Hier werden Methoden vorgestellt, die detaillierte Anweisungen zum Sezieren, Dissoziieren, Kultivieren und Patch-Clamp-Aufzeichnen von vestibulären Ganglion- und Spiralganglienneuronen des Innenohrs liefern.
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Methodenartikel
Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglien-Somata von neonatalen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die kompakte Morphologie der isolierten und kultivierten Innenohrganglienneuronen ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung der Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren, die zur Zellvielfalt in dieser Population beitragen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für eine erfolgreiche Sezierung, Dissoziation und Kurzzeitkultivierung der Somata von bipolaren Neuronen des Innenohrs zum Zwecke der Patch-Clamp-Aufnahme erforderlich sind. Detaillierte Anweisungen zur Präparation von vestibulären Ganglienneuronen werden mit den notwendigen Modifikationen bereitgestellt, die für die Beschichtung von Spiralganglienneuronen erforderlich sind. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in der perforierten Patch-Konfiguration. Beispielhafte Ergebnisse, die die Spannungsklemmenaufzeichnungen von hyperpolarisationsaktivierten zyklischen Nukleotid-gesteuerten (HCN)-vermittelten Strömen charakterisieren, unterstreichen die Stabilität der perforierten Patch-Aufzeichnungskonfiguration im Vergleich zur Standardkonfiguration mit gerissenen Patches. Die Kombination dieser Methoden, isolierte Somata und perforierte Patch-Clamp-Ableitungen, kann verwendet werden, um zelluläre Prozesse zu untersuchen, die lange, stabile Aufzeichnungen und die Erhaltung des intrazellulären Milieus erfordern, wie z. B. die Signalübertragung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.
Einleitung
Die bipolaren Neuronen des Nervus vestibulocochlearis verbinden die sensorischen Haarzellen des Innenohrs mit dem Hirnstamm. Sie sind Hauptträger von Informationen über Schall und Kopfbewegungen; Eine Schädigung dieser wichtigen Zellen führt zu Taubheit und Gleichgewichtsstörungen. Die vestibulären und auditiven Anteile des Nervs bestehen jeweils aus unterschiedlichen Zelltypen, die morphologisch und funktionell vielfältig sind 1,2. Im vestibulären System feuern zwei afferente Subpopulationen spontan in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen2. Es wird angenommen, dass das afferente ....
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Protokoll
Alle hier beschriebenen Tierverwendungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Southern California genehmigt. Bei den Tieren in diesem Protokoll handelt es sich um Long-Evans-Ratten beiderlei Geschlechts im Alter von P3 bis P25, die von den Charles River Laboratories bezogen wurden, aber diese Methoden können auch auf andere Nagetierstämme angewendet werden. Bei allen Eingriffen müssen Laborkittel und Handschuhe sowie bei der Herstellung von Lösungen eine Spritzschutzbrille getragen werden.
1. Vorbereitungen
HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Lösung....
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Ergebnisse
Das Ausführen von Spannungsklemmprotokollen durch Anwendung von Familien von Spannungsschritten zeigt die spannungsabhängige Aktivierung einer Vielzahl unterschiedlicher Stromfamilien. Repräsentative Beispiele von Ganzzellenströmen, die von einem VGN hervorgerufen und aus veröffentlichten Aufzeichnungen13 adaptiert wurden, sind in 1A, B gezeigt. Durch das Anlegen von Depolarisationsspannungen (Abbildung 1B) wird ein nach .......
