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Biology

ऑर्गेनॉइड सह-संस्कृतियों का उपयोग करके एसोफैगल फाइब्रोब्लास्ट ्स का कार्यात्मक लक्षण वर्णन और विज़ुअलाइज़ेशन

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64905
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

Summary

ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृतियां विवो स्टेम सेल आला का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रदान करती हैं। यहां, एसोफेजेल ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृतियों के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। इसके अतिरिक्त, फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनॉइड इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए पूरे माउंट इमेजिंग का उपयोग किया जाता है।

Abstract

उपकला स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं जीवन भर उपकला बाधा के गठन और रखरखाव में योगदान करती हैं। अधिकांश स्टेम और पूर्वज कोशिका आबादी शारीरिक रूप से अलग-अलग स्थानों में छिपी हुई है, जो स्टेमनेस को बनाए रखने वाले आला संकेतों के साथ विशेष बातचीत को सक्षम करती है। जबकि उपकला ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों का विकास होमियोस्टैसिस और बीमारी में स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं की भूमिका को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, आला वातावरण के भीतर बातचीत काफी हद तक अनुपस्थित है, जिससे स्टेम सेल व्यवहार को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान में बाधा उत्पन्न होती है। फाइब्रोब्लास्ट उपकला स्टेम और पूर्वज भाग्य को निर्देशित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां, एसोफेजेल पूर्वज कोशिका नवीकरण और भेदभाव में फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी के चित्रण को सक्षम करने वाला एक व्यापक ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृति प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, अन्नप्रणाली से समानांतर में उपकला कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट दोनों को अलग करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। एसोफैगल पूर्वज कोशिकाओं के साथ-साथ ट्रांसजेनिक रिपोर्टर या जंगली प्रकार के चूहों से फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी दोनों को अलग करने के लिए अलग-अलग प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग रणनीतियों को रेखांकित किया गया है। यह प्रोटोकॉल एक बहुमुखी दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसे विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी के अलगाव को समायोजित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एसोफेजेल एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड मोनो-कल्चर की स्थापना और पासिंग इस प्रोटोकॉल में शामिल है, जो सह-संस्कृति प्रणाली के साथ सीधी तुलना को सक्षम करता है। इसके अलावा, उपकला-फाइब्रोब्लास्ट इंटरैक्शन के विस्तृत छवि विश्लेषण की अनुमति देने वाला एक 3 डी समाशोधन दृष्टिकोण वर्णित है। सामूहिक रूप से, यह प्रोटोकॉल विट्रो में एसोफेजेल स्टेम सेल आला घटकों की पहचान और समझने के लिए एक तुलनात्मक और अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करता है।

Introduction

ऑर्गेनोइड्स का उपयोग स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए 3 डी इन विट्रो परख के रूप में किया जाता है, साथ ही स्टेम सेल आला 1,2,3,4 के सेलुलर घटकों से प्राप्त सिग्नलिंग संकेतों को समझने के लिए। माउस एसोफैगल ऑर्गेनोइड्स को पहली बार 2014 में वर्णित किया गया था और कई पत्रों ने विकास कारकों की पहचान की है, जैसे आर-स्पोंडिन (आरएसपीओ), एनओजीजीआईएन, और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), जो एसोफेजेल ऑर्गेनोइड्स 5,6,7 को बनाए रखने और पारित करने के लिए आवश्यक हैं, यह तर्क देते हुए कि विवो में इसी तरह के सिग्नलिंग संकेतों की आवश्यकता होती है। पूर्वज कोशिका नवीकरण। हालांकि, विकास कारकों को आमतौर पर गैर-शारीरिक सांद्रता में जोड़ा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड विकास की स्थिति होती है जो आवश्यक रूप से विवो सिग्नलिंग वातावरण को प्रतिबिंबित नहीं करती है।

फाइब्रोब्लास्ट विषम स्ट्रोमल सेल आबादी हैं जो कई स्टेम सेल आलामें पूर्वज सेल गुणों का समर्थन करते हैं। एक ही ऑर्गेनॉइड संस्कृति में उपकला पूर्वज कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट का संयोजन बहिर्जात पूरक विकास कारकों की कम सांद्रता में ऑर्गेनोइड गठन को सक्षम बनाता है। आंतों और यकृत एपिथेलिया से ऑर्गेनोइड सह-संस्कृति प्रणालियों का वर्णन किया गया है, लेकिन एसोफेजेल ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल अभी भीउत्कृष्ट 9,10,11 है।

इस प्रोटोकॉल में, एसोफैगस से फाइब्रोब्लास्ट्स के लिए दो फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) रणनीतियों को रेखांकित किया गया है, जिसमें ट्रांसजेनिकपीडीजीएफआर एच 2 बीईजीएफपी चूहों12 या शास्त्रीय एंटीबॉडी धुंधला होने वाले जंगली प्रकार के चूहों का उपयोग किया जाता है। फाइब्रोब्लास्ट्स की विभिन्न उप-आबादी को पसंद के सेल सतह मार्करों का उपयोग करके अलग किया जा सकता है, जिससे प्रोटोकॉल को लचीलापन मिलता है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान को संरक्षित करने वाली 3 डी फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीक का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनोइड इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। ऑर्गेनोइड क्लियरिंग ऑर्गेनोइड्स में प्रकाश प्रवेश गहराई को बढ़ाने के लिए एक त्वरित विधि प्रदान करता है, ऑर्गेनॉइड-फाइब्रोब्लास्ट कनेक्शन के विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार करता है और ऑर्गेनोइड संरचना के पुन: समर्पण को इसकी संपूर्णता में सक्षम करता है। यह प्रोटोकॉल एक संपूर्ण माउंट इमेजिंग रणनीति के साथ एसोफैगल ऑर्गेनॉइड सह-संस्कृति को जोड़ता है, जिससे फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनॉइड इंटरैक्शन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन को सक्षम किया जा सकता है।

Protocol

इस अध्ययन के लिए पशु प्रयोगों को स्टॉकहोम्स नोर्रा द्वारा अनुमोदित किया गया था। यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघ के संघ की सिफारिशों के अनुसार जानवरों को रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखा गया था।

1. तैयारी

  1. बर्फ पर पृथक्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमेटिक स्टॉक समाधानों को पिघलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि कारक कम (जीएफआर) बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स (मैट्रिक्स) का एक एलिकोट पिघलें।
  2. संस्कृति माध्यम तैयार करें। ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों और सह-संस्कृतियों के लिए तालिका 1 में वर्णित माध्यम का उपयोग करें और प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले इसे तैयार करें।

2. एसोफेजेल एपिथेलियम और स्ट्रोमा का विच्छेदन और पृथक्करण

नोट: सुनिश्चित करें कि विच्छेदन और ऊतक प्रसंस्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरण बाँझ हैं। हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में प्रति तीन अन्नप्रणाली में 2 एमएल पृथक्करण समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें।

