<li>Sobald der Zement vollständig getrocknet ist, führen Sie die Dummy-Kanüle in die Führungskanüle ein und befestigen Sie sie fest, indem Sie sie im Uhrzeigersinn drehen.</li>
	<li>Sobald der Eingriff abgeschlossen ist, legen Sie die Maus wieder in ihren beheizten Käfig, um sie sorgfältig zu überwachen, eine angemessene Erholung sicherzustellen und alle Beobachtungen nach dem Eingriff aufzuzeichnen, einschließlich der Tatsache, dass die Maus das Bewusstsein vollständig wiedererlangt hat, bevor Sie in die Kolonie zurückkehren. Anmerkungen: Es wird im Allgemeinen empfohlen, nur die Hälfte des Käfigs auf ein Heizkissen zu stellen, damit sich das Tier auf die kühlere Seite bewegen kann, um eine Überhitzung zu vermeiden.</li>
	<li>Verabreichen Sie bei Bedarf zusätzliche Analgetika, wenn die Mäuse postoperativ Verhaltensweisen zeigen, die auf Schmerzen hindeuten, wie z. B. Meloxicam 5 mg/kg, das bis zu 3 Tage lang einmal täglich subkutan verabreicht wird.</li>
</ol>3. Präparation von CAR-T-Zellen
<ol><li>Messen Sie die Konzentration der vortransfizierten CAR-T-Zellen mit einem Zellzähler.</li>
	<li>Vortransfizierte T-Zellen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteurpipette auf einem Vakuum-Absaugsystem an und resuspendieren Sie das Pellet in phosphatae gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf die gewünschte Konzentration. Typische Verabreichungsvolumina betragen 2-5 μL. Typische Zelldosen betragen 0,5-5 x 106 Zellen.</li>
</ol>4. CAR-T-Zell-Infusionen
<ol><li>Bereiten Sie die Behandlungskanüle vor, indem Sie die Oberseite durch ein kleines Stück PKG-Schlauch führen.</li>
	<li>Füllen Sie die Behandlungsspritze mit der CAR-T-Zell-Suspension und führen Sie sie durch das andere Ende des PKG-Schlauchs ein, so dass die Oberseite der Behandlungskanüle bedeckt ist.</li>
	<li>Die Maus wird mit Isofluran (2-4%) bei einer Sauerstoffflussrate von 1 l/min anästhesiert.</li>
	<li>Stabilisieren Sie die Führungskanüle mit einer Pinzette an der Basis und schrauben Sie dann die Dummy-Kanüle vorsichtig ab und entfernen Sie sie, um den Zugang zur Führungskanüle zu ermöglichen. HINWEIS: Ein stereotaktischer Aufbau ist nicht erforderlich, kann aber zur Stabilisierung des Kopfes für die Behandlung verwendet werden.</li>
	<li>Infundieren Sie die CAR-T-Zellen für 1 Minute und halten Sie die Behandlungskanüle nach Beendigung der Infusion für weitere 1 Minute an Ort und Stelle.</li>
	<li>Nehmen Sie die Behandlungskanüle heraus und schrauben Sie die Dummy-Kanüle wieder fest.</li>
	<li>Verabreichen Sie subkutanes Meloxicam (5 mg/kg) zur optionalen Schmerzkontrolle.</li>
</ol>

<ol><li>Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declines+in+cancer+death+rates+among+children+and+adolescents+in+the+United+States%2C+1999-2014%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014.</a> NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).</li>
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</ol>

