Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Das vergangene Jahrzehnt war geprägt von der weltweiten Verbreitung von Einzelzellansätzen in der Zell- und Molekularbiologie. In Anlehnung an die Einzelzellgenomik^1,2 ist es heute möglich, viele Komponenten einer einzelnen Zelle (z. B. DNA, RNA^, Proteine) zu untersuchen, wobei jedes Jahr neue Einzelzell-Omics-Techniken entstehen. Diese Techniken haben alte und neue Fragestellungen für die Bereiche Immunologie, Neurobiologie, Onkologie und andere Bereiche beleuchtet, sowohl mit menschlichen als auch mit Modellorganismuszellen³. Durch die Hervorhebung der Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen führte die Einzelzell-Omik zur Definition eines neuen Modells der Hämatopoese, das sich auf die Heterogenität hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) konzentrierte und sich vom klassischen Modell diskreter homogener Populationen entfernte ^4,5.

Einer der wenigen Nachteile aller -omics-Techniken ist die Zerstörung der interessierenden Zelle, was die Möglichkeit ausschließt, ihre Funktionalität zu beurteilen. Umgekehrt liefern andere Einzelzellmethoden, wie z. B. Einzelzelltransplantations-Assays und Lineage-Tracing-Technologien, ein Auslesen der Funktionalität der Vorfahrzelle, indem sie das Schicksal einzelner Zellen in vivo beurteilen ^6,7. Bei der Abstammungsverfolgung wird die interessierende Zelle mit einer vererbbaren genetischen⁷ oder einer fluoreszierenden Markierung^8,9 markiert^, so dass das Schicksal mehrerer Einzelzellen gleichzeitig verfolgt werden kann. Die Charakterisierung der Ausgangszellen ist jedoch in der Regel auf eine begrenzte Anzahl von Parametern beschränkt, wie z.B. die Expression einiger Oberflächenproteine, die mittels Durchflusszytometrie beurteilt^{werden 10}. Darüber hinaus erfordern Technologien zur Rückverfolgung von Einzelzelllinien eine aufwändige Detektion der zellulären Markierung, in der Regel durch DNA/RNA-Sequenzierung oder Bildgebung. Gerade dieser letzte Punkt schränkt die Anzahl der Bedingungen ein, die in einem einzigen Experiment getestet werden können.

Eine weitere Klasse von Methoden, die zur Untersuchung der Funktionalität einzelner Zellen verwendet werden, sind Ex-vivo-Zellkultivierungssysteme einzelner HSPCs. Diese Goldstandard-Assays sind einfach durchzuführen und beinhalten die Sortierung einzelner Zellen in 96-Well-Zellkulturgefäße und nach der Kultivierung die Charakterisierung des Phänotyps der Zellnachkommen, typischerweise durch Durchflusszytometrie oder morphologische Analyse. Diese Assays wurden hauptsächlich verwendet, um die langfristige Differenzierung von HSPCs in reife Zellen zu charakterisieren, typischerweise nach 2-3 Wochen Kultur^11,12. Alternativ wurden sie verwendet, um zu versuchen, ex vivo HSPCs 13,14,15,16,17,18 zu erhalten und zu erweitern^, mit dem Versprechen eines medizinischen Nutzens für die Transplantation menschlicher Stammzellen ¹⁹. Schließlich wurden sie verwendet, um die frühe Bindung von HSPCs unter Verwendung der Kurzzeitkultur²⁰ zu untersuchen, wobei die geringe Anzahl von Zellen, die in dieser Kultur erzeugt wurden, der wichtigste limitierende Faktor war. Ein Nachteil dieser verschiedenen Arten von Ex-vivo-Assays ist, dass sie die In-vivo-Komplexität nur teilweise widerspiegeln. Dennoch sind sie eine der seltenen Möglichkeiten, die menschliche HSPC-Differenzierung zu untersuchen.

Eine fehlende Information aus bestehenden Einzelzellmethoden (Einzelzell-Omics, Lineage Tracing und Ex-vivo-Kultur) ist der genaue Nachweis von Zellteilungen, ein wesentlicher Parameter, der bei der Untersuchung der HSPC-Dynamik berücksichtigt werden^{muss 21}. Eine einfache Möglichkeit, die Anzahl der Teilungen mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen, ist die Verwendung löslicher "Proteinfarbstoffe" wie dem 5-(und 6)-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE)²². Diese Teilungsfarbstoffe diffundieren im Zytoplasma der gefärbten Zellen, werden um die Hälfte verdünnt und bei jeder Zellteilung an die beiden Tochterzellen weitergegeben, so dass bis zu 10 Teilungen gezählt werden können. Durch die Kombination mehrerer Teilungsfarbstoffe ist es möglich, mehrere einzelne Vorläuferzellen in derselben Vertiefung zu besiedeln, da jeder einzelne Farbstoff die Trennung der verschiedenen Nachkommen ermöglicht. Dies ist das Prinzip hinter der Verwendung von Zellfarbstoffen für die klonale Multiplex- und Teilungsverfolgung, das erstmals für murine Lymphozyten eingeführt wurde^23,24.

Hier stellen wir die Entwicklung des MultiGen-Assays für den Einsatz mit murinen und humanen HSPCs vor. Es ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung vieler Einzelzellen auf ihre Eigenschaften der Differenzierung, Teilung und Verwandtschaft ex vivo. Dieser einfach durchzuführende und kostengünstige Hochdurchsatz-Assay ermöglicht es, den zellulären Phänotyp, die Anzahl der durchgeführten Teilungen sowie die Zellverwandtschaft und klonale Beziehung zu den anderen Zellen im Well gleichzeitig zu messen. Es kann verwendet werden, um symmetrische und asymmetrische Schicksalsbindung, die Balance zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung und die Anzahl der für ein bestimmtes Bindungsschicksal erforderlichen Teilung quantitativ zu bewerten. Das Protokoll erfordert einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) und ein Durchflusszytometer mit einem Plattenlesegerät sowie die für die Durchführung der Zellkultur erforderliche Ausrüstung. Neben dem technischen Protokoll für die Durchführung des Assays an humanen HSPCs stellen wir auch den detaillierten Analyserahmen zur Verfügung, einschließlich der statistischen Tests, die zur Bewertung der zellulären Eigenschaften im Zusammenhang mit dem Konzept der Zellfamilie²⁵ erforderlich sind. Dieses Protokoll wurde bereits erfolgreich zur Beschreibung des murinen HSPC-Kompartiments^26,27 verwendet.

Das folgende Protokoll verwendet magnetisch angereicherte CD34⁺ -Zellen als Ausgangsmaterial²⁸. Auf diese Weise ist es möglich, die humanen HSPCs aus verschiedenen Blutquellen (z.B. Nabelschnurblut, Knochenmark, peripheres Blut) effizient zu färben und zu isolieren. Es ist wichtig, die ^{CD34-Fraktion} nicht zu verwerfen, da sie als Teil des Protokolls verwendet wird, um verschiedene Arten von experimentellen Kontrollen einzustellen. Die genannten Zellmengen und -volumina können je nach experimentellem Arbeitsablauf und Bedarf vergrößert oder verkleinert werden. In ähnlicher Weise kann das Protokoll an die Untersuchung verschiedener Arten von Vorläuferzellen angepasst werden, indem einfach die Antikörper modifiziert werden, die für die Zellsortierung und Durchflusszytometrie verwendet werden.

Für das folgende Protokoll wurde anonymisiertes Nabelschnurblut als HSPC-Quelle verwendet und gemäß den Richtlinien der Nabelschnurblut-Biobank des Saint-Louis Hospital (Genehmigung AC-2016-2759) und der Deklaration von Helsinki gesammelt.

