Methodenartikel

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

DOI:

10.3791/64913

⸱

7. April 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Machbarkeit und Effektivität von Hochdurchsatz-scRNA-seq-Methoden läutet eine Einzelzell-Ära in der Pflanzenforschung ein. Hier wird ein robustes und vollständiges Verfahren zur Isolierung spezifischer Arabidopsis thaliana-Wurzelzelltypen und zum anschließenden Aufbau und zur Analyse von Transkriptombibliotheken vorgestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In mehrzelligen Organismen können die Entwicklungsprogrammierung und die Umweltreaktionen in verschiedenen Zelltypen oder sogar innerhalb von Zellen sehr unterschiedlich sein, was als zelluläre Heterogenität bezeichnet wird. In den letzten Jahren haben sich Einzelzell- und Zelltypisolierungen in Kombination mit Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zu wichtigen Werkzeugen entwickelt, um biologische Prozesse mit Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die Isolierung von Pflanzenzellen ist jedoch aufgrund des Vorhandenseins von pflanzlichen Zellwänden relativ schwierig, was die Anwendung von Einzelzellansätzen in Pflanzen einschränkt. Dieses Protokoll beschreibt ein robustes Verfahren zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-basierten Einzelzell- und Zelltypisolierung mit Pflanzenzellen, das sich für nachgelagerte Multi-Omics-Analysen und andere Studien eignet. Anhand von Arabidopsis-Wurzel-Fluoreszenzmarkerlinien zeigen wir, wie bestimmte Zelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen, Kortexzellen und endodermale Zellen, isoliert werden. Darüber hinaus wird eine effektive Downstream-Transkriptom-Analysemethode unter Verwendung von Smart-seq2 bereitgestellt. Die Zellisolationsmethode und die Transkriptomanalysetechniken können auf andere Zelltypen und Pflanzenarten übertragen werden und haben ein breites Anwendungspotenzial in den Pflanzenwissenschaften.

Einleitung

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Zellen sind die Grundeinheit aller Lebewesen und erfüllen strukturelle und physiologische Funktionen. Obwohl die Zellen in mehrzelligen Organismen eine scheinbare Synchronizität aufweisen, weisen Zellen verschiedener Typen und einzelne Zellen Unterschiede in ihren Transkriptomen während der Entwicklung und der Umweltreaktionen auf. Die Hochdurchsatz-Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet eine noch nie dagewesene Leistung für das Verständnis der zellulären Heterogenität. Die Anwendung von scRNA-seq in den Pflanzenwissenschaften hat zur erfolgreichen Erstellung eines Pflanzenzellatlas1 beigetragen, wurde zur Identifizierung seltener zellulärer Taxa in Pflanzengeweben2 verwendet, hat Einblicke in die Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben geliefert und wurde verwendet, um die zelluläre Identität und wichtige Funktionen zu identifizieren, die bei der Entwicklung und Differenzierung von Pflanzen eine Rolle spielen. Darüber hinaus ist es möglich, räumlich-zeitliche Entwicklungsverläufe in Pflanzengeweben 1,2,3 abzuleiten, um neue Markergene4 zu entdecken und die Funktionen wichtiger Transkriptionsfaktoren5 mit Hilfe von scRNA-seq zu untersuchen, um die evolutionäre Konservierung desselben Zelltyps in verschiedenen Pflanzen aufzudecken 3. Abiotische Belastungen gehören zu den wichtigsten Umwelteinflüssen auf das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen. Indem man die Veränderungen in der Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben unter verschiedenen Behandlungsbedingungen durch Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung untersucht, kann man auch den abiotischen Stressreaktionsmechanismus aufklären6.