JBF hält ein Patent im Zusammenhang mit Glypican 2 (GPC2)-gerichteten Immuntherapien. Alle anderen Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die CAR-T-Zelltherapie hat die Behandlung hämatologischer Krebserkrankungen revolutioniert und zeigt einen vielversprechenden Wert bei der Behandlung solider Hirntumoren 6,7,8. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die präklinische Bewertung des lokoregionären CAR-T-Zell-Transfers für die Behandlung von pädiatrischen ZNS-Tumoren zu ermöglichen. Das Kanülensystem repliziert ein Ommaya- oder Rickham-Reservoir, ein intraventrikuläres Kathetersystem, das derzeit in laufenden klinischen Studien zur CAR-T-Zelltherapie bei pädiatrischen ZNS-Tumoren eingesetzt wird 6,7,8, was die Relevanz und das translationale Potenzial dieser Methoden unterstreicht. Dieses System ermöglicht die wiederholte Verabreichung von CAR-T-Zellen, die die Blut-Hirn-Schranke umgehen, ähnlich wie bei Methoden, die in laufenden klinischen Studien eingesetzt werden. Die lokoregionäre Verabreichung kann eine maximale Wirksamkeit im ZNSerzielen 9 und kann auch das Risiko systemischer Toxizitäten im Zusammenhang mit dem Transport aus dem Verkehr verringern15. Während bei der stereotaktischen Verabreichung eine einzelne Dosis in das ZNS verabreicht werden kann, besteht der Vorteil dieses Systems in der Möglichkeit, mehrere wiederholte Dosen an einer bestimmten Stelle im ZNS zu verabreichen, ohne dass mehrere Operationen erforderlich sind. Zu den Einschränkungen dieses Verfahrens gehören eine feste Entbindungsstelle ohne die Möglichkeit, die Position zu ändern oder Anpassungen vorzunehmen, sobald die Kanüle an Ort und Stelle ist, und die Möglichkeit, dass sich die Kanüle löst.
Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Implantation der festsitzenden Führungskanüle an einer D/V-Koordinate, die die Projektion der Behandlungskanülen berücksichtigt. Die Behandlungskanüle ragt über die Spitze der Führungskanüle hinaus, so dass darauf geachtet werden muss, dass die Platzierung zur Abgabe von CAR-T-Zellen in die interessierende Region führt. Die Projektionslängen der Behandlungskanüle können individuell angepasst werden, und nach der Erfahrung des Autors ist 0,5 mm eine sinnvolle Projektionslänge. Diese Länge stellt sicher, dass das Therapeutikum bei der Abgabe nicht in der Führungskanüle verbleibt, erfordert aber auch keine wesentliche Anpassung der D/V-Koordinaten für die Führungskanüle an die interessierende Region. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Zeit, in der die Behandlungskanüle nach der CAR-T-Zell-Infusion an Ort und Stelle bleibt. Die Behandlungskanüle sollte nach dem Ende der Infusion mindestens 1 Minute lang an Ort und Stelle gehalten werden, um ein Auslaufen und den Verlust der lokoregionären Verabreichung der CAR-T-Zelltherapie zu vermeiden.
Die Fehlerbehebung bei dieser Methode ist unkompliziert, wobei die meisten Komplikationen Schwierigkeiten beim Entfernen der Dummy-Kanüle oder beim Einsetzen der Behandlungskanüle in die festsitzende Führungskanüle erfordern, wahrscheinlich aufgrund von getrocknetem Blut im Inneren der Führungskanüle. Dies kann leicht behoben werden, indem die Dummy-Kanüle vorsichtig durch die Führungskanüle geführt wird, bis weniger Widerstand vorhanden ist und der Schmutz beseitigt wurde. Das Acrylharz kann sich gelegentlich vom Schädel lösen, was zum Verlust des Kanülensystems führt. Unserer Erfahrung nach wird dies in der Regel durch das Einritzen des Schädels mit einem Skalpell und das Platzieren von zwei Schrauben begrenzt. Darüber hinaus werden alle Gegenstände aus dem Käfig entfernt, die versehentlich Kraft auf die Kanüle ausüben könnten, während sich die Maus bewegt, wie z. B. bestimmte Mäuseanreicherungshütten mit kleinen Öffnungen.
Zusammenfassend wird hier ein Protokoll für das Einsetzen eines Kanülensystems in murine Modelle von ZNS-Tumoren zur wiederholten Abgabe von CAR-T-Zellen beschrieben. Die Platzierung der Kanülen kann an mehrere lokoregionale Verabreichungsorte angepasst werden, um die Wirksamkeit verschiedener Verabreichungsorte zu testen. Darüber hinaus kann dieses System für weitere Therapeutika über CAR-T-Zellen hinaus verwendet werden, um die Wirksamkeit bei der Umgehung der Blut-Hirn-Schranke zu bewerten, und kann auch für die Evaluierung von Therapeutika in Mausmodellen für nicht-onkologische Erkrankungen nützlich sein.