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass alle für dieses Protokoll erforderlichen Reagenzien und Geräte verfügbar sind, wie in der Materialtabelle aufgeführt und im Protokoll erwähnt. Bereiten Sie die entsprechenden Reagenzien frisch vor und lagern Sie sie nicht, es sei denn, dies wird ausdrücklich erwähnt.

1. Färbung von Zellfarbstoffen

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Färbung mit vier Kombinationen von CFSE- und Violettfarbstoffen (CTV) beschrieben. Verarbeiten Sie alle Röhrchen gleichzeitig, auch wenn keine Zellfarbstofflösung hinzugefügt wird. Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, um den folgenden Zellkulturschritt zu ermöglichen. Zeitaufwand: ca. 100 Min.

1. Verarbeiten Sie die Nabelschnurbluteinheit gemäß einem magnetischen Sortierprotokoll²⁹. Stellen Sie sicher, dass zwei Fraktionen zur Verfügung stehen: eine große CD34-Fraktion und eine kleinere CD34^+-Fraktion. Beide Röhrchen 5 min bei 300 x g schleudern. Saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören.
2. Für die CD34⁺ -Fraktion wird sie in 1 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) ohne fetales Kälberserum (FBS) resuspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. die Zelldichte sollte nicht höher als 3 x 10⁶ Zellen/ml sein. Wenn dies der Fall ist, passen Sie die Lautstärke entsprechend an. Für die ^{CD34-Fraktion} resuspendieren Sie in DMEM ohne FBS und stellen Sie das Volumen auf maximal 6 x 10⁶ Zellen/ml ein.
3. Aliquotieren Sie 250 μl der CD34⁺-Fraktion in vier 15-ml-Polypropylenröhrchen. Beschriften Sie die Röhren wie folgt: CD34+/CF (CFSE_only), CD34+/CV (CFSE_high CTV_low), CD34+/VC (CFSE_low CTV_high) und CD34⁺/VI (CTV_high). Aliquotieren Sie 250 μL der ^{CD34-Fraktion} in weitere vier 15 mL Polypropylenröhrchen. Beschriften Sie die Röhrchen wie folgt: CD34-/CF (CFSE_only), CD34-/CV (CFSE_high CTV_low), CD34-/VC (CFSE_low CTV_high) und CD34^-/VI (CTV_high). Die restlichen Zellen der ^{CD34-Fraktion} können verworfen werden.
4. Bereiten Sie zwei CFSE-Lösungen vor, die als CFSE_high und CFSE_low bezeichnet werden. Für CFSE_high (10 μM) 1,1 ml DMEM ohne FBS mit 2,2 μl CFSE-Stammlösung (5 mM) mischen. Für CFSE_low (5 μM) mischen Sie 550 μl DMEM ohne FBS und 0,55 μl CFSE-Stammlösung (5 mM).
5. Geben Sie 250 μl der CFSE_high-Lösung in die CF- und CV-Röhrchen, 250 μl der CFSE_low-Lösung in die VC-Röhrchen und 250 μl DMEM ohne FBS in die VI-Röhrchen. Um eine effiziente Mischung aus Zellsuspension und Zellfarbstoff zu gewährleisten, neigen Sie das Röhrchen um fast 90 Grad und tragen Sie die CFSE-Lösungen an der Röhrchenwand auf. Halten Sie dann das Röhrchen senkrecht, um die beiden Lösungen zu mischen, und pipettieren Sie drei- oder viermal, um eine schnelle Vermischung der CFSE-Lösungen mit den resuspendierten Zellen zu gewährleisten. Bei 37 °C exakt 8 min inkubieren.
6. Nach der Inkubation werden 5 ml DMEM + 10 % FBS hinzugefügt. Halten Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 37 °C.
7. Schleudern Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 300 x g. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration, ohne das Pellet zu stören, und waschen Sie das Pellet mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung 1x/Ethylendiamintetraessigsäure (PBS 1x/EDTA). Nochmals 5 min bei 300 x g schleudern. Verwerfen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 250 μL 1x PBS /EDTA.
8. Bereiten Sie zwei CTV-Lösungen vor, die als CTV_high und CTV_low bezeichnet werden. Für CTV_high (10 μM) mischen Sie 1,1 ml PBS 1x/EDTA und 2,2 μl CTV-Material (5 mM). Für CTV_low (5 μM) 550 μL PBS 1x/EDTA mit 0,55 μL CTV-Stamm (5 mM) mischen.
9. Geben Sie 250 μl der CTV_high Lösung in die VC- und VI-Röhrchen, 250 μl der CTV_low Lösung in das CV-Röhrchen und 250 μl 1x PBS /EDTA in das CF-Röhrchen. Verwenden Sie die gleiche Technik wie in Schritt 1.5 beschrieben. Bei 37 °C exakt 8 min inkubieren.
10. Nach der Inkubation werden 5 ml DMEM + 10 % FBS hinzugefügt. 5 Min. bei 37 °C aufbewahren.
11. Schleudern Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 300 x g, entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und waschen Sie das Pellet dann mit 5 ml 1x PBS / EDTA. Nochmals 5 min bei 300 x g schleudern.
12. Verwerfen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die CD34-Fraktionen in 1x PBS /EDTA für eine Endkonzentration von 1,5 x 10⁶ Zellen/ml. Resuspendieren Sie die CD34⁺-Fraktionen in 40 μl Färbepuffer und übertragen Sie die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen.

2. Antikörper-Färbung

HINWEIS: Die Antikörperfärbung kann an die experimentellen Anforderungen angepasst werden. Nur die CD34⁺ -Fraktionen werden mit Antikörpern gefärbt; Die CD34-Fraktionen werden als Einzelfärbekontrolle für die Zellteilungsfarbstoffkombinationen (CV-, VC-, CF^- und VI-Fraktionen) verwendet. Das folgende Panel ist auf den Nachweis von vier Arten von HSPCs zugeschnitten: hämatopoetische Stammzellen (HSCs), multipotente Vorläuferzellen (MPPs), lymphatisch primierte multipotente Vorläuferzellen (LMPPs) und hämatopoetische Vorläuferzellen (HPCs)¹². Die Identifizierung von HSCs und MPPs wird jedoch vorgestellt. Zeitaufwand: 75 Min.

1. Bereiten Sie die Einzelfärbung für die Oberflächenfärbung mit Kompensationsperlen vor. Mischen Sie negative Beads und Immunglobulin G (IgG)-Beads im Verhältnis 1:1, um ein Gesamtvolumen zu erhalten, das 20 μl x der Anzahl der Oberflächenmarker entspricht (z. B. 120 μl, wenn das Färbepanel sechs Antikörper enthält).
2. Geben Sie 20 μl Beads in einzelne 1,5-ml-Röhrchen für jeden Marker. Geben Sie das Volumen, das dem Verdünnungsfaktor entspricht, für jeden Antikörper in das entsprechende Röhrchen (z. B. wenn der Verdünnungsfaktor 1:20 beträgt, fügen Sie 1 μl hinzu).
3. Um die CD34⁺ -Zellen zu färben, wird eine Mastermischung von Antikörpern¹² auf der Grundlage von Tabelle 1 hergestellt. Mischen Sie die Antikörper in ein einziges 0,5-ml-Röhrchen. Fügen Sie 7 μl aus dem Antikörper-Mastermix zu jeder der vier CD34+-Bedingungen hinzu.
4. Inkubieren Sie die Kompensationsperlen und die CD34⁺ -Proben bei 4° C für mindestens 30 min.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit muss an die technischen Details der für die Färbung verwendeten Antikörper angepasst werden.
5. Bereiten Sie während der Inkubation die 96-Well-Platte mit rundem Boden für die Sortierung vor, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung geben.
   Anmerkungen: Lassen Sie die Vertiefungen H8-H12 leer.
6. Beschriften Sie 5-ml-Polypropylen-Röhrchen für die Oberflächenfärbekontrollen (5, mit Beads), die Zellteilungsfarbstoffkontrollen (4, unter Verwendung der CD34-Fraktionen) und die CD34^+-Proben (4).
7. Waschen Sie die Zellen und Kügelchen am Ende der Inkubation mit 1 ml Färbepuffer. Übertragen Sie das Gesamtvolumen auf die 5-ml-Polypropylenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 300 x g und saugen Sie dann den Überstand an, ohne das Pellet zu stören.
8. Resuspendieren Sie die Zellen in Färbepuffer, wobei jeweils ca. 500 μl für die Beads und CD34⁺-Zellen und 1 ml für die CD34-Röhrchen verwendet werden.