  1. पसंद के माउस स्ट्रेन का उपयोग करें, जैसे कि C57BL / 6J चूहे। चूहों में एसोफेजेल विकास प्रसवोत्तर दिन (पी) 70 के बाद समाप्त होता है, इसलिए पी 7013 से अधिक उम्र के चूहों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। चार या पांच चूहों का उपयोग करें क्योंकि वे 8-10 ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करते हैं।
    नोट: चूहों की उम्र के साथ ऑर्गेनोइड बनाने की दक्षता कम हो जाती है। यदि विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी रुचि के हैं, तो यह संभव है कि कम फाइब्रोब्लास्ट उपज ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों की संख्या को सीमित कर रही है जिन्हें स्थापित किया जा सकता है।
  2. फाइब्रोब्लास्ट आबादी के अलगाव के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित (जैसे, PdgfrαH2BeGFP) या जंगली-प्रकार (WT) चूहों का उपयोग करें। डब्ल्यूटी चूहों का उपयोग करते समय, एफएसीएस के माध्यम से स्ट्रोमा से विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी को अलग करने के लिए एंटीबॉडी धुंधला करें।
  3. सीओ2 श्वासावरोध द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु करें। बल और विच्छेदन कैंची का उपयोग करके अन्नप्रणाली को विच्छेदित करें। पूरे अन्नप्रणाली को हटाने के लिए, श्वासनली की शुरुआत में सीधे पेट के ऊपर अन्नप्रणाली के बाहर के छोर और समीपस्थ छोर को काटें। एसोफैगस को पीबीएस में डुबोएं और इसे बर्फ पर रखें।
  4. यांत्रिक रूप से एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (8x-40x की कुल आवर्धन सीमा) और फोर्सप्स का उपयोग करके मांसपेशियों को हटा दें। एक जोड़ी बल का उपयोग करके विच्छेदित अन्नप्रणाली के बाहरी छोर को पकड़ें और विच्छेदित अन्नप्रणाली के समीपस्थ छोर तक मांसपेशियों को पकड़ने और खींचने के लिए अन्य बलों का उपयोग करें। मांसपेशियों की परत को हटा दें और छोड़ दें।
  5. अन्नप्रणाली को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें। यह ऊतक क्षति को रोकने के लिए बॉल टिप के साथ माइक्रोडिसेक्शन स्प्रिंग कैंची का उपयोग करके सबसे अच्छा काम करता है। अन्नप्रणाली के लुमेन में वसंत कैंची की गेंद डालने के लिए अन्नप्रणाली के एक छोर को पकड़ें और अंत तक पकड़ते हुए अन्नप्रणाली को काट लें।
  6. अन्नप्रणाली को 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब या 24-वेल प्लेट में रखें। खुले अन्नप्रणाली को 15 मिनट के लिए रॉकर-शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एचबीएसएस में 0.5 मिलीग्राम / एमएल थर्मोलिसिन में इनक्यूबेट करें। अन्नप्रणाली को पूरी तरह से थर्मोलिसिन समाधान में डुबोएं।
    नोट: उपयोग किए गए थर्मोलिसिन समाधान की मात्रा अच्छी तरह या ट्यूब-आकार पर निर्भर करती है। कई एसोफैगी को एक ही कुएं या ट्यूब में रखा और डुबोया जा सकता है।
  7. थर्मोलिसिन घोल से अन्नप्रणाली को बाहर निकालें। एसोफेजेल एपिथेलियम को स्ट्रोमा से सावधानीपूर्वक अलग करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। महीन बल का उपयोग करके, ऊतक के उपकला पक्ष और स्ट्रोमा पक्ष दोनों को पकड़ें और धीरे-धीरे उन्हें दो परतों को अलग करने के लिए अलग-अलग खींचें।
    नोट: स्ट्रोमा को पारदर्शी उपकला के विपरीत, इसकी सफेद और अपारदर्शी उपस्थिति से पहचाना जाता है। स्ट्रोमा में लैमिना प्रोप्रिया और सबम्यूकोसल परत होती है।
  8. उपकला और स्ट्रोमल परत को एचबीएसएस में 200 μL पृथक्करण समाधान के साथ दो अलग-अलग 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। बर्फ पर रखो।

3. एसोफेजेल पूर्वज कोशिकाओं का अलगाव

नोट: एसोफेजेल पूर्वज कोशिकाओं (चरण 2) और फाइब्रोब्लास्ट (चरण 3) का अलगाव एक साथ किया जा सकता है। HBSS (1% FBS) में 1% FBS की 50 mL ट्यूब तैयार करें।

  1. 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (चरण 2.8) से अलग एसोफेजेल एपिथेलियम को एक साफ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और कीमा के लिए एक तेज स्केलपेल का उपयोग करें। पेट्री डिश से कीमा ऊतक को 200 μL पृथक्करण समाधान के साथ इकट्ठा करें और इसे 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें।
    नोट: एपिथेलियम को ठीक से काटा जाता है जब टुकड़ों को 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वापस रखा जा सकता है।
  2. 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल की कुल मात्रा में 800 μL ताजा पृथक्करण समाधान जोड़ें।
    नोट: पृथक्करण समाधान की पर्याप्त मात्रा जोड़ना महत्वपूर्ण है। प्रति एक से तीन अन्नप्रणाली, 1 एमएल समाधान की सिफारिश की जाती है। जब एक बार में अधिक एसोफैगी संसाधित होती है तो स्केल करें।
  3. ट्यूब को 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर-शेकर पर कीमा उपकला परत के साथ रखें। पाचन को बढ़ाने के लिए हर 15 मिनट में 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके घोल को लगभग 20 बार ऊपर और नीचे करें।
  4. 60 मिनट के बाद, पिपेट को 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके 20 बार ऊपर और नीचे करें। समाधान को एक नए 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से पारित करें। सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: फ़िल्टर के लिए कोशिकाओं के पालन को कम करने के लिए कोशिकाओं को तनाव देने से पहले सेल छन्नी को 1% एफबीएस के साथ गीला करें। उपकला पूरी तरह से पच नहीं पाएगी, और ऊतक के टुकड़े अभी भी दिखाई देंगे। हालांकि, लंबे समय तक इनक्यूबेशन से सेल अस्तित्व में कमी आएगी और इसके परिणामस्वरूप व्यवहार्य कोशिकाओं की उच्च उपज नहीं होगी।
  5. 1 एमएल पिपेट के साथ अतिरिक्त तरल को हटाकर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और गोली को 1% एफबीएस के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    1. सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, एसोफेजेल पूर्वज कोशिकाओं के एफएसीएस के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें।
    2. CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) और CD104-A647 (INTEGRIN-a4) के 1 μL को 200° L में प्रति दस लाख कोशिकाओं पर 1% FBS के मिश्रण में मिलाएं।
      नोट: एंटीबॉडी का 1 μL (200 μL अंतिम मात्रा) एक या दो एसोफैगी के लिए पर्याप्त है। एक बार में अधिक एसोफैगी संसाधित करते समय, एंटीबॉडी धुंधला समाधान की मात्रा बढ़ाएं।
  6. एंटीबॉडी मिश्रण के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और एक प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी जोड़ने के बाद, सिग्नल के विरंजन से बचने के लिए सेल निलंबन को अंधेरे में रखें। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 1% FBS के 3 mL और 4 °C पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें, और फिर कोशिकाओं को FBS के 1% के न्यूनतम 200 μL में पुन: निलंबित करें।
    नोट: 1% एफबीएस के 500 μL का उपयोग चार या पांच एसोफैगी तक के लिए किया जाता है। एक बार में अधिक एसोफैगी संसाधित होने पर मात्रा बढ़ाएं, ताकि 100-300 घटनाओं / सेकंड की एफएसीएस प्रवाह दर प्राप्त की जा सके। अधिक घटनाओं से छंटाई दक्षता में कमी आएगी, और प्रवाह दर में वृद्धि सेल अस्तित्व को कम कर देगी।
  7. जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए एफएसीएस सॉर्टिंग से 5 मिनट पहले 1: 10,000 की अंतिम एकाग्रता में मृत सेल स्टेन मार्कर जोड़ें। एफएसीएस मशीन का उपयोग करके पूर्वज कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें (गेटिंग रणनीति के लिए चित्रा 1 देखें)। कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एकत्र करें जो मूल ऑर्गेनॉइड माध्यम के 200 μL से भरे हुए हैं (तालिका 1)।