Das Potenzial für die Auflösung der transkriptionellen Heterogenität zwischen Zelltypen durch scRNA-Sequenzierung hängt von der Zellisolationsmethode und der Sequenzierungsplattform ab. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung einer Subpopulation von Zellen für scRNA-seq basierend auf Lichtstreuung und den Fluoreszenzeigenschaften der Zellen. Die Entwicklung von fluoreszierenden Markerlinien mittels transgener Technologie hat die Effizienz der Zellisolierung durch FACS7 erheblich verbessert. Die Durchführung von scRNA-seq mit Smart-seq28 verbessert die Fähigkeit, die zelluläre Heterogenität zu analysieren. Die Smart-seq2-Methode hat eine gute Sensitivität für den Gennachweis und kann Gene auch mit einem geringen Transkripteintrag nachweisen9. Zusätzlich zur Massenerfassung von Zelltypen bieten moderne Zellsortierer ein Einzelzell-Index-Sortierformat, das eine Transkriptomanalyse mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von Smart-seq210 oder anderen gemultiplexten RNA-seq-Methoden, wie z. B. CEL-seq211, ermöglicht. Die Einzelzell- oder Zellsortierung kann potenziell für viele andere nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, z. B. für parallele Multi-Omics-Studien12,13. Hier wird ein robustes und vielseitiges Protokoll zur Isolierung von Pflanzenzelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, lateralen Wurzelkappenzellen, lateralen Wurzelinitialzellen, Kortexzellen und endodermalen Zellen aus den Wurzeln von Arabidopsis thaliana-Markerzelllinien mittels FACS vorgestellt. Das Protokoll beinhaltet außerdem den Aufbau der Smart-seq2-Bibliothek für die nachgelagerte Transkriptomanalyse.

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Protokoll

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Das folgende Protokoll wurde für A. thaliana-Wildtyp-Samen (WT) ohne Fluoreszenz- und Fluoreszenzmarkerlinien für die folgenden Wurzelzelltypen optimiert: Xylempol-Pericycluszellen (J0121), laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen (J3411), Endodermis- und Cortexzellen (J0571) (Abbildung 1A). Alle Markierungslinien wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle), mit Ausnahme der Lateralwurzel-Initiationszell-Markerlinie, die durch die Einführung eines GATA23-Promotor-getriebenen GFP-Konstrukts in eine Wildtyp-Arabidopsis-Pflanze im Anschluss an einen zuvor veröffentlichten Berichterzeugt wurde 14.

1. Aufbereitung des Pflanzenmaterials

  1. Sterilisieren Sie die A. thaliana WT-Samen und die fluoreszierenden Markerliniensamen, indem Sie die Samen in 20%igem Bleichmittel in einem rotierenden Inkubator bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren.
  2. Spülen Sie die Samen drei- bis fünfmal in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) ab. Führen Sie diesen Schritt auf einer sterilen, sauberen Bank durch.
  3. Die Samen der WT- und Reporterlinie auf halbstarkem Murashige und Skoog (MS) Medium mit 0,8 % Agar (w/v)15 ablegen. Wachsen Sie die Pflanzen 5 Tage lang senkrecht (16 h Licht bei 23 °C), nachdem Sie sie 2 Tage lang bei 4 °C stratifiziert haben.

2. Protoplasting

  1. Bereiten Sie die protoplasting Lösungen2,5 vor, die als Lösung A und Lösung B bezeichnet werden (siehe Materialtabelle).
    1. Bereiten Sie Lösung A vor, die 400 mM Mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 und 20 mM KCl enthält (siehe Materialtabelle). Lagern Sie Lösung A bis zu 1 Monat bei −20 °C.
    2. Bereiten Sie Lösung B zu, indem Sie 1 % (w/v) Cellulase R10, 1 % (w/v) Cellulase RS, 1 % (w/v) Hemicellulase, 0,5 % (w/v) Pektoligase und 1 % (w/v) Macerozym R10 in einem frischen Aliquot von Lösung A hinzufügen. Lagern Sie Lösung B bei −20 °C für bis zu 1 Monat.
  2. Tauen Sie Lösung A und Lösung B vorsichtig auf Eis auf, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
  3. Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sauberen Klinge oder Schere ab und hacken Sie die Wurzeln in ~0,5 cm große Stücke. Tauchen Sie die Wurzeln in 1,5 ml Lösung B, gefolgt von einer sanften Rotation (bei ca. 18 U/min) bei Raumtemperatur für 1,5-2 Stunden.
  4. Filtern Sie die Wurzelprotoplasten durch das 40 μm Siebgewebe (siehe Materialtabelle).
  5. Spülen Sie das Siebgewebe mit 1-2 ml Lösung A aus.
  6. Die Flüssigkeiten aus Schritt 2.4 und Schritt 2.5 vermischen und bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet in 500-600 μl Lösung A und legen Sie es dann sofort auf Eis.
  7. Die resuspendierte Zelllösung wird zur Zellsortierung in ein neues 5-ml-Reagenzglas überführt.

3. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

  1. Schalten Sie das Gerät ein und beenden Sie die Schritte zum Einrichten des Geräts am Sortierer (siehe Materialtabelle). Wählen Sie die Fluoreszenzkanäle aus, verwenden Sie eine WEA-Anlage (keine Fluoreszenz) als Kontrolle, um die Basislinie für die Autofluoreszenz zu bestimmen, und passen Sie den Sortierschieber basierend auf der Fluoreszenzintensität und den FSC/SSC-Vereinzelungen an (Abbildung 2).
  2. Geben Sie 500 μl Lösung A (Schritt 2.1.1) in ein 1,5-ml-Sammelröhrchen, um eine Beschädigung der Zellen zu verhindern. Sammle 2.000-3.000 Zellen pro Röhrchen.
  3. Nach dem Sortieren werden die Proben sofort auf Eis gelegt, das Sammelröhrchen mit den Zellen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette entfernt.
  4. Nehmen Sie 2 μl sortierte Zellen und überprüfen Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop auf Fluoreszenz (siehe Materialtabelle).
  5. Lagern Sie die sortierten Zellen bei −80 °C oder verwenden Sie sie sofort für den Bibliotheksaufbau (Schritt 4).
  6. Setzen Sie für die Sortierung des Einzelzellenindex die 96-Well-Platte in den Adapter ein. Kalibrieren Sie die Position der Platte so, dass der Tropfen in das mittlere Loch der Platte fällt. Wählen Sie beim Sortieren den Einzelzellen-Sortiermodus, geben Sie die Zielanzahl der sortierten Zellen als 1 ein und starten Sie die Sortierung.