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Diskussion
Die hier vorgestellten Methoden sind spezifisch für Aufzeichnungen von isolierten Neuronen; Frühere Studien konzentrierten sich auf Ableitungen von Axonendigungen in einem semi-intakten Präparat. Im Vergleich zu bestehenden Klemmenaufzeichnungstechniken bieten isolierte Aufzeichnungen ein überlegenes Raumklemmen- und Isopotentialverhalten. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll Zugang zu einer breiteren Stichprobe von Neuronen, da nur kelchtragende Subpopulationen in semi-intakten Aufzeichnungen der vestibulären Epitheli.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Jing Bing Xue und Dr. Ruth Anne Eatock für ihre frühen Beiträge zu diesen Methoden. Diese Arbeit wurde von NIH NIDCD R03 DC012652 und NIH NIDCD DC012653S sowie R01 DC0155512 zu RK und T32 DC009975 zu DB, NN und KR unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | Für perforierte Patch-Aufnahmen. |
| ATP-Dinatrium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additiv zu innerer Lösung |
| B27 Supplement (50x), serumfrei | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Additiv zu Kulturmedium, für SGN |
| Becher (1000, 100, 10) Milliliter | |||
| Tischzentrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsenbrenner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Zusatz zur internen |
| Lösung Kollagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | eines von drei Enzymen zur Verdauung von Gewebe |
| Deckglas, rechteckig, #1 Dicke, 22x40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I, aus der Bauchspeicheldrüse des Rinds | Sigma-Aldrich | 11284932001 | eines von drei Enzymen zur Verdauung von Gewebe |
| Dumont #3 Pinzette (stumpf) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Pinzette (fein) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Pinzette ( Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additiv zur internen Lösung |
| Elektrodenabzieher | Narashige | PC-10 | |
| Epi-Beleuchtungsquelle | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | zum Reinigen des Kopfes und um die Sezierbank |
| herum Filamentierte Borosilikat-Kapillaren für Elektroden | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Feinkantige Präparierklinge | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glaspasteurpipetten | VWR | 14673-010 | zum Ziehen von Verreibpipetten |
| Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | Additiv zum Kulturmedium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | zur pH-Pufferung aller Lösungen im Protokoll |
| Heizplatte / Magnetrührer | VWR | 76549-914 | |
| Isolierter Eimer, gefüllt mit Eis | um alle Proben und Lösungen kühl zu halten | ||
| K2SO4, Kaliumsulfat | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additiv zur inneren Lösung |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additiv zur inneren Lösung |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | Zum Einbringen der inneren Lösung gewünschter pH-Wert. |
| Große Federschere | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz mittel | Sigma Aldrich | L4386 | Präparier- und Badlösungen |
| Aufnahmekammer mit flachem Bad für Kulturschalen | Warner Instruments | 64-0236 | |
| Luer-Lok-Spritzen, 30 ml | BD 302832 | zur Entnahme von L-15/HEPES/HEPES-Lösung. | |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | Base des Kulturmediums |
| MgCl2-Hexahydrat | Sigma-Aldrich | M1028 | Additiv zur internen Lösung |
| microFil Nadel zum Befüllen von Mikropipetten - 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | Zum Polieren von Elektroden. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | Zusatz zum Nährmedium, für SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additiv zur internen Lösung |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | für Titration |
| pH Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Sauerstoff, medizinische Qualität, mit geeignetem Regler und Schlauch | USC Material Management | MEDOX200 (Kennung: 00015) | zum Auflösen in Dissektions- und Badlösungen |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur-Pipettenkolben (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | Kolben für Verreibungspipetten |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Wissenschaftliche | 15140122 | Zusatzstoff zur Verhinderung einer Kontamination des Kulturmediums |
| Euthanasielösung auf Pentobarbitalbasis (z. B. Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg Dosierung) | MWI Animal Health | 15199 | für Euthanasie |
| PES-Membranfilter , 0,2 Mikrometer | Nalgene | 566-0020 | für Filterlösungen |
| PES-Membran-Sterilspritzenvorsatzfilter, 0,22 μm, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | zum Filtrieren von Lösungen, die in Spritzen gezogen |
| werden Petrischale, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | für die Mikrodissektion und zum Halten von Tip Dip Lösung in perforierter Patch-Konfiguration |
| Petrischale, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | für die grobe Dissektion |
| pH-Messgerät | Mettler Toledo | Modell S20 | |
| Pipettierer (1000, 200, 10) Mikroliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-Lysin-beschichtete Kulturschale mit Glasboden | Mattek | P35GC-0-10-C | zur Platte von Neuronen für die Kultur |
| Schnellwechselplattform, beheizter Boden, für 35 mm Kulturschalen | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Referenzzelle | World Precision Instruments | RC1T | |
| Skalpellklinge | Miltex | 4-315 | |
| Skalpellgriff | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serologische Pipetten (10, 25) Milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silikon Grease Kit (zum Abdichten von Deckglas und Kammer) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Guillotine für Kleintiere | Kent Scientific | DCAP | |
| Guillotine für Kleintiere | Kent Scientific | DCAP | für die Enthauptung beim Präparieren von Ratten, die älter als P15 sind. |
| Stereo-Dissektionsmikroskop | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Gerade chirurgische Schere | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Spritze (3, 10, 30) Milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | eines von drei Enzymen zur Verdauung |
| von Gewebe Tuberkulin-Spritze | Covidien | 8881500105 | für die Verabreichung von Euthanasielösung durch intraperitoneale Injektion |
| Vannas Federschere, 2,5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Messkolben, 1000 Milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Wasser, steril U-Trapure, R>18,18 MegaOhm cm (z. B. gefiltert durch eine Millipore-Sigma-Wasseraufbereitung | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
Referenzen
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kal....
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Nachdrucke und Genehmigungen