Tabelle 1: Vorlage zur Herstellung des Antikörper-Mastermixes für ein Zellsortierexperiment. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

3. Sortierung der Zellen

HINWEIS: Die sortierten Zellennummern können je nach Gesamtzahl der verfügbaren Zellen variieren. Im Protokoll wird für jedes Steuerelement eine Mindestzellenzahl angegeben. Zeitaufwand (für einen einzelnen Teller): 100 min.

1. Öffnen Sie das Vorlagenexperiment, oder legen Sie ein neues Experiment fest. Erstellen Sie eine einzelne Probe und mehrere Röhrchen, eines pro Bedingung.
2. Legen Sie die in Abbildung 1 beschriebene Gating-Strategie fest, indem Sie sechs Punktdiagramme erstellen. Visualisieren Sie zunächst die Zellen in einem FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm und doppelklicken Sie auf das Polygon-Gating-Werkzeug , um eine Grundgesamtheit mit geringer Seitenstreuung auszuwählen (Abbildung 1A). Klicken Sie im folgenden Punktdiagramm (FSC-A/FSC-H) mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und wählen Sie das Tor "Zellen" aus dem Dropdown-Menü aus, indem Sie darauf klicken. Verwenden Sie dasselbe Anschnittwerkzeug , um eine enge Grundgesamtheit auf der Diagonalen zwischen den beiden Achsen auszuwählen (Abbildung 1B).
3. Zeigen Sie im dritten Punktdiagramm (APC vs. FSH-H) die Population "Einzelzellen" an und stellen Sie die Zellen negativ für die Expression der APC-Linie (Lin) dar (Abbildung 1C). Zeigen Sie im vierten Diagramm (CFSE vs. CTV) die Population "Lin^-" an und erstellen Sie vier getrennte Gates, eines für jede Farbstoffkombination (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Diese Tore müssen dicht sein, um nur einen kleinen Teil der homogen gefärbten Zellen auszuwählen.
4. Verwenden Sie das fünfte und sechste Diagramm (APC-Cy7 vs. BV650 und PE-Cy7 vs. PE), um die interessierenden Vorläufer zu identifizieren. Die CD34+^{CD38-Population} und die CD34⁺CD38⁺-Population werden im fünften Diagramm großzügig gegatet (Abbildung 1E). Wählen Sie dann die CD34⁺CD38-Population im sechsten Diagramm aus und zeichnen Sie drei Gatter gemäß Abbildung 1F.
5. Führen Sie die einzelnen Färberöhrchen mit den Kompensationsperlen aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen . Passen Sie die Spannungen der Photomultiplier-Röhre (PMT) über das Dropdown-Menü Parameter an, insbesondere für die Zellteilungsfarbstoffe (zwischen 10⁴ und 10⁵ auf einer biexponentiellen Skala).
6. Verfeinern Sie die Kompensationsmatrix entsprechend dem Bereich, der für die Sortierung verwendet wird, indem Sie die Registerkarte Kompensation verwenden. Zeichnen Sie mindestens 5.000 Ereignisse im Perlengatter auf, indem Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen klicken.
7. Führen Sie die ^CD34-Brüche durch und überprüfen Sie erneut die Kompensationsmatrix. Zeichnen Sie mindestens 10.000 Ereignisse im Einzelzellen-Gate auf.
8. Führen Sie die CD34⁺ -Fraktionen aus und zeichnen Sie mindestens 5.000 Ereignisse im Einzelzellen-Gate auf. Passen Sie das Gate für jede Farbstoffkombination an, indem Sie ein enges Gate einstellen, um eine homogene Population auszuwählen (Abbildung 1D). Passen Sie auf ähnliche Weise das Gating für die Auswahl von HSCs und MPPs an.
9. Sobald die Analyse abgeschlossen ist und alle Röhrchen aufgezeichnet sind, setzen Sie die Platte in die entsprechende Halterung ein, nachdem Sie die Standard-Aria-Kalibrierung für die Sortierung auf 96-Well-Platten durchgeführt haben. Es wird empfohlen, die Platte zu kühlen.
10. Bereiten Sie die Vorlage für die Plattensortierung gemäß dem in Tabelle 2 dargestellten Schema unter Verwendung des Layouts für die Versuchssortierung vor. Die Vertiefungen mit der Bezeichnung "CD34^-" enthalten 5.000-10.000 Zellen, sortiert nach dem CF/CV/VC/VI-Gatter. Die "Bulk"-Wells enthalten mindestens 500 Zellen, sortiert nach dem Gate CD34⁺CD38^-. Schließlich enthalten die Einzelzell-Wells nur ein Ereignis pro Zellteilungsfarbstoffkombination pro Well, also insgesamt vier Ereignisse pro Well.
    HINWEIS: Die "Bulk"-Populationen können an die Untergruppe bestimmter Vorläufer angepasst werden. Sortieren Sie nicht weniger als 500 Zellen.
11. Gehen Sie für die Sortierung der Reihe nach vor und vervollständigen Sie jede Zellteilungsfarbstoffkombination, bevor Sie zur nächsten übergehen. Beginnen Sie z. B. mit der Sortierung des CD34-CF im Reinheitsmodus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Übernehmen" und dann auf die Schaltfläche "Sortieren".
12. Am Ende der CD34-Sortierung wird das CF CD34⁺ Röhrchen eingelegt. Erwerben, klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Sortieren" und stellen Sie sicher, dass Sie 0/16/0 als Reinheitsgrad angekreuzt haben. Sortieren Sie schließlich die gewünschten Zellen, eine Zelle pro Well, in Einzelzellreinheit und stellen Sie sicher, dass Sie die Option Indexsortierung aktivieren.
13. Gehen Sie zur folgenden Zellteilungsfarbstoffkombination über und wiederholen Sie die gleiche Reihenfolge. Als Referenz zeigt Tabelle 2 ein Beispiel für eine sortierte Platte.
    HINWEIS: Die Indexsortierfunktion generiert für jede sortierte Bedingung individuelle Dateien.
14. Exportieren Sie am Ende der Sortierung die Dateien als .fcs 3.0-Dateien. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ . Die Zellen werden je nach Versuchsplan mehrere Tage lang für mindestens 24 h²⁶ kultiviert.

Tabelle 2: Vorlage für eine 96-Well-Platte zur Zellsortierung, basierend auf den spezifischen Anforderungen für die sukzessive Durchflusszytometrie-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

4. Datenanalyse zur Zellsortierung

HINWEIS: Um die Qualität der Zellsortierung zu validieren, ist die FACS-Datenanalyse erforderlich, bevor Sie fortfahren. Das Hauptergebnis dieses Schritts ist die Generierung einer Tabelle, die die Markerintensitäten jeder sortierten Einzelzelle enthält.