Trotz Verbesserungen in der Chemotherapie, Strahlentherapie und Chirurgie sind Tumore des Zentralnervensystems (ZNS) die tödlichste bösartige Erkrankung in der Pädiatrie1, was den wichtigen Bedarf an neuen Ansätzen mit erfolgreicheren Ergebnissen unterstreicht. Mit bedeutenden Fortschritten auf dem Gebiet der Immuntherapie haben Ansätze der adoptiven Zelltherapie (ACT) vielversprechende Ergebnisse bei verschiedenen Krebsarten, insbesondere bei hämatologischen Malignomen, gezeigt2. Die T-Zell-Therapie mit chimären Antigenrezeptoren (CAR), eine spezielle Art von ACT, macht sich die natürliche Fähigkeit des Immunsystems zunutze, schädliche Zellen zu erkennen und abzutöten, indem sie die Spezifität der T-Zellen umleitet, um tumorgerichtete T-Zellen zu erzeugen3. Die CAR-T-Zell-Therapie hat erhebliche Erfolge bei der Behandlung von Leukämien und Lymphomen gezeigt4, was sie zu einem vielversprechenden immuntherapeutischen Ansatz macht und ihre Erforschung bei soliden Tumoren fördert. Bisher hat die CAR-T-Zelltherapie in soliden Tumoren jedoch wenig klinische Erfolge erzielt und steht vor vielen Herausforderungen, wie z. B. einer ineffizienten Tumorpenetration, begrenzten zielgerichteten Antigenen und der suppressiven Tumormikroumgebung5.
Jüngste klinische Studien haben mit der Evaluierung der CAR-T-Zell-Therapie bei pädiatrischen ZNS-Tumoren begonnen und in vorläufigen Berichten den Wirksamkeitsnachweis erbracht und in vorläufigen Berichten einen frühen Nachweis der T-Zell-Aktivität erbracht 6,7,8. Während sich die meisten ersten präklinischen Daten auf die intravenöse Verabreichung der CAR-T-Zellen konzentrierten, deuten neuere präklinische Befunde auf die Überlegenheit der lokoregionären Verabreichung im ZNShin 9,10, die auch in mehreren klinischen Studien erfolgreich eingesetzt wurde 6,7,8,11 . Bisherige präklinische Studien, die die lokoregionäre Verabreichung von CAR-T-Zellen in das ZNS einbezogen haben, stützten sich auf eine einzige intrakranielle Dosis von CAR-T-Zellen, die stereotaktisch verabreicht wurden 9,10. Klinische Studien am Menschen erforderten jedoch wiederholte Infusionen von CAR-T-Zellen in das ZNS 6,7,8,11, was die Notwendigkeit unterstreicht, mehrere wiederholte Infusionen in der präklinischen Entwicklung zu evaluieren. Ziel dieses Verfahrens ist es, serielle CAR-T-Zell-Infusionen mit einem Katheter in orthotopen Mausmodellen von pädiatrischen Hirntumoren erfolgreich zu testen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere chirurgische Eingriffe vermieden werden, um wiederholte intra-ZNS-Behandlungen durchzuführen. Kanülen wurden in erster Linie für die Probenahme von Neurotransmittern in der Mikrodialyse und die Verabreichung neuroaktiver Substanzen in den Neurowissenschaften und der Verhaltensforschung bei Nagetieren verwendet12, wobei es nur wenige Berichte über ihre Verwendung für die Verabreichung von Krebstherapeutika gibt. Aufbauend auf den früheren Berichten verwendet dieses Protokoll ein stereotaktisch platziertes Verweilkanülensystem, um CAR-T-Zellen in Xenograft-Mausmodellen von ZNS-Tumoren zu verabreichen. Das Protokoll kann verwendet werden, um zusätzliche Therapeutika in Mausmodellen für neurologische oder neuroonkologische Erkrankungen zu testen, und kann hilfreich sein, um neue Therapeutika zu testen, bei denen die Umgehung der Blut-Hirn-Schranke entscheidend für die Wirksamkeit ist.