4. स्ट्रोमल परत से फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव

  1. विच्छेदन कैंची का उपयोग करके 200 μL पृथक्करण समाधान (चरण 2.8) युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में स्टोमल परत को महीन टुकड़ों में काटें। एक बार जब समाधान को 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके ऊपर और नीचे पाइप किया जा सकता है तो ऊतक को ठीक से कीमा किया जाता है।
  2. 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल की कुल मात्रा में 800 μL ताजा पृथक्करण समाधान जोड़ें।
    नोट: पृथक्करण समाधान की पर्याप्त मात्रा जोड़ना महत्वपूर्ण है। प्रति एक से तीन अन्नप्रणाली, 1 एमएल समाधान की सिफारिश की जाती है। जब एक बार में अधिक एसोफैगी संसाधित होती है तो स्केल करें।
  3. ट्यूब को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर-शेकर पर रखें। 15 मिनट के बाद, पाचन को बढ़ाने के लिए 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके घोल को लगभग 20 बार ऊपर और नीचे करें।
  4. एंजाइमेटिक पाचन के 30 मिनट के बाद, पिपेट को 200 μL पिपेट टिप का उपयोग करके 20 बार ऊपर और नीचे करें। एक नए 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से घोल को छान लें। सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: फिल्टर के लिए कोशिकाओं के पालन को कम करने के लिए कोशिकाओं को तनाव देने से पहले सेल छन्नी को 1% एफबीएस के साथ गीला करें।
  5. 1 एमएल पिपेट के साथ अतिरिक्त तरल को हटाकर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और गोली को 1% एफबीएस के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूज 300 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस स्ट्रेन का उपयोग करते समय जिसमें फ्लोरेसेंट-लेबल फाइब्रोब्लास्ट एंटीबॉडी स्टेनिंग होते हैं, वैकल्पिक होते हैं। यदि एंटीबॉडी धुंधला होने की आवश्यकता नहीं है, तो चरण 3.7 के साथ जारी रखें और नमूने को फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    1. सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, फाइब्रोब्लास्ट के एफएसीएस अलगाव के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। प्रति दस लाख कोशिकाओं में 1% एफबीएस के 200 μL में CD26-APC (DPP4) के 1 μL मिलाएं।
      नोट: एंटीबॉडी का 1 μL एक या दो एसोफैगी के लिए पर्याप्त है। एक बार में अधिक एसोफैगी संसाधित करते समय, एंटीबॉडी धुंधला समाधान की मात्रा बढ़ाएं।
  6. 1% एफबीएस में संयुग्मित एंटीबॉडी मिश्रण के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें और एक प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. 1% FBS का 3 mL जोड़ें और 4 °C पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। कोशिकाओं को एफबीएस के 1% के न्यूनतम 200 μL में पुन: निलंबित करें।
    नोट: 1% एफबीएस के 500 μL का उपयोग चार या पांच एसोफैगी तक के लिए किया जाता है। एक बार में अधिक एसोफैगी संसाधित होने पर मात्रा बढ़ाएं, ताकि 100-300 घटनाओं / सेकंड की प्रवाह दर प्राप्त की जा सके। अधिक घटनाओं से छंटाई दक्षता कम हो जाएगी, और प्रवाह दर बढ़ने से सेल अस्तित्व में कमी आएगी। फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी जोड़ने के बाद, सिग्नल के विरंजन से बचने के लिए सेल सस्पेंशन को अंधेरा रखा जाना चाहिए।
  8. जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए एफएसीएस सॉर्टिंग से 5 मिनट पहले 1: 10,000 की अंतिम एकाग्रता में मृत सेल स्टेन मार्कर जोड़ें। एफएसीएस मशीन का उपयोग करके कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें (गेटिंग रणनीति के लिए चित्रा 1 देखें)। कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एकत्र करें जो मूल ऑर्गेनॉइड माध्यम के 200 μL से भरे हुए हैं (तालिका 1)।

5. एसोफेजेल ऑर्गेनोइड्स की स्थापना और संस्कृति

नोट: प्रीवार्म ईआरलो (ऑर्गेनॉइड को-कल्चर), ईएनआर (ऑर्गेनॉइड) माध्यम (विवरण के लिए तालिका 1 देखें), और 37 डिग्री सेल्सियस पर 48-वेल प्लेट। पिघले हुए मैट्रिक्स (चरण 1 में तैयार) को बर्फ पर रखें। माउस एसोफैगल ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए यहां प्रदान किए गए मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि मैट्रिक्स के अन्य ब्रांड ऑर्गेनोइड बनाने की दक्षता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं।

  1. ऑर्गेनॉइड सह-संस्कृति के लिए, एक ट्यूब में 1: 2 के अनुपात में क्रमबद्ध उपकला कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को मिलाएं। प्रत्येक मैट्रिक्स गुंबद के लिए, 5,000 उपकला कोशिकाओं और 10,000 फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करें। अधिक गुंबदों की तैयारी करते समय, एक ट्यूब में 5,000 उपकला कोशिकाओं और 10,000 फाइब्रोब्लास्ट का एक गुणक जोड़ें। फाइब्रोब्लास्ट के बिना ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के लिए, प्रति मैट्रिक्स गुंबद में 5,000 उपकला कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. मिश्रित कोशिका आबादी को 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक 200 μL पिपेट के साथ हटाकर छोड़ दें।
  3. 5 मिनट के लिए ठंडे मूल ऑर्गेनॉइड माध्यम और सेंट्रीफ्यूज में गोली को फिर से निलंबित करके कोशिकाओं को एक बार धो लें। कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
  4. 80% मैट्रिक्स और 20% ठंडे मूल ऑर्गेनोइड माध्यम से युक्त एक मिश्रण तैयार करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर मैट्रिक्स जमने के रूप में बर्फ पर सब कुछ रखें।
  5. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सुपरनैटेंट को 200 μL पिपेट के साथ सावधानीपूर्वक हटाकर छोड़ दें। कोशिकाओं को मैट्रिक्स मिश्रण/गुंबद के 10 μL में पुन: निलंबित करें और बर्फ पर वापस रखें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से प्रीवार्ड 48-वेल प्लेट लें और 20 μL पिपेट का उपयोग करके प्रति कुएं एक मैट्रिक्स गुंबद बनाएं। प्रत्येक गुंबद में 80% मैट्रिक्स के 10 μL, 5,000 उपकला कोशिका, और 10,000 फाइब्रोब्लास्ट होते हैं। प्लेट को एक इनक्यूबेटर में उल्टा स्थानांतरित करें और गुंबदों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए जमने दें।
    नोट: मैट्रिक्स गुंबद की मात्रा में कमी और / या सेल संख्या में वृद्धि ऑर्गेनोइड बनाने की दक्षता को प्रभावित करेगी।
  7. केवल उपकला ऑर्गेनोइड वाले संबंधित मैट्रिक्स गुंबदों में ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों और ईएनआर माध्यम (तालिका 1) वाले मैट्रिक्स गुंबदों में 200 μL प्रीवार्मेड ईआरनिम्न माध्यम (तालिका 1) जोड़ें और प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें।
  8. ऑर्गेनोइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर उगाएं। पहले 2 दिनों के लिए, माध्यम को 10 μM रॉक-अवरोधक (Y-27623) के साथ पूरक करें। रॉक अवरोधक तनाव प्रेरित कोशिका मृत्यु को रोकता है और ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की सफल स्थापना की संभावना को बढ़ाता है।
  9. माध्यम को हर 2-3 दिनों में ताज़ा करें। सुनिश्चित करें कि तापमान संवेदनशील मैट्रिक्स के पृथक्करण को रोकने के लिए माध्यम गर्म है।
  10. चढ़ाना के 6 से 8 दिनों बाद प्रयोग का विश्लेषण करें। ऑर्गेनोइड्स को 14 दिनों तक संस्कृति में रखा जा सकता है। 14 वें दिन के आसपास, गुंबद अखंडता का नुकसान देखा जाता है।