1. Laden Sie die .fcs 3.0-Dateien in die Analysesoftware hoch.
2. Überprüfen Sie die Kompensationseinstellung, die während der Zellsortierung verwendet wird, anhand der einzelnen Färbedateien, die vor der eigentlichen Sortierung aufgezeichnet wurden.
3. Legen Sie die überarbeitete Gating-Strategie fest, indem Sie die Dateien verwenden, die der unterschiedlichen Masse entsprechen. Kopieren Sie diese Gatter und fügen Sie sie in die Indexsortierdateien ein.
4. Überprüfen Sie, ob die nach Index sortierten Zellen in das festgelegte Gate gefallen sind. Wenn es einige sortierte Zellen gibt, die falsch zugeordnet wurden, können sie durch Exportieren der während der Indexsortierung aufgezeichneten Plattenkoordinaten identifiziert und später in der Analyse entfernt werden.
5. Exportieren Sie das Ereignis aus den Indexsortierdateien als kompensierte Parameter. Exportieren Sie sie als .csv Dateien und aktivieren Sie die Optionen " Skalenwerte " und "Kompensierte Parameter". Diese Dateien sollten in einen Ordner mit dem Namen " Exportierte Dateien" exportiert werden.
6. Kombinieren Sie alle Dateien in einer einzigen .csv-Datei, indem Sie das Skript in Supplemental File 1 verwenden. Setzen Sie den richtigen Pfad mit der Funktion "setwd". Die Ausgabe dieses Skripts ist eine Tabelle, die alle unterschiedlich verknüpften Ereignisse und die relativen Intensitäten für alle Parameter enthält.

5. Färbung von Antikörpern nach der Kultur

Anmerkungen: Führen Sie diesen Teil des Protokolls unter sterilen Bedingungen durch. Mehrere Reagenzien werden mit den vorherigen Schritten geteilt und müssen steril bleiben. Verwenden Sie für die Durchflusszytometrie-Analyse ein Durchflusszytometer mit einem Plattenlesegerät. Dies ermöglicht es, die Färbung direkt in der Gewebekulturplatte durchzuführen, wodurch der Zellverlust auf ein Minimum reduziert wird, indem die Menge des Pipettierens und Schleuderns begrenzt wird. Bereiten Sie die einfarbige Färbung des Oberflächenmarkers mit den Kompensationsperlen vor, mit Ausnahme der Vertiefungen A1-A4, die die Einzelfärbung für die CF/CV/VC/VI-Farben darstellen und bereits in der 96-Well-Platte vorhanden sind. Die nach dem Zellfarbstoff sortierten Massenpopulationen helfen bei der Festlegung der Gating-Strategie für die Anzahl der Teilungen und das allgemeine Gating. Zeitaufwand: 120 Min.

1. Bevor Sie mit dem Protokoll beginnen, markieren Sie die Vertiefungen, die mindestens eine Zelle enthalten, indem Sie die Platte unter einem inversen Mikroskop überprüfen. Dieser Schritt ermöglicht es, die Menge der für die Färbung verwendeten Antikörper zu optimieren und das Verfahren zu beschleunigen.
2. Bereiten Sie den Antikörper-Mastermix gemäß Tabelle 3 vor. Da viel pipettiert wird, wird in der Tabelle der technische Fehler berücksichtigt, der auf das Pipettieren zurückzuführen ist, einschließlich eines zusätzlichen Volumens von 5 %. Die in der Tabelle beschriebenen Antikörper ermöglichen die Charakterisierung einer Reihe von HSPCs aus menschlichen Nabelschnurblutproben¹².
3. Zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 300 x g. Drehen Sie die Platte schnell unter die Haube und über ein Papiertuch, um den Überstand zu entfernen.
4. Geben Sie 8 μl Färbepuffer in die Vertiefungen A1-A4. Geben Sie 8 μl der Mischung in die anderen Vertiefungen.
5. Mischen Sie die Negativperlen und die IgG-Kompensationsperlen im Verhältnis 1:1, um ein Gesamtvolumen von 120 μl zu erhalten. Versenden Sie 20 μl in einem 1,5-ml-Röhrchen pro Marker. Fügen Sie das dem Verdünnungsfaktor entsprechende Antikörpervolumen hinzu (z. B. bei einem Verdünnungsfaktor von 1:20 1 μl hinzufügen).
   Anmerkungen: Passen Sie das Gesamtvolumen an die Anzahl der für die Färbung verwendeten Marker an (z. B. 100 μl, wenn das Färbepanel fünf Antikörper enthält).
6. Inkubieren Sie die Platte und die Einzelfärbekompensationskontrollen bei +4 °C für mindestens 30 min.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit muss an die technischen Details der für die Färbung verwendeten Antikörper angepasst werden.
7. Waschen Sie die Kügelchen mit 1 ml Färbepuffer. Übertragen Sie das Gesamtvolumen auf die zuvor beschrifteten 5-ml-Polypropylenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 min lang bei 300 x g und entfernen Sie dann den Überstand durch Aspiration.
8. Waschen Sie die Zellen in der Platte, indem Sie 100 μl Färbepuffer pro Well mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Platte 5 Minuten lang bei 300 x g und drehen Sie die Platte dann schnell unter der Haube und über einem Papiertuch um, um den Überstand zu entfernen.
9. Resuspendieren Sie die Zellen in 85 μl Färbepuffer mit einer Mehrkanalpipette.
10. Starten Sie die Analyse auf dem Durchflusszytometer (Erfassungsmodus), indem Sie die entsprechende Vorlage verwenden und auf Benutzerdefiniert klicken. Diese kundenspezifische Schablone berücksichtigt die technischen Merkmale der 96-Well-Round-Bottom-Platte, insbesondere die Abmessungen der einzelnen Wells (Durchmesser, Tiefe und Dicke). Die Sonde muss den Boden der Vertiefung erreichen, also genau in der Mitte der Vertiefungen A1 und H12 ansetzen.
11. Nachdem Sie die gewünschten Fluorophore aus der von der Software vorgeschlagenen Liste ausgewählt haben, stellen Sie den Plattenaufbau gemäß der Plattenvorlage in Tabelle 2 ein, korrigiert um die Anzahl der Wells, die mindestens eine Zelle enthalten.
12. Wählen Sie 100 μl als Begrenzung des Erfassungsvolumens. Setzen Sie ein Häkchen bei der Option Rühren . Stellen Sie die Erfassungsrate auf max. 1 μl/s ein, da eine niedrigere Geschwindigkeit das analysierte Gesamtvolumen pro Well verbessert.
13. Geben Sie die entsprechenden Reinigungs- und Waschlösungen in die Vertiefungen H8-H12. Die Vorlage in Tabelle 2 lässt die Vertiefungen H8-H12 ausdrücklich leer, da das Durchflusszytometer am Ende der Analyse eine Reihe von Waschbedingungen durchlaufen muss.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist an die Besonderheiten des verwendeten Durchflusszytometers angepasst.
14. Legen Sie im Abschnitt Diagramme und Gatter zuerst das Einzelzellen-Gatter fest, indem Sie das FSC-A/SSC-A-Streudiagramm und dann das FSC-H/FSC-A-Streudiagramm verwenden. Erstellen Sie ein Histogramm für jeden gewünschten Marker.
15. Sobald die Einstellungen bestätigt sind, fahren Sie mit dem Abschnitt Analyse fort. Analysieren Sie zuerst die Einzelfärbung und zeichnen Sie nicht weniger als 5.000 Ereignisse (optimaler Bereich: 5.000-15.000 Ereignisse) auf, sowohl für die Kompensationsperlen als auch für die CD34-gefärbten Fraktionen. Passen Sie die Spannungen bei Bedarf an.
16. Sobald alle Einzelfärbungen aufgezeichnet sind, ist es möglich, die eigentliche Erfassung zu starten, indem Sie auf die Erfassungsfunktion klicken.