<table><tbody><tr><td>18 G Nadeln</td><td>BD</td><td>511097</td><td>1 1/2 Zoll Metallnabe</td></tr><tr><td>Acrylharz flüssig</td><td>Lang Dental</td><td>Nr. B1323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acrylharz Pulver</td><td>Lang Dental</td><td>Nr. B1323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol-Tücher</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5240</td><td>Eppendorf</td><td>5420000040</td><td>Zentrifuge&nbsp;</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Puritan</td><td>826-WC</td><td>Griffbreite = 2,11 mm (0,083), Kopfbreite = 1,27 mm (0,050), Grifflänge = 147,62 mm (5,812), Gesamtlänge = 152,4 mm (6), Kopflänge = 12,7 mm (0,500)</td></tr><tr><td>Bohrerhalter&nbsp;</td><td>P1 Technologien&nbsp;</td><td>DH-1&nbsp;</td><td>Bohrerhalter für D56-D70&nbsp;</td></tr><tr><td>Bohrer&nbsp;</td><td>P1 Technologien&nbsp;</td><td>D58&nbsp;</td><td>1,07 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Dummy-Kanüle&nbsp;</td><td>P1 Technologien&nbsp;</td><td>C315DCS-5/SPC&nbsp;</td><td>Konfiguration: Small Cap; &nbsp; Länge: 5,00 mm unter dem Sockel geschnitten; Projektion: 0,50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Schraubendreher mit flacher Spitze&nbsp;</td><td>P1 Technologien&nbsp;</td><td>SD-80&nbsp;</td><td>Schraubendreher&nbsp;</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>Pinzettenführung</td></tr><tr><td>Kanüle&nbsp;</td><td>P1 Technologien&nbsp;</td><td>C315GS-5/SPC&nbsp;</td><td>Konfiguration: 5,00 mm Sockelhöhe; Länge: Schnitt 5,00 mm unter dem Sockel&nbsp;</td></tr><tr><td>Hämostatische Baumwollpellets mit racemischem Adrenalin&nbsp;</td><td>Pascal&nbsp;</td><td>1151602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MOXI Z Mini automatisiertes Zellzähler-Kit&nbsp;</td><td>Moxi</td><td>MXZ001</td><td>Zellenzähler</td></tr><tr><td>NOD&nbsp; scid&nbsp; Gamma (NSG) Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>5557</td> 6 <td>bis 12 Wochen alte Männchen und Weibchen</td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>PKG-Schläuche&nbsp;</td><td>P1 Technologien&nbsp;</td><td>C313CT&nbsp;</td><td>Durchmesser: 0,58 mm x 1,27 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Porzellanplatte mit 12 Vertiefungen</td><td>Flinn Scientific</td><td>AP6064&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Povidon Jod</td><td>Medline</td><td>MDS093943</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>World Precision Instrument</td><td>50-822-457</td><td>Einweg-Skalpell, Nr.10, steril, 10/Box, Kunststoffgriff mit 6"</td></tr><tr><td>Linealschrauben&nbsp;</td><td>P1 Technologien&nbsp;</td><td>0-80 X 3/32&nbsp;</td><td>2,4 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen&nbsp;</td><td>David Kopf Instrumente&nbsp;</td><td>940&nbsp;</td><td>Modell 940 Stereotaktisches Kleintiergerät mit digitaler Anzeigekonsole</td></tr><tr><td>Schüler-Feinschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-12</td><td></td>Scheren-Behandlungskanüle</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>P1 Technologien&nbsp;</td><td>C315IS-5/SPC&nbsp;</td><td>33GA; &nbsp; Konfiguration: Standard intern; Länge: 5,00 mm unter dem Sockel geschnitten; Projektion: 0,50 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Spritzen zur Behandlung&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87908</td><td>5 & Mikro; L, Modell 75 Zementnadel Spezial (SN) Spritze, 75SN/22/0,5"/PT3&nbsp;</td></tr><tr><td>Vactrap XL&nbsp;</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>305-4401-FLS</td><td>Vakuumsystem</td></tr></tbody></table>

intrakranielle kanülenimplantation für serielle lokoregionäre chimäre antigenrezeptor (car) t-zell-infusionen in mäusen

