Methodenartikel

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

DOI:

10.3791/64913

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7. April 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Machbarkeit und Effektivität von Hochdurchsatz-scRNA-seq-Methoden läutet eine Einzelzell-Ära in der Pflanzenforschung ein. Hier wird ein robustes und vollständiges Verfahren zur Isolierung spezifischer Arabidopsis thaliana-Wurzelzelltypen und zum anschließenden Aufbau und zur Analyse von Transkriptombibliotheken vorgestellt.

Zusammenfassung

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In mehrzelligen Organismen können die Entwicklungsprogrammierung und die Umweltreaktionen in verschiedenen Zelltypen oder sogar innerhalb von Zellen sehr unterschiedlich sein, was als zelluläre Heterogenität bezeichnet wird. In den letzten Jahren haben sich Einzelzell- und Zelltypisolierungen in Kombination mit Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zu wichtigen Werkzeugen entwickelt, um biologische Prozesse mit Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die Isolierung von Pflanzenzellen ist jedoch aufgrund des Vorhandenseins von pflanzlichen Zellwänden relativ schwierig, was die Anwendung von Einzelzellansätzen in Pflanzen einschränkt. Dieses Protokoll beschreibt ein robustes Verfahren zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-basierten Einzelzell- und Zelltypisolierung mit Pflanzenzellen, das sich für nachgelagerte Multi-Omics-Analysen und andere Studien eignet. Anhand von Arabidopsis-Wurzel-Fluoreszenzmarkerlinien zeigen wir, wie bestimmte Zelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen, Kortexzellen und endodermale Zellen, isoliert werden. Darüber hinaus wird eine effektive Downstream-Transkriptom-Analysemethode unter Verwendung von Smart-seq2 bereitgestellt. Die Zellisolationsmethode und die Transkriptomanalysetechniken können auf andere Zelltypen und Pflanzenarten übertragen werden und haben ein breites Anwendungspotenzial in den Pflanzenwissenschaften.

Einleitung

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Zellen sind die Grundeinheit aller Lebewesen und erfüllen strukturelle und physiologische Funktionen. Obwohl die Zellen in mehrzelligen Organismen eine scheinbare Synchronizität aufweisen, weisen Zellen verschiedener Typen und einzelne Zellen Unterschiede in ihren Transkriptomen während der Entwicklung und der Umweltreaktionen auf. Die Hochdurchsatz-Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet eine noch nie dagewesene Leistung für das Verständnis der zellulären Heterogenität. Die Anwendung von scRNA-seq in den Pflanzenwissenschaften hat zur erfolgreichen Erstellung eines Pflanzenzellatlas1 beigetragen, wurde zur Identifizierung seltener zell....

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Protokoll

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Das folgende Protokoll wurde für A. thaliana-Wildtyp-Samen (WT) ohne Fluoreszenz- und Fluoreszenzmarkerlinien für die folgenden Wurzelzelltypen optimiert: Xylempol-Pericycluszellen (J0121), laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen (J3411), Endodermis- und Cortexzellen (J0571) (Abbildung 1A). Alle Markierungslinien wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle), mit Ausnahme der Lateralwurzel-Initiationszell-Markerlinie, die durch die Einführung eines GATA23-Promotor-getriebenen GFP-Konstrukts in eine Wildtyp-Arabidopsis-Pflanze im Anschluss an einen zuvor veröffentlichten ....

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Ergebnisse

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Isolierung von Protoplasten
Dieses Protokoll ist effektiv für die Protoplastensortierung von fluoreszierenden A. thaliana-Wurzelmarkerlinien . Diese Markerlinien wurden durch die Fusion von fluoreszierenden Proteinen mit Genen, die spezifisch in Zielzelltypen exprimiert werden, oder durch die Verwendung von Enhancer-Fallenlinien entwickelt (Abbildung 1). Zahlreiche Gewebe und Organe wurden in Zelltypen zerlegt, die spezifische Fluoreszenzmarker in Modellpflanzen .......

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Diskussion

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Das Smart-seq2-basierte Protokoll kann zuverlässige Sequenzierungsbibliotheken aus mehreren hundert Zellenerzeugen 8. Die Qualität des Ausgangsmaterials ist entscheidend für die Genauigkeit der Transkriptomanalyse. FACS ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Präparation von Zellen von Interesse, aber dieses Verfahren, insbesondere der Protoplasting-Schritt, muss für pflanzliche Anwendungen optimiert werden. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) oder manuell präparierte Zellen können auch als Eing.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Wir haben dieses Protokoll in der Einzelzell-Multi-Omics-Einrichtung der School of Agriculture and Biology der Shanghai Jiao Tong University eingerichtet und wurden von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), dem Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) und der Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m SiebSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Agilent FragmentanalysatorAglientAglient 5200
Agilent hochempfindliches DNA-KitAglientDNF-474-0500
Ampure XP beadsBECKMANA63881
BetainyuanyeS18046-100g
BleachMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) Bleiche
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (Japan)9012-54-8
Cellulase RSYakult (Japan)9012-54-8
Zentrifugenröhrchen (1,5 mL)Eppendolf30121589
DNase-, RNase-, DNA- und RNA-Away Oberflächen-DekontaminationsmittelBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0,1 M)
Invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Tipp zum Filter  (1000 &Mikro; L)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Filterspitze  (200 & Mikro; L)Thermo ScientificTF140-200-Q
Filterspitze (10 & Mikro; L)Thermo ScientificTF104-10-Q
Filterspitze (100 & Mikro; L)Thermo ScientificTF113-100-Q
FluoreszenzmikroskopNikonEclipse Ni-E
Vierdimensionaler rotierender MischerKylin-BellBE-1100
HemicellulaseSigma9025-56-3
IS PCR-Primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix( 2X)Roche 
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japan)9032-75-1
Magnetischer Trennständerinvitrogen12321D
MannitolAladdin69-65-8
MESAladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MikrozentrifugenEppendorfCentrifuge 5425
Mikro-Mini-ZentrifugeTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Library Preparation KitilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN Primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'PCR-Instrument
ThermocyclerA24811
PektoliaseYakult (Japan)9033-35-6
PflanzenmarkerlinienNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ33231
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
RNase-InhibitorThermo ScientificEO0382
RNasefreies WasserInvitrogen10977023
Lösung A400 mM Mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH5,7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl-Lösung
B1 % (w/v)Cellulase R10, 1 % (w/v) Cellulase RS, 1 %  (w/v)Hemicellulase, 0,5 %  (w/v)Pektoliase und 1 %  (w/v) Macerozym R10 in einem frischen Aliquot der Lösung A
Steriler StößelBIOTREAT453463
Sieb (40 & Mikro; m )Sorfa 251100
SuperScript IV reverse Transkriptase (200 U/µ L)Invitrogen18090050
SuperScript IV Puffer (5x)Invitrogen18090050
Reagenzglas (5 mL)BD Falcon 352052
Dünnwandige PCR-Röhrchen mit Kappen (0,5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO Primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'Vortex
TitanVM-T2
7958935001

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
  2. Denyer, T., et al.

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Schlagwörter

Isolierung von PflanzenzellenEinzelzellsequenzierungfluoreszenzaktivierte ZellsortierungArabidopsis WurzelzellenProtoplastensortierungRNA SequenzierungSmart seq2 ProtokollZelltypheterogenit tMulti Omics Analyse

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