Tabelle 3: Antikörper-Mastermix für ein Durchflusszytometrie-Experiment, speziell für die Identifizierung von HSPCs aus menschlichem Nabelschnurblut. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

6. Analyse der Durchflusszytometrie nach der Kultur

HINWEIS: Die beschriebene Datenanalyse ist spezifisch für die Software, die in der Materialtabelle erwähnt wird. Das Hauptergebnis ist die Generierung einer Tabelle, die Informationen über die Intensität der Oberflächenmarker, die Anzahl der Unterteilungen und die Verwandtschaft pro analysierter Zelle enthält. In diesem Teil des Protokolls ist ein in R geschriebenes Skript enthalten, das für diesen Workflow erforderlich ist, um die endgültige Analysetabelle zu generieren.

1. Exportieren Sie Dateien aus dem Durchflusszytometer als .fcs-Dateien. Laden Sie sie in die Analysesoftware hoch und gruppieren Sie sie als "Einzelfärbung", "Bulk" und "Einzelzelle".
3. Um ein repräsentatives Gating zu erhalten, verketten Sie die verschiedenen Bulk-Wells in einer einzigen Datei. In diesem Schritt wird schnell hervorgehoben, ob sich zwei Farben überlappen (in der Regel CV und VC) oder andere Anomalien aufweisen und daher ausgeschlossen werden müssen. Nachdem Sie auf die Option " Populationen verketten" geklickt haben, wählen Sie alle nicht kompensierten Parameter aus dem Menü "Parameter" aus und klicken Sie dann auf "Verketten".
5. Bereiten Sie die in Abbildung 2 definierte Verknüpfungsstrategie mithilfe der verketteten Datei vor. Zeigen Sie im Einzelzellen-Gate die Ereignisse in einem Streudiagramm mit CFSE und CTV an. Erstellen Sie ein erstes Gate mit dem Namen "Beschriftet", das alle vier Farben enthält und eine mögliche Autofluoreszenz ausschließt (Abbildung 2C). Fassen Sie dann jede Farbe einzeln an.
6. Zellen, die mit CV und VC markiert sind, benötigen einen transformierten Wert, da die Farbe das Ergebnis der CFSE- und CTV-Signale ist. Die beiden koordinierten Signale werden daher auf einer logarithmischen Skala um 45° gedreht, damit die Teilungsverdünnung parallel zur x-Achse verläuft. Dieser transformierte Wert wird manuell abgeleitet, indem Sie auf Extras und dann auf Parameter ableiten klicken. Fügen Sie die folgende Formel in das Formelfeld ein:
   
   HINWEIS: Die Gleichung²⁶ geht davon aus, dass CFSE und CTV die Parameter 03 und 17 sind.
7. Um diesen neuartigen Parameter mit dem Namen "Abgeleiteter Parameter" korrekt zu visualisieren, legen Sie eine lineare Achse im Bereich von ~3-7 fest, klicken Sie auf die Option " Achsenparameter " und wählen Sie "Achse anpassen".
8. Wenden Sie das Gating auf jede Farbe einzeln als Histogrammdiagramm an: Legen Sie für CF und VI CFSE-A bzw. CTV-A auf der x-Achse fest. Legen Sie für KS und VC den neu abgeleiteten Parameter auf der x-Achse fest. Legen Sie die Gates für jeden Peak fest, wie in Abbildung 3 dargestellt.
9. Wenden Sie die Anspritzung auf jede einzelne einzellige Vertiefung an. Stellen Sie sicher, dass Sie den abgeleiteten Parameter zu jedem analysierten Well hinzufügen. Überprüfen Sie jedes Farbgate für jedes Well manuell, um Ereignisse zu erkennen, die fälschlicherweise einem bestimmten Peak zugeordnet sind. Beispiele für die Ansteuerung sind in Abbildung 4 dargestellt.
10. Nachdem die Analyse abgeschlossen ist und alle Wells verifiziert wurden, wählen Sie alle CF/CV/VC/VI-Gatter aus, die mindestens eine Zelle enthalten. Exportieren Sie sie als .csv-Dateien und aktivieren Sie die Optionen "Skalierungswerte" und "Kompensierte Parameter". Diese Dateien werden in einen Ordner mit dem Namen "Exportierte Dateien" exportiert.
11. Kombinieren Sie alle Dateien in einem einzigen .csv, indem Sie das R-Skript in Supplemental File 1 verwenden. Denken Sie daran, den richtigen Pfad mit der Funktion "setwd" festzulegen. Die Ausgabe dieses Skripts ist eine Tabelle, die alle verschiedenen Gated Events und die relativen Intensitäten für alle Parameter enthält.
12. Öffnen Sie die Tabelle und benennen Sie die Spalten für jeden Parameter um, z. B. mit den folgenden Namen: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38. Diese Namen werden verwendet, um den Gating-Schwellenwert zu identifizieren, um jeder Zelle ihre Identität korrekt zuzuweisen.
13. Fügen Sie sechs Spalten mit den Namen "Well", "Condition", "Color", "Generation", "Original_cell" und "Culture_time" hinzu. Diese Variablen sind experimentell definiert und werden aus jeder Zeile abgeleitet:
    export_A10 CD34 ⁺ PBS_CV_Peak 1.csv,1 = A10 (Well), CD34⁺ (Original_cell), PBS (Zustand), CV (Farbe), Peak_1 (Generation).
14. Exportieren Sie die Bulk-Wells, um die Schwellenwerte für das Gating zu identifizieren: Exportieren Sie die kompensierte Grundgesamtheit von Interesse (z. B. CD34⁺CD38^-) als .csv-Dateien und aktivieren Sie dabei die Optionen "Skalenwerte" und "Kompensierte Parameter". Exportieren Sie diese Dateien in einen Ordner mit dem Namen "Exportierte Dateien".
15. Um den Schwellenwert für CD38 zu ermitteln, ermitteln Sie den größten numerischen Wert für diesen Parameter. Umgekehrt müssen Sie den kleinsten numerischen Wert für diesen Parameter ermitteln, um den Schwellenwert für CD34 zu ermitteln. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle relevanten Parameter.
    HINWEIS: Für die im Protokoll vorgestellte Analyse wird der Marker CD45RA sowohl zur Identifizierung von LMPPs im CD34+CD38-Gate als auch zur CMP/GMP im CD34⁺CD38^+-Gate verwendet. Das bedeutet, dass für diesen Marker zwei unterschiedliche Schwellenwerte extrahiert werden müssen.
16. Kopieren Sie die Schwellenwerte und fügen Sie sie in eine Excel-Datei mit dem Namen "gating_matrix" ein. Diese Datei ist nach Tabelle 4 aufgebaut und ermöglicht die Analyse mehrerer unabhängiger Experimente. Es ist sehr wichtig, jede Spalte genau nach diesem Schema zu benennen: XXYYMMDD_xxh, wobei XX für die beiden Initialen des Operators, YY für die letzten beiden Zahlen für das Jahr, MM für den Monat, DD für den Tag und xx für den Analysezeitpunkt steht.

Tabelle 4: Gating-Matrix für die Zuordnung des Zellschicksals vor der statistischen Analyse. CD45h bezieht sich auf die Intensität von CD45RA für das HPC-Subset-Gating, während CD45l sich auf die Intensität von CD45RA für die CD34⁺CD38-Subpopulationen bezieht. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

7. Statistische Analyse

HINWEIS: Das statistische Testen der generierten Daten umfasst eine benutzerdefinierte Analysepipeline, die mit der Programmiersprache Python (Supplemental File 2, Supplemental File 3 und Supplemental File 4) codiert ist. Das Skript ist in drei Blöcke unterteilt: den ersten für die Verarbeitung der Tabelle, den zweiten Block zum Generieren der Heatmap für die Datenvisualisierung und den letzten Block zum Generieren mehrerer Histogramme zum Analysieren und Testen von Differenzierungs- und Divisionseigenschaften.