4. Vorbereitung der Smart-seq2-Bibliothek

  1. Aufgrund der extrem geringen Menge an Input können Einzelzell-RNA-seq-Bibliotheken in einer kontaminationsfreien Umgebung erstellt werden. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie den Prüfstand mit einem Oberflächendekontaminationsmittel8 (siehe Materialtabelle) und 75%igem Ethanol.
  2. Herstellung von Lysepuffer (Gemisch A) (Tabelle 1) durch Kombination von 0,33 μl 10 % Triton X-100, 0,55 μl RNase-Inhibitor und 0,22 μl 0,1 M DTT (siehe Materialtabelle).
  3. Geben Sie 1 μl der Mischung A in die sortierte Probe und mahlen Sie sie mit einem sterilen Stößel. Das bevorzugte Probenvolumen beträgt ≤0,5 μl; Verwenden Sie RNase-freies Wasser, um das Volumen auf 14 μl zu erhöhen. Übertragen Sie jede einzelne Zellprobe in ein dünnwandiges 0,2-ml-PCR-Röhrchen.
  4. Bereiten Sie Gemisch B vor, das 0,44 μl Oligo-dT30VN reverse Transkription (RT)-Reaktionsprimer (100 μM) und 4,4 μl dNTPs (10 mM) enthält (Tabelle 2) (siehe Materialtabelle).
  5. Fügen Sie 4,4 μl Mischung B zu den 14 μl Probe in jedem Röhrchen hinzu, pipettieren Sie vorsichtig, um die Probe zu mischen, und inkubieren Sie die Probe 3 Minuten lang bei 72 °C. Nach der Inkubation werden die Proben sofort auf Eis gelegt, um das Oligo-dT mit dem Poly-A-Schwanz zu hybridisieren.
  6. Bereiten Sie das Reverse-Transkriptions-Reaktionsgemisch (Gemisch C) (Tabelle 3) vor (siehe Materialtabelle). Geben Sie 21,6 μl der Mischung C in jedes Röhrchen mit den Proben. Schalten Sie das RT-Programm auf einem gängigen PCR-Gerät ein (Tabelle 4).
  7. Führen Sie die Vorverstärkungsreaktion auf Eis durch. Bereiten Sie Gemisch D vor, indem Sie 44 μl 2x PCR-Polymerase-Mix und 0,88 μl IS-PCR-Primer (10 μM) kombinieren (Tabelle 5) (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 40,8 μl Gemisch D zu den 40 μl RT-Reaktionsprodukt hinzu und führen Sie das Voramplifikationsprogramm aus (Tabelle 6).
  8. Reinigen Sie die Produkte der Voramplifikationsreaktion mit Ampure XP-Kügelchen (siehe Materialtabelle). Geben Sie 48 μl Beads (Verhältnis 0,6:1) in jede Probe aus Schritt 4.7 und mischen Sie die Proben vorsichtig durch Pipettieren.
  9. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen mit den Proben für 5 Minuten auf einen magnetischen Trennständer. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus den Proben, ohne die Kügelchen zu stören.
  10. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie sie in 200 μl 80%igem Ethanol resuspendieren, und legen Sie die Proben für weitere 3 Minuten auf den Magnetseparationsständer (siehe Materialtabelle), bevor Sie den ethanolhaltigen Überstand entsorgen.
  11. Lassen Sie die Proben 10 Minuten lang an der Luft trocknen und decken Sie das Röhrchen ab, um eine Kontamination und Kreuzkontamination während der Lufttrocknung zu vermeiden.
  12. Resuspendieren Sie die Beads in 20 μLddH2O, inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 5 min und legen Sie sie dann für 5 min auf den magnetischen Trennständer.
  13. Pipettieren Sie 18 μl des Überstands aus jedem Röhrchen und übertragen Sie die Proben in neue 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 1 μl der Probe, um die Qualität der cDNA mit einem DNA-Quantifizierungskit zu beurteilen, bestimmen Sie die Größenverteilung jeder Vorbibliothek mit einem Fragmentanalysator (siehe Materialtabelle) und lagern Sie die verbleibende Probe bei −20 °C.
  14. Konstruieren Sie eine cDNA-Bibliothek8 für die Illumina-Sequenzierung 16 aus dem Vorbibliotheksprodukt aus Schritt4.13 unter Verwendung eines Sequenzierungsbibliotheks-Vorbereitungskits (siehe Materialtabelle).
  15. Bereinigen Sie die Bibliotheken (ab Schritt 4.14) mit den Ampure XP-Beads, quantifizieren Sie die bereinigten Bibliotheken und bestimmen Sie die Größenverteilung der einzelnen Bibliotheken gemäß Schritt 4.13.
    HINWEIS: Fassen Sie gleiche Nanomol jeder Bibliothek zusammen, um sicherzustellen, dass keiner von ihnen die gleiche Kombination des Illumina-Index hat. Andernfalls können die Libraries in einem Verhältnis basierend auf dem gewünschten Sequencing-Output gepoolt und auf derselben Lane des Illumina-Sequenzers sequenziert werden. Im Allgemeinen bietet die Sequenzierung jeder Bibliothek bis zu einer Tiefe von 4-6 GB, was >10 Millionen kartierte Lesevorgänge ergibt, eine 20-30-fache Abdeckung des Arabidopsis-Genoms . Geringere Sequenziertiefen sind ebenfalls akzeptabel, können aber die Aussagekraft der differentiellen Expressionsanalyse beeinträchtigen.

5. RNA-seq-Datenanalyse

  1. Trimmen Sie die rohen Reads mit Trim-Galore17, gefolgt von der Zuordnung zum Referenzgenom mit hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), und entfernen Sie die PCR-duplizierten Fragmente mit Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
  2. Führen Sie die Rohzählung und die anschließende Analyse der differentiell exprimierten Gene (DEG) mit DESeq220 unter Verwendung von mindestens drei biologischen Replikaten für jede Probe durch. Führen Sie ein Clustering der Genexpression mit dem Pheatmap-Paket durch und visualisieren Sie es in einer Expressions-Heatmap.
    HINWEIS: Die RPKM-Werte (Reads per Kilobase per Million Mapped Reads) der Gene und der TEs (Transposable Elements) wurden mit Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) berechnet und in einem Genombrowser visualisiert.