6. ऑर्गेनोइड्स को पास करना

नोट: सह-संस्कृति में उगाए गए ऑर्गेनोइड्स के पासिंग के परिणामस्वरूप फाइब्रोब्लास्ट का नुकसान होता है। इसलिए, पारित होने पर सभी ऑर्गेनोइड्स के लिए ईएनआर माध्यम का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। प्रीवार्म ईएनआर, पीबीएस, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 48-वेल प्लेट।

  1. मध्यम को हटा दें और मैट्रिक्स गुंबद वाले कुएं को पूर्व-गर्म पीबीएस के साथ धो लें। मैट्रिक्स गुंबद को तोड़ने के लिए 200 μL ठंडा 0.25% ट्रिप्सिन घोल और पिपेट ऊपर और नीचे जोड़ें।
    नोट: ठंडे 0.25% ट्रिप्सिन के उपयोग की सिफारिश की जाती है, क्योंकि मैट्रिक्स तापमान संवेदनशील है और यह मैट्रिक्स गुंबदों को तोड़ने में सहायता करता है।
  2. ~ 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिन के साथ ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें। ऑर्गेनोइड्स के पृथक्करण को बढ़ाने के लिए 10 मिनट के बाद पिपेट ऊपर और नीचे करें। हर 5-10 मिनट में माइक्रोस्कोप के साथ पृथक्करण प्रक्रिया की निगरानी करें। चूंकि ट्रिप्सिन सेल व्यवहार्यता को कम करता है, इसलिए यह आदर्श पृथक्करण समय की पहचान करने में मदद कर सकता है।
  3. 20 मिनट के बाद, ऑर्गेनोइड्स को अलग करने के लिए 200 μL पिपेट के साथ ऑर्गेनोइड्स को ऊपर और नीचे करें। कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें, 1 एमएल बेसिक ऑर्गेनॉइड माध्यम जोड़ें, और आरटी में 5 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. वैकल्पिक: सर्वोत्तम ऑर्गेनोइड विकास की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए और यह कि नए ऑर्गेनोइड एकल कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं, कोशिकाओं को पूर्व-गीले 40 μm सेल स्ट्रेनर के माध्यम से तनाव दें। सेल निलंबन को फ़िल्टर करने से ऑर्गेनॉइड कोर और सेल क्लंप को हटा दिया जाता है जो विघटित करना मुश्किल होता है।
  5. 80% मैट्रिक्स और 20% ठंडे मूल ऑर्गेनोइड माध्यम से युक्त एक मैट्रिक्स मिश्रण तैयार करें। सब कुछ बर्फ पर रखें, क्योंकि मैट्रिक्स आरटी पर जम जाता है।
  6. सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक 200 μL पिपेट के साथ हटाकर छोड़ दें, कोशिकाओं को मैट्रिक्स मिश्रण / गुंबद के 10 μL में पुन: निलंबित करें, और मिश्रण को बर्फ पर वापस रखें।
    नोट: गुंबद घनत्व के आधार पर ऑर्गेनोइड्स को 1: 5 से 1: 10 अनुपात में विभाजित किया जा सकता है। उपकला कोशिकाओं को 5,000 कोशिकाओं / गुंबद पर गिना और फिर से चढ़ाया जा सकता है।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से 48-वेल प्लेट लें और प्रति अच्छी तरह से एक गुंबद बनाएं। प्लेट को एक इनक्यूबेटर में उल्टा स्थानांतरित करें और गुंबदों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए जमने दें।
  8. संबंधित ऑर्गेनॉइड गुंबदों में 200 μL पूर्ववाधित ENR माध्यम जोड़ें। पहले 2 दिनों के लिए 10 μM रॉक-इनहिबिटर (Y-27623) के साथ माध्यम को पूरक करें।
  9. माध्यम को हर 2-3 दिनों में ताज़ा करें। सुनिश्चित करें कि तापमान संवेदनशील मैट्रिक्स के पृथक्करण को रोकने के लिए माध्यम गर्म है।

7. पूरे माउंट स्टेनिंग के लिए ऑर्गेनॉइड प्रसंस्करण

नोट: प्लास्टिक का पालन करने वाले ऑर्गेनोइड्स से बचने के लिए उपयोग करने से पहले पीबीएस में 10% एफबीएस के साथ युक्तियों और ट्यूबों को कोट करें। पिपेट युक्तियों के लिए, टिप का उपयोग करने से पहले 10% एफबीएस / पीबीएस समाधान में एक या दो बार ऊपर और नीचे पिपेट करना पर्याप्त है। ट्यूबों के लिए, ट्यूब को 10% एफबीएस / पीबीएस के साथ भरें और फिर समाधान को हटा दें।

  1. ऑर्गेनॉइड माध्यम को हटा दें और मैट्रिक्स गुंबदों में बर्फ-ठंडा पीबीएस के 200 μL जोड़ें। प्लेट को 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  2. पिपेट को ऊपर और नीचे करें और घोल को 0.6 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज गैर-अनुगामी ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 100 x g पर 30-60 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज जल्द ही ऑर्गेनोइड्स को नीचे में बसने दें।
    नोट: अतिरिक्त पिपेटिंग और लंबे सेंट्रीफ्यूजेशन ऑर्गेनोइड्स को तोड़ देते हैं और फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनोइड इंटरैक्शन को बाधित करते हैं।
  3. अतिरिक्त तरल निकालें और बर्फ ठंडा पीबीएस जोड़ें। 100 x g पर 30-60 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज जल्द ही ऑर्गेनोइड्स को नीचे में बसने दें।
  4. अतिरिक्त तरल निकालें और बर्फ पर 30 मिनट के लिए पीबीएस घोल में 200 μL ठंडे 4% फॉर्मलाडेहाइड के साथ ऑर्गेनॉइड को ठीक करें।
    चेतावनी: फॉर्मलाडेहाइड विषाक्त है और हमेशा रासायनिक फ्यूम हुड में उपयोग किया जाना चाहिए। नाइट्रिल दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और लैब कोट हमेशा पहने जाने चाहिए।
  5. ऑर्गनॉइड का निर्धारण उन्हें डूबने का कारण बनता है, और सेंट्रीफ्यूजेशन की अब आवश्यकता नहीं होती है। ट्यूब को सीधा रखकर ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें और 2-3 मिनट प्रतीक्षा करें, फॉर्मलाडेहाइड को हटा दें, और फॉर्मलाडेहाइड को धोने के लिए 500 μL ठंडा पीबीएस जोड़ें।
  6. ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें, अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें, और ताजा ठंडा पीबीएस के 500 μL जोड़ें। ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें, अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें, और ब्लॉकिंग बफर के 500 μL जोड़ें (पीबीएस में 5% सामान्य गधे सीरम, 1% बीएसए, और 0.5% ट्राइटन एक्स -100)। ट्यूब को आरटी पर 60 मिनट के लिए रॉकर-शेकर पर रखें।
    नोट: ब्लॉकिंग 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (ओ / एन) भी की जा सकती है।
  7. ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें, ब्लॉकिंग बफर को हटा दें, और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ बफर को अवरुद्ध करने के 200 μL में ऑर्गेनोइड्स को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। ऑर्गेनोइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकर-शेकर ओ / एन पर रखें।
    नोट: परमाणु प्रोटीन, कम व्यक्त प्रोटीन, या एंटीबॉडी के धुंधलापन में सुधार करने के लिए, जो अस्पष्ट धुंधलापन दिखाते हैं, इनक्यूबेशन समय को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 या 2 दिनों के लिए बढ़ाया जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स को एक रॉकर-शेकर पर रखना आवश्यक है क्योंकि यह ऑर्गेनोइड्स को एक साथ झुरमुट से रोकता है और धुंधला दक्षता बढ़ाता है।
  8. ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें, प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण को हटा दें, और आरटी पर 60 मिनट के लिए पीबीएस (0.02% टीएक्स) में 0.02% ट्राइटन एक्स -100 के 500 μL का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स को धोएं।
    नोट: जब लंबे समय तक प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस ओ / एन में 0.02% टीएक्स के साथ एक धोने का चरण जोड़ें।
  9. ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें, वॉशिंग बफर को हटा दें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर ओ / एन को अवरुद्ध करने में प्रतिदीप्ति-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के 200 μL जोड़ें। फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ने के बाद, सिग्नल के विरंजन से बचने के लिए ऑर्गेनोइड्स को अंधेरे में रखें।
  10. ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें, द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण को हटा दें, और आरटी पर 60 मिनट के लिए 0.02% टीएक्स के 500 μL का उपयोग करके ऑर्गेनोइड्स को धोएं।
  11. यदि आवश्यक हो तो परमाणु धुंधला करने के लिए 200 μL DAPI (0.25 μg / mL) समाधान के साथ ऑर्गेनोइड्स को काउंटरस्टेन करें। एक रॉकर-शेकर पर आरटी में 60 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  12. ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें, DAPI घोल को हटा दें, और RT पर 15 मिनट के लिए PBS के 500 μL में ऑर्गेनोइड्स को धोएं।
  13. ऑर्गेनोइड्स को डूबने दें और सभी अतिरिक्त तरल को हटा दें। ऑर्गेनोइड्स में क्लियरिंग सॉल्यूशन का 10 μL जोड़ें और RT पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: समाशोधन समाधान चिपचिपा है, इसलिए समाशोधन समाधान को पाइप करने से पहले 20 μL पिपेट टिप के बाहरी हिस्से को काट दें। यदि इमेजिंग के लिए एक बड़े स्पेसर का उपयोग किया जाता है तो अधिक समाशोधन समाधान जोड़ा जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स को साफ़ नहीं करते समय क्लियरिंग समाधान के बजाय माउंटिंग समाधान का उपयोग किया जा सकता है। समाशोधन समाधान इमेजिंग करते समय पृष्ठभूमि को कम करता है और इमेजिंग गहराई को बढ़ाता है।
  14. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 0.05 मिमी डबल-साइडेड चिपचिपा 4-वेल स्पेसर रखें। एक कुएं में ऑर्गेनोइड्स के साथ क्लियरिंग समाधान का 10 μL जोड़ें और स्पेसर के शीर्ष पर एक कवर स्लिप रखें।
    नोट: ऑर्गेनोइड्स को स्पेसर के उपयोग के बिना भी लगाया जा सकता है। स्पेसर ऑर्गेनोइड आकार को बरकरार रखता है और ऑर्गेनोइड्स को चपटा होने से रोकता है।
  15. ऑर्गेनोइड्स को साफ़ करने के लिए आरटी ओ / एन पर स्लाइड रखें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करके छवियां प्राप्त करें।