1. Stellen Sie ausgehend vom Block "0_process_data" (Supplemental File 2) sicher, dass die gating_matrix und die Pfade der Datentabelle im Skript korrekt definiert sind.
2. Definieren Sie das "cell_cols"-Wörterbuch, um jeder Zelle die relevanten Zellschicksale zuzuordnen. Im konkreten Fall handelt es sich um HSCs, MPPs, LMPPs, gemeinsame myeloische Vorläuferzellen (CMPs), granulo-monozytäre Vorläuferzellen (GMPs), megakaryozytär-erythroide Vorläuferzellen (MEPs) und CD34^-.
3. Definieren Sie anhand der aus den Bulk-Wells definierten Schwellwerte (Schritt 6.16) die Funktion "cell_class_exp_time". Es ist wichtig, bei der Spaltenbenennung konsistent zu sein, um diese Schwellenwerte korrekt zu definieren, indem Sie denselben Namen verwenden, der für die Definition jeder Spalte in Schritt 6.12 verwendet wurde.
4. Die Zellphänotypen werden im Skript mit einer Reihe von "if-else"-Anweisungen definiert, die auf den während der durchflusszytometrischen Analyse ermittelten Schwellenwerten basieren.
   HINWEIS: Verschiedene Phänotypen können angezeigt werden, indem diese Aussagen geändert werden, um andere Markerkombinationen zu berücksichtigen.
5. Geben Sie mit der Funktion "cond_rule" die versuchsspezifischen Bedingungen an (z. B. verschiedene experimentelle Behandlungen). Für den bereitgestellten Datensatz heißen die Bedingungen "GT" und "Diff". Beschreiben Sie die zwei verschiedenen Zellkulturmedien, die zur Kultivierung der Zellen verwendet werden. Diese Informationen werden vom Block "1_dot_plot" (Supplemental File 3) zum Plotten der Heatmap verwendet.
6. Definieren Sie im Block "2_bar_plot" (Supplemental File 4) das Wörterbuch "class_dct", einschließlich der interessierenden diskreten Zellschicksale. Für den bereitgestellten Datensatz sind die interessierenden Zellschicksale die gleichen, die für das Wörterbuch "cell_cols" beschrieben sind.
7. Definieren Sie "conds" (Bedingungen), "or_cells" (ursprüngliche Zelle), "sym_labs" (Symmetriebeschriftungen) und "times" (den experimentellen Zeitpunkt). Dabei handelt es sich um Wiederholungsfilter, die für das Plotten erforderlich sind. "conds" nehmen wieder die in "cond_rule" definierten Bedingungen auf, "or_cells" sind HSCs und MPPs, und "sym_labs" beschreiben die Art der Teilungen.
8. Im Block "2_bar_plot" ist es möglich, Zellen zu plotten, die bis zur Division 6 fortgeschritten sind.
   HINWEIS: Der bereitgestellte Datensatz enthält nur Zellen bis Division 4, daher wird eine Fehlermeldung angezeigt, die jedoch nicht verhindert, dass das Skript funktioniert.
9. Die vom Skript generierten Zahlen können im Ordner "figures" als pdf-Dateien abgerufen werden. Die Dateien mit dem Namen "Test" stellen die verschiedenen statistischen Tests dar, die für das entsprechende Histogramm durchgeführt wurden.

FACS-Sortierung
Die in diesem Protokoll vorgestellten Sortier-Gating-Strategien basieren auf weithin akzeptierten Strategien 12,30,31. Für die in Abbildung 1 dargestellte Gating-Strategie besteht das Ausgangsmaterial aus Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut, die zuvor durch magnetische CD34+-Anreicherung gereinigt wurden, was den vernachlässigbaren Prozentsatz an Lineage-positiven Zellen erklärt. Es ist wichtig, für die vier intrazellulären Farbstoffkombinationen (z. B. die CTV in der Abbildung) enge Gates zu verwenden, um die Auflösung der Peaks während der folgenden Analyse zu verbessern und die richtige Zellpopulation zu erreichen (Abbildung 1D). In dem in der Abbildung dargestellten Fall wählen die Gates die größte und besser definierte Population aus. Das Vorhandensein von mehreren, nahen Populationen für jede Zellteilungsfarbstoffkombination ist unserer Erfahrung nach nicht repräsentativ für biologische Unterschiede. Stattdessen könnte es a) auf ein nicht optimales Färbeverfahren oder b) eine große Heterogenität (insbesondere in der Größe) im Ausgangspool der Zellen hinweisen. Dies ist nicht unerwartet, wenn man von Nabelschnurblut oder anderen komplexen biologischen Quellen (z. B. Knochenmarkaspirate, peripheres Blut) ausgeht. Wenn das Gate nicht genau definiert ist, kann die fortschreitende Verdünnung der verschiedenen Farbstoffkombinationen zu einer Verschmelzung der späteren Peaks führen, insbesondere für die Bedingungen CV und VC (Abbildung 2D). Eine weitere negative Folge eines suboptimalen Gates ist die Unfähigkeit, verschiedene Peaks nach der Zellkultur effizient zu unterscheiden, da eine heterogene Ausgangspopulation zu flachen Peaks führen kann.

Abbildung 1: Gating-Strategie für die Zellsortierung. (A) FSC-A versus SSC-A, um Trümmer und kontaminierende Zellen auszuschließen. (B) FSC-A versus FSC-H, um Dubletten und Zellklumpen auszuschließen. (C) Lin im Vergleich zu FSC-H, um Zellen auszuschließen, die Lin+ sind. (D) CTV versus CFSE, um die mit den Farbstoffkombinationen CF, CV, VC und VI gefärbten Zellen eindeutig zu identifizieren. Die Tore sollten streng genug sein, um eine homogene Bevölkerung einzubeziehen. (E) CD34 versus CD38, um die restriktiven Vorläuferzellen CD34+CD38+ (auch HPCs genannt) vom multipotenten Kompartiment CD34+CD38- zu trennen. (F) CD45RA versus CD90 aus der CD34+CD38-Population, um zwischen den unreifsten Vorläuferzellen zu trennen, die mit dem HSC (CD90+CD45RA-), dem LMPP (CD90midCD45RA+) und dem stärker engagierten MPP (CD90-CD45RA-) angereichert sind. (G) Indexsortierte Ereignisse, die hier für ihre Zellfarbstoffkombinationsfärbung und (H) die Expression der Oberflächenmarker CD90 und CD45RA dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Durchflusszytometrische Analyse nach Zellkultur
Die Daten in Abbildung 2 sind repräsentativ für HSZ aus menschlichem Nabelschnurblut, die 72 h lang in Kultur gehalten wurden, in Gegenwart mehrerer Zytokine, die in der Lage sind, eine Reihe von myeloischen Vorläufern und Vorläufern zu unterstützen. Die Tafeln 2A bis 2D stellen das Gating dar, das notwendig ist, um die Verwandtschaft jeder der einzelnen Zellen festzustellen, während die Tafeln 2E bis 2G eine zelluläre Phänotypisierung ermöglichen. Die reduzierte Präsenz von MEPs in der Abbildung ist wahrscheinlich die Folge der Kulturbedingungen, die für dieses repräsentative Experiment verwendet wurden (Abbildung 2F). Die Verwendung unterschiedlicher Zytokine und Kulturbedingungen verändert den relativen Prozentsatz jeder Untergruppe, ähnlich wie bei der Auswahl verschiedener Ausgangszellen für das Experiment.