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

Pädiatrische ZNS-Tumore sind für die Mehrzahl der krebsbedingten Todesfälle bei Kindern verantwortlich und haben trotz Fortschritten in der Chemo- und Strahlentherapie schlechte Prognosen. Da es für viele Tumore keine wirksamen Behandlungen gibt, besteht ein entscheidender Bedarf, vielversprechendere Therapieoptionen wie Immuntherapien zu entwickeln. Von besonderem Interesse ist der Einsatz einer chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zell-Therapie, die gegen ZNS-Tumoren gerichtet ist. Zelloberflächen-Targets wie B7-H3, IL13RA2 und das Disialogangliosid GD2 werden auf der Oberfläche mehrerer pädiatrischer und erwachsener ZNS-Tumoren stark exprimiert, was die Möglichkeit erhöht, die CAR-T-Zelltherapie gegen diese und andere Oberflächenziele einzusetzen. Um die wiederholte lokoregionäre Verabreichung von CAR-T-Zellen in präklinischen Mausmodellen zu evaluieren, wurde ein Verweilkathetersystem etabliert, das Verweilkatheter rekapituliert, die derzeit in klinischen Studien am Menschen verwendet werden. Im Gegensatz zur stereotaktischen Verabreichung ermöglicht das Verweilkathetersystem eine wiederholte Dosierung ohne den Einsatz mehrerer Operationen. Dieses Protokoll beschreibt die intratumorale Platzierung einer festsitzenden Führungskanüle, mit der serielle CAR-T-Zell-Infusionen in orthotopen Mausmodellen von pädiatrischen Hirntumoren erfolgreich getestet wurden. Nach der orthotopen Injektion und Transplantation der Tumorzellen in Mäusen erfolgt die intratumorale Platzierung einer festsitzenden Führungskanüle auf einer stereotaktischen Apparatur und wird mit Schrauben und Acrylharz gesichert. Die Behandlungskanülen werden dann durch die festsitzende Führungskanüle eingeführt, um wiederholt CAR-T-Zellen zu verabreichen. Die stereotaktische Platzierung der Führungskanüle kann so eingestellt werden, dass CAR-T-Zellen direkt in den lateralen Ventrikel oder andere Stellen im Gehirn gelangen. Diese Plattform bietet einen zuverlässigen Mechanismus für die präklinische Erprobung wiederholter intrakranieller Infusionen von CAR-T-Zellen und anderen neuartigen Therapeutika für diese verheerenden pädiatrischen Tumore.