Representative Results

अन्नप्रणाली को विभिन्न परतों में विभाजित किया गया है: एपिथेलियम, लैमिना प्रोप्रिया, सबम्यूकोसा, और मस्कुलरिस एक्सटर्ना (चित्रा 1 ए)। फाइब्रोब्लास्ट सबम्यूकोसा और लैमिना प्रोप्रिया के भीतर रहते हैं, जिन्हें स्ट्रोमा कहा जाता है। इस प्रोटोकॉल में, मांसपेशियों को यांत्रिक रूप से हटा दिया जाता है (चित्रा 1 बी), जिससे स्ट्रोमा (चित्रा 1 सी) में रहने वाले फाइब्रोब्लास्ट (पीडीजीएफआर एच 2 बी जीएफपी +) का नुकसान नहीं होता है। पृथक्करण से पहले, उपकला को स्ट्रोमा से अलग किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप दो ऊतक खंड होते हैं (चित्रा 1 बी)। दो परतों को अलग करने से नाजुक स्ट्रोमल परत की तुलना में अधिक मजबूत उपकला परत के लिए पृथक्करण समय बढ़ाने का अवसर मिलता है। इस तरह, एक कुशल अलगाव प्रोटोकॉल स्थापित किया जाता है जो व्यवहार्य उपकला पूर्वज कोशिकाओं के साथ-साथ स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट दोनों को उत्पन्न करता है (चित्रा 1 बी)। एसोफेजेल पूर्वज कोशिकाओं को उनके उच्च इंटीग्रिन-ए 4 और ई-कैडरिन अभिव्यक्ति (चित्रा 1 सी, डी) के आधार पर क्रमबद्ध किया जाता है।

फाइब्रोब्लास्ट की उप-आबादी को अलग-अलग मार्करों का उपयोग करके अलग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले फाइब्रोब्लास्ट मार्कर पीडीजीएफआर और डीपीपी 4 (सीडी 26) के आधार पर फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के लिए एक रणनीति प्रदान की जाती है। या तो PdgfréH2BeGFP रिपोर्टर अभिव्यक्ति या DPP4 एंटीबॉडी द्वारा अलगाव से पता चलता है कि लगभग 50% पृथक कोशिकाएं फाइब्रोब्लास्ट हैं (चित्रा 1 ई, एफ)। इसके अतिरिक्त, पीडीजीएफआर + फाइब्रोब्लास्ट का 70% डीपीपी 4 + है, यह दर्शाता है कि काफी हद तक अतिव्यापी, लेकिन समान नहीं, फाइब्रोब्लास्ट आबादी प्राप्त होती है। उपकला और स्ट्रोमल सेल आबादी दोनों को अलग करने के बाद, एसोफेजेल पूर्वज कोशिकाओं को या तो अकेले सुसंस्कृत किया जाता है या मैट्रिक्स गुंबद में फाइब्रोब्लास्ट के साथ मिलकर। ऑर्गेनॉइड गठन के लिए फाइब्रोब्लास्ट के योगदान का अध्ययन करने के लिए, सह-संस्कृति को विकास कारक कम माध्यम (चित्रा 1 जी) में बनाए रखा जाता है।

एसोफेजेल पूर्वज कोशिकाएं ईजीएफ, एनओजीआईएन और आरएसपीओ (ईएनआर) की उपस्थिति में ऑर्गेनोइड बनाती हैं। NOGGIN को हटाना और RSPO की मात्रा को कम करना (25 ng / ईआरकम) ऑर्गेनोइड गठन को रोकने के लिए पर्याप्त है (चित्रा 2 ए)। दिलचस्प बात यह है कि ईआरकम माध्यम में एसोफेजेल पूर्वज कोशिकाओं में डीपीपी 4 + या पीडीजीएफआर + फाइब्रोब्लास्ट जोड़ने से ऑर्गेनोइड बनाने की क्षमता बहाल हो जाती है, जो दोनों फाइब्रोब्लास्ट आबादी (चित्रा 2 ए-डी) के लिए एक सहायक कार्य का प्रदर्शन करती है। PdgfréH2BeGFP ट्रांसजीन के विज़ुअलाइज़ेशन से पता चलता है कि फाइब्रोब्लास्ट ऑर्गेनोइड गठन के दौरान उपकला पूर्वज कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क में हैं (चित्रा 2 ए)। दिन 6 पर, PdgfréH2BeGFP + फाइब्रोब्लास्ट अभी भी सह-संस्कृति में प्रचुर मात्रा में मौजूद हैं। फाइब्रोब्लास्ट पूरे गुंबद में मौजूद होते हैं, ऑर्गेनोइड्स (पूर्ण तीर) के पास और स्पर्श करते हैं, या ऑर्गेनोइड्स (तीर) से जुड़े होते हैं; चित्र 2 डी)।