Abbildung 2: Gating-Strategie für die durchflusszytometrische Analyse. (A) FSC-A versus SSC-A, um Trümmer und kontaminierende Zellen auszuschließen. (B) FSC-A versus FSC-H, um Dubletten und Zellklumpen auszuschließen. (C) CTV versus CFSE, das Gate Labeled ermöglicht es, jedes autofluoreszierende Ereignis auszuschließen, das die Datenauflösung beeinträchtigen könnte. (D) CTV versus CFSE. Es ist äußerst wichtig, die vier Populationen auf der Grundlage der Verdünnungen der Zellteilungsfarbstoffe streng zu erfassen. (E) CD34 versus CD38, um zwischen gebundenen Vorläufern (CD34-), eingeschränkten Vorläufern (HPC) (CD34+CD38+) und unreifen Vorläuferzellen (CD34+CD38-) zu unterscheiden. (F) CD45RA versus CD123, um drei Arten von eingeschränkten Vorläuferzellen zu unterscheiden: CMP (CD123+CD45RA-), MEP (CD123-CD45RA-) und GMP (CD123+CD45RA+). (G) CD45RA versus CD90, aus dem CD34+CD38-, zur Identifizierung von HSCs, LMPPs und MPPs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Schritte zur Definition und Zuweisung von Peaks (Abbildung 3 und Abbildung 4) sind entscheidende Aspekte des Protokolls und erfordern die Definition strenger Gatter. Für die Peakdefinition (Abbildung 3) sind mindestens 1.000 Ereignisse für eine sichere Identifizierung notwendig. In diesem Sinne könnte es von Vorteil sein, während des Zellsortierungsschritts für die "Bulk"-Wells mehr Zellen zu isolieren. Abbildung 4 zeigt vier Beispiele für einzelne Bohrlöcher, die mehrere Familien enthalten. Diese Abbildung verdeutlicht die Bedeutung von Gating in Abbildung 2D und Abbildung 3, insbesondere für die Identifizierung jeder Familie und jedes Peaks. Abbildung 4A zeigt ein einfaches Beispiel, da alle Zellen im Gate CF sehr nahe beieinander liegen und leicht einem einzelnen Peak zugeordnet werden können. Abbildung 4C zeigt ein weiteres Beispiel einer Familie, die eindeutig auf zwei gut getrennte Peaks verteilt ist, wie sie im Histogramm von Abbildung 4D deutlich dargestellt ist. Abbildung 4E,G zeigt die Bedeutung eines strikten Gatings basierend auf einer großen Anzahl von Ereignissen; Beide zeigen nur wenige Ereignisse, die nahe beieinander liegen, aber außerhalb der Farbkombinationstore. Diese Ereignisse könnten fälschlicherweise in die VI- und CF-Gatter einbezogen werden, die ausschließlich auf der Single-Well-Analyse basieren. Schließlich zeigen Abbildung 4F,H zwei verschiedene Beispiele von Familien, die auf mehrere Peaks verteilt sind, mit einem Beispiel für zwei ähnliche Intensitätspeaks (Abbildung 4F) und einem mit zwei ungleichen Intensitätspeaks (Abbildung 4H).

Abbildung 3: Peakdefinition für die durchflusszytometrische Analyse. (A-D) Peaks sollten definiert werden, die mindestens 500 Ereignisse registrieren, um eine gute Darstellung für jeden einzelnen Peak zu gewährleisten. (A) Histogramm für die CFSE-A-Intensität. Es können mehrere Peaks identifiziert werden, die jeweils einer anderen Population sich teilender Zellen entsprechen. (B,C) Histogramme für die Intensität des abgeleiteten Parameters, die das CFSE-CTV-Gemisch CV (B) bzw. VC (C) repräsentieren. (D) Histogramm für die CTV-A-Intensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Peak-Zuordnung . (A,B) Für diese Vertiefung kann nur ein Peak im CF-Gate nachgewiesen werden. (C,D) Zwei Peaks von nahezu gleicher Intensität können in diesem Bohrloch, im VI-Gatter, nachgewiesen werden. Die Spitzen sind gut aufgelöst. (E,F) Zwei Peaks vergleichbarer Intensität können in diesem Bohrloch, im VI-Gatter, nachgewiesen werden. Es wurden nur die Ereignisse im Tor berücksichtigt, basierend auf der Strategie, die mit den Bulk-Wells festgelegt wurde. (G-H) In diesem Bohrloch, im Gate CF, können zwei Peaks ungleicher Intensität nachgewiesen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Datendarstellung und statistische Tests
Abbildung 5 zeigt verschiedene Arten der Datendarstellung von zwei separaten Experimenten, die beide nach 72 Stunden Zellkultur durchgeführt wurden. HSCs und MPPs wurden in zwei verschiedenen Zellkulturmedien kultiviert, um die Zellteilungs- und Differenzierungseigenschaften zu verändern. Diese Medien werden als "Diff" (Differenzierung)32 und "GT"33 bezeichnet; Die erste fördert die Differenzierung von myeloiden und erythroiden Zellen, da sie Erythropoetin (EPO) und den granulo-monozytären koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) enthält, während die zweite im Rahmen klinischer Studien zur Gentherapie entwickelt wurde, mit dem Ziel, einen hohen Prozentsatz an HSPCs zu erhalten und zu amplifizieren. Abbildung 5A ist eine repräsentative Heatmap für den Zustand "Diff", die eine Vielzahl von Zellfamilien darstellt. sowohl bei Zellschicksalen als auch bei Zellteilungen. In dieser Heatmap repräsentiert jede Zeile eine einzelne Familie, jedes Quadrat eine einzelne Zelle, und die Spalten gruppieren alle Zellen, die sich in derselben Generation befinden (z. B. Zellen in Generation 2, die mindestens zweimal geteilt sind). Es ist möglich, sehr homogene Familien zu unterscheiden, die aus einem einzigen Zelltyp bestehen und die gleiche Anzahl von Unterteilungen aufweisen (z. B. Familie #63), und heterogene Familien, die drei Zelltypen über zwei Generationen hinweg umfassen (z. B. Familie #84). Da die zelluläre Wiederfindungsrate für diese Analyse bei etwa 70 % liegt, werden vollständige Familien, die dadurch definiert sind, dass alle ihre Zellen in möglicherweise verschiedenen Generationen wiederhergestellt wurden (z. B. eine Familie mit einer Zelle in Generation 1 und zwei Zellen in Generation 2), selten beobachtet (mit einem Hashtag neben ihrer ID-Nummer in Abbildung 5A). Es gibt mehrere Erklärungen für den unvollständigen Nachweis, die technischer Natur (Färbeprobleme, Zellverlust aufgrund des Protokolls) oder biologischer Natur (Zelltod und/oder Apoptose) sein können. Technische Einschränkungen können mit einem Analysator überwunden werden, der das mit der einzelnen Probe verbundene Totvolumen reduziert, und indem die Zellfärbung direkt in der Zellkulturplatte durchgeführt wird, um das Volumen beim Pipettieren zu reduzieren. Umgekehrt können orthogonale Methoden zur Bestimmung des Ausmaßes des Zelltods (z. B. durch bildgebende Experimente mit lebenden Zellen) helfen, die technischen und biologischen Faktoren zu unterscheiden, die zu einer unvollständigen Detektion führen.

Abbildung 5Bi zeigt, wie man den Einfluss der Kulturbedingung auf die Zelltypzusammensetzung visualisieren kann, als ob man einen Bulk-Assay durchgeführt hätte. Hier fördert die Diff-Bedingung eine größere Anzahl von Schicksalen und einen höheren Prozentsatz an CD34+ -Zellen (definiert als alle Zelltypen außer CD34-). Die Konfidenzintervalle werden im Skript über den einfachen Bootstrap mit 250.000 Bootstrapping-Datensätzen34 berechnet. Es ist erwähnenswert, dass alle anderen Histogramme in Abbildung 5 Konfidenzintervalle anzeigen, die auf die gleiche Weise berechnet wurden. Tabelle 5 fasst alle Informationen über die Anzahl der Familien und die Anzahl der Zellen in jeder Generation zusammen.