Erfolgreiche Kanülenimplantation in das ZNS der Maus Mäuse mit erfolgreicher Kanülierung verfügen über eine sichere Führungskanüle, die die Aktivitäten des täglichen Lebens nicht beeinträchtigt (Abbildung 2A) und die leicht eine Behandlungskanüle passieren und Flüssigkeit ohne Widerstand abgeben kann (Abbildung 2B). Unserer Erfahrung nach bleiben die meisten Kanülen über 4 Wochen an Ort und Stelle, obwohl sich 0-25% im Laufe der Zeit lösen können. Die Überprüfung der korrekten Platzierung kann mit Evans-Blaufarbstoff, der in die Kanüle injiziert wird, bestätigt werden. Zum Beispiel zeigt eine Kanüle, die in den lateralen Ventrikel eingeführt wird, Evans-blauen Farbstoff im gesamten ventrikulären System, während sie durch die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit wandert, was die korrekte Platzierung bestätigt (Abbildung 2C). Kanülen, die in den Tumor eingeführt werden, zeigen Evans-Blau an der Stelle der Tumorimplantation.
Effektiver Transport von CAR-T-Zellen in das ZNS zur Behandlung von Xenograft-Tumoren. Die Wirksamkeit des intrakraniellen Kanülensystems und die therapeutische Wirksamkeit von CAR-T-Zellen in Mausmodellen können durch eine Vielzahl von Mechanismen gemessen werden, einschließlich der biolumineszenten Bildgebung und des Gesamtüberlebens. GPC2-gerichtete CAR-T-Zellen wurden gegen murine Medulloblastom- und diffuse Mittelliniengliommodelle 7316-4509 bzw. 7316-3058 unter wiederholter CAR-T-Zell-Dosierung über das angegebene intrakranielle Kanülensystem getestet14. Die orthotope Tumorplatzierung und das Engraftment wurden durch biolumineszente Bildgebung bestätigt, und Kanülen wurden mit den gleichen Koordinaten wie die orthotope Tumorplatzierung in das Tumorbett eingebracht. Die Behandlungen bestanden aus ein- bis zweimal wöchentlichen GPC2-CAR-T-Zell-Infusionen über einen Zeitraum von 2-4 Wochen, insgesamt vier bis sechs Dosen. Nach der Behandlung induzierte die GPC2-gerichtete CAR-T-Zelltherapie eine signifikante Tumorregression im Medulloblastommodell 7316-4509 (p &lt; 0,01) (Abbildung 3A) und ein signifikant verlängertes Überleben beim thalamischen diffusen Mittelliniengliom 7316-3058 (p &lt; 0,05) (Abbildung 3B)14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig01.jpg"> Abbildung 1: Führungskanüle mit Projektionspuppe und Behandlungskanülen. (A) Führungskanüle mit 0,5 mm Projektion und 2 mm Projektionsdummy-Kanülen. (B) Führungskanüle mit 0,5 mm Projektion und 2 mm Projektionsbehandlungskanülen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig02.jpg"> Abbildung 2: Behandlungskanülensystem für wiederholte Dosen von CAR-T-Zellen . (A) Kanüle, die in einen Mausschädel implantiert wurde und bei Nichtgebrauch eine Kappe aufsetzt. (B) Infusion von CAR-T-Zellen in einen pontinen Tumor über die Behandlungskanüle während der Narkose der Maus. (C) Überprüfung der Kanülenplatzierung im lateralen Ventrikel mit Evans-Blaufarbstoff. Der Farbstoff wurde durch die Kanüle eingeführt, gefolgt von Euthanasie und Gehirnexzision, wobei der Farbstoff in den gesamten Ventrikeln vorhanden war. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig03.jpg"> Abbildung 3: GPC2-gerichtete CAR-T-Zellen vermitteln Antitumorantworten und verlängern das Überleben in pädiatrischen Hirntumoren in vivo. (A) Quantifizierung der Biolumineszenz des orthotopen Medulloblastom-Xenotransplantats 7316-4509, das entweder mit GPC2- oder CD19-gerichteten mRNA-CAR-T-Zellen behandelt wurde. Die Dosierungen werden durch Pfeile in der Grafik angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert mit SD angezeigt, n = 9-11 Mäuse pro Arm. (B) Gesamtüberleben von Mäusen, denen thalamisches DMG-Xenotransplantat 7316-3058 implantiert wurde, die mit sechs wiederholten Dosen von 2 x 10 6 CAR-T-Zellen behandelt wurden. Die Dosierungen werden durch Pfeile in der Grafik angezeigt. n = 7 Mäuse pro Arm. **p &lt; 0,01; *p &lt; 0,05; ns = nicht signifikant. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Foster et al.14 reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Tumore des Zentralnervensystems (ZNS) sind die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Kindern, und lokoregionäre immunbasierte Therapien werden zunehmend in klinischen Studien an Patienten getestet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur lokoregionären Kanülenimplantation bei Mäusen zur präklinischen Evaluierung von immuntherapeutischen Infusionen, die auf ZNS-Tumoren abzielen.

Intrakranielle Kanülenimplantation für serielle lokoregionäre chimäre Antigenrezeptor (CAR) T-Zell-Infusionen in Mäusen

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...