पूरे माउंट धुंधलापन ऑर्गेनोइड्स के साथ फाइब्रोब्लास्ट की बातचीत का 3 डी प्रतिनिधित्व दिखाता है (चित्रा 3)। हालांकि समाशोधन समाधान के उपयोग के बिना पूरे माउंट प्रोटोकॉल को निष्पादित करना संभव है, यह ऑर्गेनॉइड (चित्रा 3 बी, जेड-व्यू) की पारदर्शिता और लेजर प्रवेश को कम करता है। ऑर्गेनोइड्स को माउंट करते समय, स्पेसर ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान को बनाए रखने में मदद करता है। इसके विपरीत, कवरस्लिप को सीधे ऑर्गेनोइड्स (स्पेसर के बिना) पर चढ़ाना ऑर्गेनोइड्स को समतल करता है और इसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड संरचना का नुकसान होता है (चित्रा 3 ए, बी)।

दोनों डीपीपी 4 + और पीडीजीएफआर + फाइब्रोब्लास्ट ऑर्गेनोइड्स (चित्रा 3 सी, वीडियो 1 और वीडियो 2) के चारों ओर लिपटे हुए पाए जाते हैं। एसोफेजेल ऑर्गेनोइड्स के भेदभाव का मूल्यांकन विभिन्न मार्करों का उपयोग करके किया जा सकता है। चित्रा 4 से पता चलता है कि प्रदान किया गया धुंधला प्रोटोकॉल आसान-से-दाग केराटिन (केआरटी 14/13) के साथ-साथ अधिक कठिन-से-दाग प्रतिलेखन कारकों (टीआरपी 63 / केएलएफ 4) के लिए उपयुक्त है। सह-संस्कृति प्रोटोकॉल एक समान भेदभाव पैटर्न के साथ ऑर्गेनोइड उत्पन्न करता है, जैसा कि विवो13,14 में दिखाया गया है और जैसा कि ईएनआर माध्यम में उगाए गए ऑर्गेनोइड्स में देखा गया है; KRT14+ या TRP63+ पूर्वज कोशिकाएं बाहरी परत बनाती हैं और KRT13+ या KLF4+ विभेदित कोशिकाएं अंदर की ओर उन्मुख होती हैं।

यह प्रोटोकॉल इन विट्रो में एसोफेजेल स्टेम सेल आला का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है और ऑर्गेनोइड्स और फाइब्रोब्लास्ट के बीच बातचीत की कल्पना करता है। एंटीबॉडी का उपयोग करके फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल को लागू करके, विधि अनुकूलनीय है और इसका उपयोग ट्रांसजेनिक चूहों की आवश्यकता के बिना फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: अन्नप्रणाली से पूर्वज कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट उप-आबादी का अलगाव। (ए) अन्नप्रणाली में विभिन्न परतों का योजनाबद्ध अवलोकन। स्ट्रोमा में लैमिना प्रोप्रिया और सबम्यूकोसा होता है। (बी) अलगाव प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। मांसपेशियों (मांसपेशियों का एक्सटर्ना) को यांत्रिक रूप से फोर्सप्स का उपयोग करके हटा दिया जाता है; शेष अन्नप्रणाली को स्ट्रोमा से उपकला परत को अलग करने के लिए थर्मोलिसिन में काटा और इनक्यूबेट किया जाता है। एपिथेलियम और स्ट्रोमा को अलग किया जाता है, यांत्रिक रूप से कीमा किया जाता है, और एंजाइमेटिक रूप से एकल सेल निलंबन में पचाया जाता है। अलग-थलग कोशिकाओं को तब दाग दिया जाता है और एफएसीएस के लिए तैयार किया जाता है। (सी) अन्नप्रणाली के क्रॉस सेक्शन को मांसपेशियों से हटा दिया जाता है जो स्ट्रोमा में पीडीजीएफआरएच 2 बी जीएफपी + फाइब्रोब्लास्ट दिखाता है। इंटीग्रिन-ए4 (आईटीजी4) और ई-कैडरिन (ईसीएडी) डबल पॉजिटिव कोशिकाएं अन्नप्रणाली के उपकला पूर्वज कोशिकाएं हैं। स्केल बार = 100 μm. (D) उपकला कोशिका अलगाव का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट सभी एकल कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं (ऊपरी पैनल) के प्रतिशत को दर्शाता है। निचला पैनल सभी जीवित कोशिकाओं से पृथक आईटीजी4 + ईसीएडी + पूर्वज (प्रोग) कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है। (ई) स्ट्रोमल सेल अलगाव का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट जीवित कोशिकाओं (ऊपरी बाएं पैनल) के प्रतिशत को दर्शाता है। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट सभी जीवित कोशिकाओं के पृथक डीपीपी 4 + फाइब्रोब्लास्ट (फाइबर; ऊपरी दाएं पैनल) और पीडीजीफ्र + फाइब्रोब्लास्ट (निचले बाएं पैनल) के प्रतिशत को दर्शाते हैं। पीडीजीफ्राइबोब्लास्ट्स का 70% डीपीपी 4 + (निचला दाहिना पैनल) भी हैं। (एफ) स्ट्रोमा का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट डीपीपी 4 + केवल कोशिकाओं (2.5%), डीपीपी 4 + पीडीजीएफआर + कोशिकाओं (37.5%), और पीडीजीएफआर + केवल कोशिकाओं (17.7%) को दर्शाता है। प्रतिशत सभी जीवित कोशिकाओं के हैं। (छ) उपकला कोशिकाओं को मैट्रिक्स गुंबद में 50 एनजी/एएल ईजीएफ, 100 एनजी/एएल एनओजीजीआईएन, और 250 एनजी/एसएल आरएसपीओ (ईएनआर) की उपस्थिति में या ईजीएफ की उपस्थिति में फाइब्रोब्लास्ट्स के साथ और आरएसपीओ (25 एनजी/एसएल) की कम सांद्रता में चढ़ाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों के प्रतिनिधि परिणाम। (A) ब्राइटफील्ड छवियां दिन 1 से दिन 6 तक ऑर्गेनोइड्स की वृद्धि दिखाती हैं। पीडीजीएफआरएच 2बीजीएफपी + फाइब्रोब्लास्ट के साथ सह-संवर्धित ऑर्गेनोइड्स के साथ उज्ज्वल क्षेत्र छवियां परमाणु ईजीएफपी सिग्नल भी दिखाती हैं। स्केल बार = 25 μm. (B) दिन 6 पर पूरे मैट्रिक्स गुंबद की ब्राइटफील्ड छवियां। बाएं कॉलम में ईआर कम या ईकमआरनिम्न माध्यम में पीडीजीएफआर + फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति में उगाए गए ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियोंको दिखाया गया है। मध्य स्तंभ ईआर कम या ईकमआरनिम्न माध्यम में डीपीपी 4 + फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति में उगाए गए ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियोंको दर्शाता है। दायां स्तंभ ईएनआर माध्यम में उगाए गए ऑर्गेनोइड मोनो-कल्चर को दर्शाता है। ENR माध्यम = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL), और RSPO (250 ng/μL)। ईआरकम = ईजीएफ और 25 एनजी / ईलोआरलो = 5 एनजी /L EGF और 25 ng/μL RSPO। स्केल बार = 500 μm. (C) ग्राफ ़ ऑर्गेनॉइड बनाने की दक्षता (%) को दर्शाता है (यानी, विभिन्न संस्कृति स्थितियों में ऑर्गेनोइड बनाने वाली कोशिकाओं का प्रतिशत)। प्रत्येक बिंदु एक मैट्रिक्स गुंबद का प्रतिनिधित्व करता है और पट्टी प्रति स्थिति सभी डॉट्स के औसत का प्रतिनिधित्व करती है। (डी) दिन 6 ऑर्गेनोइड्स की ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट छवि को पीडीजीएफआरएच 2 बी जीएफपी + फाइब्रोब्लास्ट के साथ सह-संवर्धित किया गया है। Pdgfr_H2BeGFP + फाइब्रोब्लास्ट पूरे गुंबद में मौजूद होते हैं, ऑर्गेनोइड्स (तीर) से जुड़े होते हैं, और असंबद्ध लेकिन ऑर्गेनोइड्स (पूर्ण तीर) के संपर्क में होते हैं। स्केल पट्टी = 250 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनॉइड इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए पूरे माउंट स्टेनिंग प्रोटोकॉल। एबी = एंटीबॉडी। (बी) स्पष्ट किए गए ऑर्गेनोइड्स की तुलना में लेजर प्रकाश की कम पारदर्शिता और प्रवेश को दर्शाते हुए अस्पष्ट पूरे माउंट स्टेनिंग की इम्यूनोफ्लोरेसेंस तस्वीर। स्पेसर की अनुपस्थिति के परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड का चपटापन और ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान में हानि होती है। (सी) सह-सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स की पूरी माउंट छवियां ऑर्गेनोइड्स की 3 डी सतहों को विमेंटिन + फाइब्रोब्लास्ट्स (फाइबर) के साथ लपेटा हुआ और ऑर्गेनोइड के साथ निकट संपर्क में दिखाती हैं। 3 डी क्रॉस सेक्शन और 2 डी प्लेन छवियां ऑर्गेनॉइड के लुमेन को दिखाती हैं। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: पूरे माउंट चित्र अलग-अलग बेसल और सुपरबेसल सेल आबादी को प्रकट करते हैं। (A) PdgfréH2BeGPP + फाइब्रोब्लास्ट के साथ मोनो- और सह-सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स का पूरा माउंट धुंधला होना बाहरी परत में KRT14+ बेसल कोशिकाओं और KRT13+ विभेदित सुप्राबेसल कोशिकाओं को दर्शाता है। स्केल बार = 50 μm. (बी) बाहरी परत में टीआरपी 63+ बेसल कोशिकाओं और केएलएफ 4 + विभेदित सुप्राबेसल कोशिकाओं को दर्शाने वालेपीडीजीएफआर एच 2 बी जीएफपी + फाइब्रोब्लास्ट के साथ मोनो- और सह-सुसंस्कृत ऑर्गेनोइड्स का पूरा माउंट धुंधला होना। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तालिका 1: ऑर्गेनॉइड संस्कृति मीडिया घटकों का वर्णन करने वाली तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: PdgfréH2BeGFP + फाइब्रोब्लास्ट चारों ओर लपेटा गया और ऑर्गेनॉइड के साथ निकट संपर्क में। वीडियो चित्रा 3 सी के ऊपरी पैनल के साथ है। चित्रा 3 सी में स्केल बार 50 μm है, और ऑर्गेनॉइड व्यास में ~ 120 μm है। विमेंटिन को सफेद में, ई-कैडरिन को लाल रंग में, पीडीजीएफआरएच 2 बीईजीएफपी को हरे रंग में और डीएपीआई को नीले रंग में दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: डीपीपी 4 + फाइब्रोब्लास्ट चारों ओर लपेटा गया और ऑर्गेनोइड के साथ निकट संपर्क में। वीडियो चित्रा 3 सी के निचले पैनल के साथ है। चित्रा 3 सी में स्केल बार 50 μm है, और ऑर्गेनॉइड व्यास में ~ 120 μm है। विमेंटिन को सफेद, ई-कैडरिन को लाल और डीएपीआई को नीले रंग में दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल कार्यात्मक एसोफेजेल एपिथेलियल-फाइब्रोब्लास्ट इंटरैक्शन की जांच के लिए एक इन विट्रो मॉडल स्थापित करता है।

