Seit dem Aufkommen von Direktelektronendetektoren und der Verbesserung von Software und Hardware hat sich die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu einer Technik entwickelt, die es Forschern routinemäßig ermöglicht, die Struktur von Makromolekülen bis ins kleinste Detail zu bestimmen 1,2. Diese Beschleunigung wurde durch eine extrem rasante Reihe neuer Entwicklungen katalysiert, von der Probenvorbereitung über die Datenerfassung bis hin zur Datenverarbeitung. Um eine breite Demokratisierung dieser Technik für Nicht-Experten zu ermöglichen, wurden effizientere und zugänglichere Pipelines geschaffen. Weniger als 10 Jahre nach der "Auflösungsrevolution" ist die Kryo-EM zu einer unverzichtbaren Technik für die Proteincharakterisierung geworden, sowohl in der akademischen Welt als auch in der Industrie 3,4.
Einer der bemerkenswertesten Aspekte der Kryo-EM-Forschungsgemeinschaft ist die Bereitschaft, Protokolle, Strategien und Software offen zu teilen5. Diese Offenheit der Technologie und des Know-hows trug wesentlich zu dem sehr schnellen Entwicklungstempo bei, aber einige Engpässe verhindern nach wie vor, dass sie vollständig zugänglich sind. In dieser Methodensammlung wollen wir einige der jüngsten Entwicklungen bei der Vorbereitung von Gittern beschreiben, die für die Strukturanalyse mittels Kryo-EM geeignet sind, was zusammen mit dem Zugang zur Datenanalyse-Hardware für viele Projekte der größte Engpass darstellt. Wir diskutieren auch neue Protokolle, die sich derzeit in diesem Bereich in der Entwicklung befinden, für neue Ansätze in der Kryo-EM-Analyse.
Wie bereits erwähnt, ist einer der aktuellen Engpässe für die routinemäßige Anwendung von Kryo-EM im Labor die Probenvorbereitung. Auf der Ebene der Probenapplikation auf die Gitter können mehrere Probleme auftreten: am häufigsten die bevorzugte Ausrichtung der Probe im Eis und ihre Denaturierung an der Luft-Wasser-Grenzfläche. Die Abschirmung der Probe von der Luft-Wasser-Grenzfläche ist eine Lösung für dieses Problem, indem Stützfolien aus Kohlenstoff oder Graphen verwendet werden, die physikalisch verhindern, dass die Probe mit der Luft in Kontakt kommt. Um das Aufbringen dünner Folien auf Gitter zu erleichtern, haben de Martin Garrido et al.6 einen von einem 3D-Drucker hergestellten Stützflotationsblock entwickelt, mit dem kleine Wassertropfen und Proben kontrolliert aufgetragen werden können. Mit diesem Block werden die Graphen- und Kohlenstoffschichten kostengünstig und benutzerfreundlich abgeschieden.
Eine weitere Möglichkeit, die Schäden an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu verhindern, besteht darin, die Zeit zu begrenzen, in der das Protein der Atmosphäre ausgesetzt ist. Zu diesem Zweck verwenden zwei verschiedene Instrumente, die von Klebs et al.7 und Budell et al.8 entwickelt wurden, neuartige Ansätze für eine schnelle (bis zu 10 ms) Gittervorbereitung, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Problemen mit der Partikelorientierung verringert wird. Ein weiterer Vorteil dieser Geräte ist die Möglichkeit, zeitaufgelöste Experimente durchzuführen, eine aufregende neue Grenze für Strukturstudien.
In einem gegensätzlichen Ansatz berichten Nguyen et al.9 über eine Methode zum Einfrieren von Gittern für die Kryo-EM-Analyse in Ermangelung kommerzieller oder maßgeschneiderter Geräte, die entweder sehr kostspielig oder schwer zu bauen sind. Sie zeigen, wie mit einem billigen, selbstgebauten Gerät, das keine teuren Instrumente benötigt, Gitter ähnlicher Qualität erhalten werden können, was zur Demokratisierung der Kryo-EM beiträgt.
Bei der Kryo-EM ist die Probe von Interesse nicht immer ein Protein, sondern kann ein kleines Molekül oder ein großes biologisches System wie eine ganze Zelle sein. Die Vorbereitung solcher Proben ist einzigartig und erfordert spezifische Schritte sowie unterschiedliche Strategien bei der Datenerfassung.
Bei der mikrokristallinen Elektronenbeugung (MicroED) handelt es sich bei der zu untersuchenden Probe um eine kleine Chemikalie, die normalerweise in Form eines Pulvers vorkommt. Das Pulver wird direkt auf das EM-Gitter aufgetragen, um eine kristalline Form zu erhalten. Die Datenerfassung erfolgt dann im Beugungsmodus, wie Martynowycz und Gonen10 zeigen. Im Gegensatz dazu sind ganze Zellen zu dick für die Kryo-EM-Analyse. Um dies zu beheben, berichten Bisson et al. über eine Methode, bei der ein REM verwendet wird, um physisch in eine solche Probe zu bohren, um Dünnschliffe zu erhalten, die für Strukturstudien geeignet sind11.
Von der Probe bis zur Struktur ist es wichtig, für jeden Schritt des Prozesses Aufzeichnungen zu führen, da für jede Proteinprobe viele Parameter geändert werden, von der Proteinkonzentration über die Mikroskopeinstellungen bis hin zur Datenanalyse. Zu diesem Zweck haben Wypych et al.12 ein webbasiertes Informationsmanagement-Tool entwickelt, das es den Nutzern ermöglicht, ihren Workflow zu organisieren und den Überblick über alle Details zu behalten, die für zukünftige Publikationen benötigt werden. Dies ist besonders wichtig, da die Automatisierung in der Kryo-EM immer mehr an Bedeutung gewinnt, insbesondere in der Industrie.
Die Kryo-EM hat sich in den letzten zehn Jahren sowohl an der Hardware- als auch an der Softwarefront in einem herausragenden Tempo weiterentwickelt. Um die weite Verbreitung bewährter Verfahren und die breite Einführung neuer Methoden zu gewährleisten, ist ein transparenter Satz von Protokollen erforderlich. Diese Sonderausgabe wird einen Beitrag zu diesen Bemühungen leisten.