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Ergebnisse

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Isolierung von Protoplasten
Dieses Protokoll ist effektiv für die Protoplastensortierung von fluoreszierenden A. thaliana-Wurzelmarkerlinien . Diese Markerlinien wurden durch die Fusion von fluoreszierenden Proteinen mit Genen, die spezifisch in Zielzelltypen exprimiert werden, oder durch die Verwendung von Enhancer-Fallenlinien entwickelt (Abbildung 1). Zahlreiche Gewebe und Organe wurden in Zelltypen zerlegt, die spezifische Fluoreszenzmarker in Modellpflanzen ...

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Diskussion

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Das Smart-seq2-basierte Protokoll kann zuverlässige Sequenzierungsbibliotheken aus mehreren hundert Zellenerzeugen 8. Die Qualität des Ausgangsmaterials ist entscheidend für die Genauigkeit der Transkriptomanalyse. FACS ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Präparation von Zellen von Interesse, aber dieses Verfahren, insbesondere der Protoplasting-Schritt, muss für pflanzliche Anwendungen optimiert werden. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) oder manuell präparierte Zellen können auch als Eing...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben dieses Protokoll in der Einzelzell-Multi-Omics-Einrichtung der School of Agriculture and Biology der Shanghai Jiao Tong University eingerichtet und wurden von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), dem Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) und der Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m SiebSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Agilent FragmentanalysatorAglientAglient 5200
Agilent hochempfindliches DNA-KitAglientDNF-474-0500
Ampure XP beadsBECKMANA63881
BetainyuanyeS18046-100g
BleachMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) Bleiche
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (Japan)9012-54-8
Cellulase RSYakult (Japan)9012-54-8
Zentrifugenröhrchen (1,5 mL)Eppendolf30121589
DNase-, RNase-, DNA- und RNA-Away Oberflächen-DekontaminationsmittelBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0,1 M)
Invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Tipp zum Filter  (1000 &Mikro; L)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Filterspitze  (200 & Mikro; L)Thermo ScientificTF140-200-Q
Filterspitze (10 & Mikro; L)Thermo ScientificTF104-10-Q
Filterspitze (100 & Mikro; L)Thermo ScientificTF113-100-Q
FluoreszenzmikroskopNikonEclipse Ni-E
Vierdimensionaler rotierender MischerKylin-BellBE-1100
HemicellulaseSigma9025-56-3
IS PCR-Primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix( 2X)Roche 
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japan)9032-75-1
Magnetischer Trennständerinvitrogen12321D
MannitolAladdin69-65-8
MESAladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MikrozentrifugenEppendorfCentrifuge 5425
Mikro-Mini-ZentrifugeTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Library Preparation KitilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN Primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'PCR-Instrument
ThermocyclerA24811
PektoliaseYakult (Japan)9033-35-6
PflanzenmarkerlinienNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ33231
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
RNase-InhibitorThermo ScientificEO0382
RNasefreies WasserInvitrogen10977023
Lösung A400 mM Mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH5,7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl-Lösung
B1 % (w/v)Cellulase R10, 1 % (w/v) Cellulase RS, 1 %  (w/v)Hemicellulase, 0,5 %  (w/v)Pektoliase und 1 %  (w/v) Macerozym R10 in einem frischen Aliquot der Lösung A
Steriler StößelBIOTREAT453463
Sieb (40 & Mikro; m )Sorfa 251100
SuperScript IV reverse Transkriptase (200 U/µ L)Invitrogen18090050
SuperScript IV Puffer (5x)Invitrogen18090050
Reagenzglas (5 mL)BD Falcon 352052
Dünnwandige PCR-Röhrchen mit Kappen (0,5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO Primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'Vortex
TitanVM-T2
7958935001

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Isolierung von PflanzenzellenEinzelzellsequenzierungfluoreszenzaktivierte ZellsortierungArabidopsis WurzelzellenProtoplastensortierungRNA SequenzierungSmart seq2 ProtokollZelltypheterogenit tMulti Omics Analyse

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