उपकला परत को स्ट्रोमा से अलग किया जाता है, जिससे उपकला और स्ट्रोमल डिब्बे दोनों के लिए एक अनुकूलित पृथक्करण प्रोटोकॉल की अनुमति मिलती है। उपकला पृथक्करण प्रोटोकॉल के अनुकूलन के बावजूद, ऊतक झुरमुट स्पष्ट रहते हैं। हर 15 मिनट में जोर से ऊपर और नीचे पाइपिंग करने से झुरमुट की संख्या और आकार काफी हद तक कम हो जाता है। अन्य प्रोटोकॉल एपिथेलियल परत 5,6 को और अलग करने के लिए ट्रिप्सिन का उपयोग करते हैं। यहां, ट्रिप्सिन का उपयोग, या पृथक्करण समय को और बढ़ाना, अनुशंसित नहीं है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप उपकला कोशिका व्यवहार्यता और ऑर्गेनोइड बनाने की दक्षता में कमी आती है। एपिथेलियम के विपरीत, स्ट्रोमा आसानी से अलग हो जाता है, और पृथक्करण समाधान में 30 मिनट के परिणामस्वरूप ~ 90% फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता (चित्रा 1 ई) के साथ एकल-कोशिका निलंबन होता है। प्रोटोकॉल में उपकला-स्टोमल पृथक्करण चरण को छोड़कर पृथक्करण समय काफी बढ़ जाता है, जिसके परिणामस्वरूप फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता में कमी आती है और उपकला कोशिकाओं की कम उपज होती है। इसके अतिरिक्त, स्ट्रोमा से उपकला को अलग करना प्रत्येक आबादी की सेल संख्या निर्धारित करने और सह-संस्कृतियों की स्थापना करते समय विभिन्न माउस लाइनों से उपकला कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को मिलाने का अवसर प्रदान करता है।

ऑर्गेनोइड विकास पर फाइब्रोब्लास्ट फ़ंक्शन का अध्ययन स्टेम सेल जीव विज्ञान 9,10,11,15,16 में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। स्थापित सह-संस्कृति मीडिया या तो डीएमईएम को 10% भ्रूण बछड़े के सीरम (एफसीएस) 9,15 के साथ पूरक किया जाता है या विकास कारक कम मध्यम10,16 होता है। इस प्रोटोकॉल में, विकास कारक कम माध्यम का उपयोग विवो स्टेम सेल आला में स्थितियों की नकल करने के लिए किया जाता है, जहां फाइब्रोब्लास्ट काफी हद तक क्विसेंट होते हैं। एफसीएस एक विकास कारक समृद्ध सीरम है जिसके परिणामस्वरूप सह-संस्कृतियों में फाइब्रोब्लास्ट ्स की सक्रियता और प्रसार होता है, संभवतः विवो अवस्था से अलग फाइब्रोब्लास्ट सेल अवस्था के अनुरूप होता है। एफसीएस को बाहर करके और विकास कारकों को कम करके, ताकि अकेले माध्यम (ईआरकम) ऑर्गेनोइड विकास का समर्थन नहीं करता है और फाइब्रोब्लास्ट प्रसार को उत्तेजित नहीं करता है, ऑर्गेनोइड विकास पर फाइब्रोब्लास्ट के प्रभाव को अलग करना संभव है। इस माध्यम में, NOGGIN को हटा दिया जाता है और RSPO को न्यूनतम (10% RPSO) तक घटा दिया जाता है। एनओजीजीआईएन और आरएसपीओ दोनों को एसोफेजेल ऑर्गेनॉइड विकास के लिए आवश्यक दिखाया गयाहै। ईजीएफ को सह-संस्कृति माध्यम में बनाए रखा गया था, क्योंकि यह अपने आप में ऑर्गेनोइड विकास का समर्थन नहीं करता है। हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट ्स ईजीएफ-कम माध्यम (ईकमआरकम) में ऑर्गेनोइड विकास का समर्थन करने में भी सक्षम हैं। चित्र 2 बी, डी)।