Abbildung 5Bii stellt die Ausgabe der statistischen Tests, die im Skript "2_bar_plot" durchgeführt wurden, grafisch dar. Eine formale Beschreibung des statistischen Rahmens liegt vor26. Kurz gesagt, dieser Rahmen ermöglicht statistische Hypothesentests unter der Annahme, dass Zellen derselben Familie abhängig sind (eine Annahme, die selbst überprüfbar ist), im Gegensatz zur klassischen Statistik, die eine Unabhängigkeit zwischen allen beobachteten Zellen erfordern würde. In dem in der Abbildung dargestellten speziellen Fall stellt der statistische Test die Hypothese in Frage, dass die Wahl des Zellschicksals von MPPs, gemessen als Häufigkeiten der verschiedenen in der Kultur vorhandenen Zelltypen, unabhängig von den verwendeten Zellkulturbedingungen ist. Zunächst wird die G-Test-Statistik verwendet, um die Diskrepanz zwischen Zelltyphäufigkeiten aus verschiedenen Zellmedien zu bewerten (für das Beispiel in Bii wird diese Statistik durch den roten Balken dargestellt). Anschließend erfolgt eine Randomisierung der Daten durch Permutation, bei der ganze Zellfamilien zwischen den beiden Zellkulturbedingungen ausgetauscht werden. Dies dient dazu, die Abhängigkeit zwischen familienbezogenen Zellen zu erhalten und gleichzeitig die Anzahl der Familien in jedem Satz mit den Originaldaten konsistent zu halten. Die G-Test-Statistik wird aus dem randomisierten Datensatz berechnet. Die blauen Werte, die in 5Bii dargestellt werden, sind die G-Test-Statistik für 250.000 Permutationen. Schließlich wird der p-Wert berechnet, um zu beurteilen, inwieweit der ursprüngliche Datensatz von der Verteilung der permutierten Datensätze abweicht. Im Beispiel weicht die ursprüngliche Statistik weitgehend von der Verteilung ab, was zu einem kleinen p-Wert führt und damit die Hypothese widerlegt, dass das Zellschicksal von MPPs unabhängig von den Kulturbedingungen ist.

Abbildung 5C zeigt den Prozentsatz der Zellfamilien pro maximaler Generation, um zu untersuchen, wie verschiedene Bedingungen die Zellteilung pro Zellfamilie verändern. Dieses Datendiagramm zeigt, dass die Zellen, die in der Diff-Bedingung kultiviert wurden, nach 72 h eine größere Anzahl von Teilungen, als die Zellen in der GT-Bedingung. Dargestellt wird die Anzahl der maximalen Generationen pro Familie, sodass eine Familie, die Zellen in den Generationen 1 und 2 aufweist, als Generation 2 betrachtet wird. Derselbe statistische Rahmen, der für Abbildung 5B verwendet wurde, kann verwendet werden, um die Unabhängigkeit zwischen Zellteilung und Kulturzustand statistisch zu testen.

Abbildung 5D untersucht die Art der Symmetrie/Asymmetrie der ersten Teilung für die verschiedenen Vorgängertypen (HSCs oder MPPs). Für die kompletten Zellfamilien der Generation 1 - der einzigen Generation, in der es möglich ist, die beiden Tochterzellen definitiv als Schwesterzellen zu etablieren - können vier verschiedene Arten von Symmetrie/Asymmetrie definiert werden: Die Bezeichnung "Sym Undiff" beschreibt Familien, in denen beide Töchter den Phänotyp der Ursprungszelle beibehalten. "Sym Diff" bedeutet, dass beide Töchter den gleichen Phänotyp haben, der sich von der Ursprungszelle unterscheidet. "Asym Undiff" bedeutet, dass eine Tochter nur den Phänotyp der Ursprungszelle beibehält. Schließlich beschreibt "Asym Diff" Familien, in denen beide Töchter unterschiedliche Phänotypen haben und keine von ihnen mit der Ursprungszelle identisch ist. Um statistische Aussagekraft bei der Beurteilung dieser symmetrischen/asymmetrischen Schicksale zu gewinnen, ist es wünschenswert, die MultiGen-Analyse zu frühen Zeitpunkten durchzuführen, um mehr Familien zu beobachten, deren Nachkommen in Generation 1 gefunden werden.

Schließlich stellt Abbildung 5E die Prozentsätze der Zelltypen in Abhängigkeit von der Anzahl der Teilungen dar, um Einblicke in den Verlauf des Differenzierungsmusters zwischen den Divisionen zu erhalten. Die in der Abbildung gezeigten Daten deuten beispielsweise darauf hin, dass die Zellen in den CD34-Zustand übergehen, wobei über 50 % der erkannten Zellen nach nur drei Teilung in diese Klasse übergehen. Darüber hinaus kann man daraus schließen, dass MPPs die Selbsterneuerungsteilung nicht begünstigen, da ein kleiner Prozentsatz der Zellen den ursprünglichen Phänotyp beibehält. Einige dieser Schlussfolgerungen können dann anhand des in den vorherigen Abbildungen dargestellten statistischen Rahmens überprüft werden.

Abbildung 5: Beispiel für die Datendarstellung für ein 72-h-Experiment mit Nabelschnurblut-HSPCs. (A) Heatmaps für einen ausgewählten Datensatz (HSC, im "Diff"-Medium, nach 72 h Kultur). Die Diagramme stellen alle einzelnen Zellen (Quadrate) entsprechend ihrer Verwandtschaft (Zeilen), der Anzahl der durchgeführten Unterteilungen (Spalten, Generation genannt) und ihrem Phänotyp (Farben) dar. (BI) Histogramm, das die Anteile der Zelltypen der Zellnachkommen von HSCs und MPPs zwischen der Bedingung GT und der Bedingung Diff vergleicht. (Bii) Die Grafik zeigt die statistischen Tests, die im "2_bar_plot"-Skript für MPPs nach 72 Stunden Kultur durchgeführt wurden, wobei der "Diff"- und der "GT"-Zytokin-Cocktail verglichen wurde. Der experimentelle Wert wird in Rot dargestellt, die über 250.000 Permutationen generierten Werte in Blau. Der p. -Wert des G-Tests wird in der oberen rechten Ecke mit der Anzahl der für den Test verwendeten Familien angezeigt. (C) Histogramm zum Vergleich des Prozentsatzes der Familien (insgesamt 314 Familien) in jeder Generation (farbkodiert) für HSCs und MPPs pro Kulturzustand. Die Konfidenzintervalle werden mit 250.000 Bootstrap-Datasets berechnet. (D) Histogramm, das die Art der Symmetrie/Asymmetrie zwischen dem Schicksal der Tochterzellen für die Familien mit zwei Zellen in Generation 1 darstellt: Sym Undiff (beide Töchter behalten den Phänotyp der Ursprungszelle bei), Sym Diff (beide Töchter haben den gleichen Phänotyp, und er unterscheidet sich von der Ursprungszelle), Asym Undiff (nur eine Tochter behält den Phänotyp der Ursprungszelle bei), und Asym Diff (beide Töchter haben unterschiedliche Phänotypen und keine von ihnen ähnelt der Ursprungszelle). (E) Histogramme des Beitrags der pro Generation klassifizierten Zelltypen für MPPs, die mit dem "Diff"-Cocktail kultiviert wurden; n = 204 Zellen und 97 Familien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 5: Beschreibung der Anzahl der untersuchten Familien und Zellen pro Versuchsbedingung (Ursprungszelle und Zellkulturmedium). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht, der für diese Arbeit relevant ist. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -interpretation oder der Entscheidung, die Arbeit zur Veröffentlichung einzureichen.