Dieses Protokoll repliziert ein intraventrikuläres Kathetersystem, das in laufenden klinischen Studien verwendet wird, um die lokale regionale Verabreichung einer CAR-T-Zell-Therapie gegen Tumore des zentralen Nervensystems zu testen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, mehrere wiederholte Dosen der lokalen regionalen CAR-T-Zell-Therapie zu verabreichen, ohne mehrere invasive chirurgische Eingriffe durchführen zu müssen. Dieses System könnte verwendet werden, um verschiedene Therapeutika an verschiedenen Verabreichungsorten zu untersuchen, und könnte so Einblicke in eine Vielzahl von Forschungsbereichen in den Neurowissenschaften geben.Legen Sie zunächst die betäubte Maus mit rasiertem Kopf auf den Operationstisch und öffnen Sie vorsichtig die Unterseite des stereotaktischen Arms mit einem Spatel. Führen Sie die Kanüle mit einer Pinzette ein und sichern Sie sie, indem Sie die Schraube am Arm festziehen, bis die Hälfte bis zwei Drittel des weißen Kunststoffteils und fünf Millimeter der Kanüle aus dem Boden der Öffnung herausragen. Setzen Sie die oberen Zähne der Maus ein und befestigen Sie sie in der Beißleiste des stereotaktischen Apparates.Ziehen Sie den Nasenkegel nach vorne und ziehen Sie ihn fest, um sicherzustellen, dass die Maus Isofluran einatmet. Montieren Sie dann die Maus mit Ear Cuffs oder Ear Bars auf dem erwärmten stereotaktischen Gerät, um übermäßigen Druck zu vermeiden. Desinfizieren Sie die Operationsstelle und machen Sie einen Schnitt parallel zum Schädel, wie im Manuskript beschrieben.Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Faszien wegzudrücken. Identifizieren Sie die Orientierungspunkte, Bregma und Lambda auf dem Schädel, die den vorderen und hinteren Markierungen entsprechen, wo sich die Schädelplatten treffen. Um eine Oberfläche für die Befestigung des Acryls zu schaffen, machen Sie mit einem Skalpell vorsichtig mehrere Schlitze quer durch den Schädel.Lokalisieren Sie die Kanüle mit dem stereotaktischen Arm an der gewünschten Orientierungsstelle. Heben Sie die Kanülenspitze ein bis zwei Millimeter über die Schädeloberfläche und bewegen Sie sie zu den gewünschten Koordinaten. Bohren Sie mit einer 18-Gauge-Nadel oder einem chirurgischen Bohrer zwei Schraubenlöcher in den freiliegenden Schädel, weg von der Stelle, an der die Kanüle eintritt, und sorgen Sie für genügend Platz für die Kanüle.Drehen Sie den Bohrer durch das Schraubenloch, bis er am Schädel befestigt ist. Setzen Sie mit einem Schlitzschraubendreher zwei Schrauben in die Löcher ein und befestigen Sie sie. Ziehen Sie dann die Schraube vorsichtig nach oben, um sicherzustellen, dass sie gesichert ist.Um eine Kanüle einzuführen, erzeugen Sie an den angegebenen Koordinaten mit einer 18-Gauge-Nadel oder einem chirurgischen Bohrer ein Loch in den Schädel. Senken Sie die Kanüle mit dem stereotaktischen Arm auf die gewünschte DV-Koordinate ab. Bei ca. 0,3 Gramm Acrylharzpulver und 10 bis 15 Tropfen Flüssigkeit in einer 12-Well-Porzellanplatte wird das vorbereitete viskose, weiß gefärbte Material in eine Ein-Milliliter-Spritze gegeben.Beschichten Sie den Schädel und füllen Sie die Zwischenräume um die Kanüle und die Schraube aus. Lösen Sie die Schraube am stereotaktischen Arm, während der Zement flexibel ist. Lösen Sie die Kanüle vorsichtig mit einem Spatel aus der Halterung an der unteren Öffnung und ziehen Sie den stereotaktischen Arm von der Maus weg.Sobald der Zement getrocknet ist, führen Sie die Dummy-Kanüle in die Führungskanüle ein und drehen Sie sie im Uhrzeigersinn, um sie fest zu befestigen. Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, bringen Sie die Maus zur Erholung in ihren beheizten Käfig zurück. Um die Behandlungskanüle vorzubereiten, führen Sie ihren Deckel in den PKG-Schlauch ein.Füllen Sie dann die Behandlungsspritze mit CAR-T-Zell-Suspension und führen Sie sie durch das andere Ende des PKG-Röhrchens ein, so dass die Oberseite der Behandlungskanüle bedeckt ist. Nachdem Sie die Maus betäubt haben, fixieren Sie die Führungskanüle mit einer Pinzette an der Basis. Schrauben Sie die Dummy-Kanüle ab und entfernen Sie sie, um Zugang zur Führungskanüle zu erhalten.Infundieren Sie die CAR-T-Zellen für eine Minute und halten Sie die Behandlungskanüle für eine weitere Minute an Ort und Stelle. Schrauben Sie nach dem Entfernen der Behandlungskanüle eine Dummy-Kanüle fest zurück. Verabreichen Sie dann Meloxicam subkutan zur Schmerzkontrolle.Die GPC2-gerichtete CAR-T-Zell-Therapie induzierte eine signifikante Tumorregression im Medulloblastom und ein signifikant verlängertes Überleben im thalamischen diffusen Mittelliniengliommodell. Beim Einführen der Führungskanüle in eine intratumorale Position ist es wichtig zu verstehen, dass die dorsal-ventralen Koordinaten oberflächlicher sein können als bei der Tumorinjektion, um die Projektionslängen des Dummys und der Behandlungskanüle zu berücksichtigen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Spaltung von Maus Medulloblastom Gewebe und anschließende allogene der Tumorzellen in immunsupprimierten Empfängermäuse um sekundäre Medulloblastom einzuleiten.