ऑर्गेनॉइड सह-संस्कृतियों को पासिंग के माध्यम से बनाए नहीं रखा जा सकता है क्योंकि ट्रिप्सिनाइजेशन के दौरान फाइब्रोब्लास्ट खो जाते हैं। हालांकि, ऑर्गेनॉइड पासिंग को प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था क्योंकि एसोफैगल ऑर्गेनोइड्स को मोनो-संस्कृतियों के रूप में आगे के प्रयोग के लिए बनाए रखा, विस्तारित और उपयोग किया जा सकता है। मोनो-संस्कृतियों से पारित ऑर्गेनोइड्स का उपयोग ताजा पृथक फाइब्रोब्लास्ट के साथ सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है। प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करने का एक नुकसान कई ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या है। फाइब्रोब्लास्ट की छोटी उप-आबादी पर ध्यान केंद्रित करते समय, प्राप्त सह-संस्कृतियों की संख्या सीमित होती है। अन्य प्रोटोकॉल में, फाइब्रोब्लास्ट्स को पहले ऑर्गेनोइड सह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए उपयोग करने से पहले संस्कृति में विस्तारित किया जाताहै। हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट पासिंग के दौरान आकृति विज्ञान और पहचान को बदलते हैं, जो प्राथमिक त्वचा और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट17,18 का उपयोग करके दिखाया गया है। एसोफेजेल फाइब्रोब्लास्ट्स के पारंपरिक 2 डी पासिंग के परिणामस्वरूप आकृति विज्ञान और फेनोटाइप परिवर्तन दोनों होते हैं, यह दर्शाता है कि फाइब्रोब्लास्ट का इन विट्रो संवर्धन सह-संस्कृतियों के लिए उपयुक्त नहीं है जिसका उद्देश्य अंतर्जात स्टेम सेल आला की नकल करना है।

पूरे माउंट धुंधला फाइब्रोब्लास्ट-ऑर्गेनॉइड इंटरैक्शन को बनाए रखने और कल्पना करने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, जबकि सभी ऑर्गेनोइड्स में फाइब्रोब्लास्ट ्स सीधे उनसे जुड़े नहीं होंगे, अधिकांश ऑर्गेनोइड फाइब्रोब्लास्ट के संपर्क में हैं ( चित्रा 2 सी देखें)। उपकला-फाइब्रोब्लास्ट इंटरैक्शन को बनाए रखने के लिए, ऑर्गेनोइड्स को देखभाल के साथ संभालना और जोरदार पिपेटिंग, भंवर और उच्च गति कताई से बचना महत्वपूर्ण है। इष्टतम निर्धारण 3 डी ऊतक वास्तुकला को बनाए रखने के साथ-साथ अंतर्जात प्रतिदीप्ति रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक 30 मिनट निर्धारण एच 2बीजीएफपी सिग्नल को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के लिए इष्टतम है, हालांकि यह फ्लोरोफोर और उपयोग किए गए एंटीबॉडी के बीच भिन्न हो सकता है। ऑर्गेनोइड्स को साफ़ करने से प्रकाश प्रकीर्णन कम हो जाता है और पूरे 3 डी संरचना के विज़ुअलाइज़ेशन में काफी सुधार होता है। चूंकि ऑर्गेनोइड छोटे होते हैं, इसलिए क्लियरिंग आसान और तेज होती है; हालांकि, लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग समय लेने वाली हो सकती है, क्योंकि कई जेड-स्टैक्स बनाने की आवश्यकता होती है। कंफोकल माइक्रोस्कोप, स्पिनिंग डिस्क की तरह, इमेजिंग समय को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, फाइब्रोब्लास्ट की उपस्थिति में उगाए गए एसोफेजेल ऑर्गेनोइड एसोफेजेल स्टेम सेल आला के पहलुओं को समझने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा, पूरे माउंट क्लियरिंग फाइब्रोब्लास्ट और ऑर्गेनोइड्स के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए एक सुलभ विधि प्रदान करता है।

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को ईआरसी एसटीजी ट्रॉयकैन (851241) द्वारा समर्थित किया गया था। ई.ई. एक कैंसरफोंडेन पोस्टडॉक्टरल एसोसिएट है। एमजी एक रैग्नार सोडरबर्ग फेलो और कैंसरफोंडेन जूनियर इन्वेस्टिगेटर हैं। हम बायोमेडिकम फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा, बायोमेडिकम इमेजिंग कोर (बीआईसी), और तुलनात्मक चिकित्सा बायोमेडिकम (केएमबी) पशु सुविधा सहित कारोलिंस्का इंस्टीट्यूट कोर सुविधाओं से तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। हम प्रोटोकॉल पर ध्यान से पढ़ने और टिप्पणी करने के लिए जेनेंडर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher (Gibco) 17504001
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix fisher scientific 356231
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855-100ML
DMEM/F-12 Thermo Fisher (Gibco) 11320074
DPBS Thermo Fisher (Gibco) 14190250
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F7524
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher (Gibco) 35050061
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermo Fisher (Gibco) 14175-129
Normal Donkey Serum Jackson Immuno 017-000-121
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher (Gibco) 15140122
Triton X-100 solution Merck 93443-100ML
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Fisher (Gibco) 25200-056
Chemicals, Peptides, and recombinant proteins
DAPI Solution Thermo Fisher 62248
Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS
Dnase I Sigma-Aldrich 11284932001
Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol Sigma-Aldrich 252549-1L
Liberase Sigma-Aldrich 5401127001
N-Acetyl-cysteine Sigma-Aldrich A9165-25G
Noggin murine Peprotech 250-38
RapiClear 1.47 SunJin Lab #RC147001
Recombinant Mouse EGF Protein, CF R&D systems 2028-EG-200
R-spondin-1 murine Peprotech 315-32
SYTOX Blue Dead Cell Stain Thermo Fisher S34857
Thermolysin Sigma-Aldrich T7902-25MG
Y-27632 dihydrochloride Sigma-Aldrich Y0503-5MG
Plastic & Glassware
Corning Sterile Cell Strainers 40um VWR 15360801
Corning Sterile Cell Strainers 70um VWR 431751
Menzel Deckgläser/ cover slips Thermo Fisher Q10143263NR15
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP Sarstedt 72.706
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL Thermo Fisher 3446
SuperFrost Slides VWR 631-9483
Tools
0.05 mm 4 circular well iSpacer SunJin Lab #IS204
Dumont #5 forceps, biology tip F.S.T 11252-20
ImmEdge Pen VectorLaboratories H-4000
Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge F.S.T 15033-09
Instruments
Confocal microscope Stellaris 5  Leica
Dissection microscope ZEISS Stemi 305 Zeiss
FACS ARIA III BD Biosciences
Conjugated Antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody
Clone: 346-11A		 123608 123608
APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody H194-112 H194-112
PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody 147310 147310
Antibodies for Immunofluorescence
CD104 (ß-integrin 4)
Clone: 346-11A		 BioLegend 553745
Cytokeratin 14 Acris Antibodies (AbD Serotec) BP5009
Cytokeratin13
Clone: EPR3671		 abcam ab92551
E-cadherin (CD324)
Clone: 2.40E+11		 Cell Signaling Technology 3195
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified
Clone: Poly9059		 BioLegend 905901
p63
Clone: 4a4		 abcam ab735
Recombinant Anti-KLF4 antibod
Clone: EPR20753-25		 abcam ab214666
Vimentin Sigma-Aldrich AB5733
Secondary antibodies
Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice Jackson Immuno

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References

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Eenjes, E., Grommisch, D., Genander, … More

Eenjes, E., Grommisch, D., Genander, M. Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures. J. Vis. Exp. (191), e64905, doi:10.3791/64905 (2023).

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