Intrakranielle orthotopen allogene von Medulloblastom Cells bei immungeschwächten Mäusen

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur intrakraniellen Kanülenimplantation in einem Hirntumor-Mausmodell, um die Verabreichung eines Immuntherapeutikums zu erleichtern. Die Verabreichung von Glypican-2-spezifischen chimären Antigenrezeptor-T-Zellen in der Tumormikroumgebung löst die T-Zell-Aktivierung aus, was zu einer Tumorlyse und Tumorregression führt.

Intrakranielle Kanülenimplantation bei einer Maus zur Verabreichung von Therapeutika an Hirntumore

Quelle: Lim, M., et al. Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader. J. Vis. Exp. (2022)In diesem Video wird eine anästhesierte Maus einem chirurgischen Eingriff unterzogen, bei dem Krebszellen in die Arteria carotis communis (CCA) injiziert werden, um eine gezielte Abgabe an das Gehirn zu ermöglichen. Das Verfahren beinhaltet ein präzises Nähen und Manipulieren der Halsschlagadern, um die injizierten Zellen in Richtung der Arteria carotis...

Modellierung der Metastasierung von Hirntumoren durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Hirnmetastasen hat ein dringender medizinischer Bedarf werden wie ihre Häufigkeit zugenommen hat, während therapeutische Optionen palliative geblieben sind. Erstellen von experimentellen Tiermodellen von Hirnmetastasen über intracarotid arterielle Injektion von Krebszellen erleichtert mechanistische Untersuchungen der Krankheitsbiologie und Evaluierung neuartiger Interventions Regimen.

Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Die Reparatur der Arteria intracarotisis in einem Mausmodell nach der Injektion stellt den Blutfluss in die Arterie wieder her, ohne die Verteilung des injizierten Materials negativ zu beeinflussen. Die Reparatur der Injektionsstelle erleichtert nachfolgende Injektionen durch dieselbe Arterie und beugt zerebraler Ischämie bei Mausstämmen vor, denen ein vollständiger Willis-Circle fehlt.

Erleichterung wiederholter Intrakarotis-Injektionen in Mausmodellen durch eine neuartige Reparaturtechnik an der Injektionsstelle

Ziel dieses Protokolls ist es, Forschern eine hochgradig reproduzierbare Technik für intrakranielle Implantationen bereitzustellen.

Stereotaktische intrakranielle Implantation von Glioblastom-Patienten-abgeleiteten Xenograftzelllinien bei Mäusen

Lernen Sie die intrakranielle Kanülenimplantation zur wiederholten lokoregionalen CAR-T-Zell-Therapie bei Mäusen kennen. Diese Methode ermöglicht präklinische Studien zu ZNS-Tumoren ohne mehrfach invasive Eingriffe.

Intrakranielle Kanülenimplantation für serielle lokoregionäre chimäre Antigenrezeptor (CAR) T-Zell-Infusionen in Mäusen

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