Name: Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur simultanen Analyse von Zellteilungen, Oberflächenphänotyp und Verwandtschaft bei hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen mit minimaler Manipulation.

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Wir bedanken uns bei den Mitgliedern des Institut Curie Flow Facility für ihre Hilfe beim Aufbau der Durchflusszytometrie-Experimente. Wir möchten auch die Beiträge der anderen Mitglieder des Team Perié in mehreren Diskussionen würdigen. Wir danken Dr. Julia Marchingo und Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) für die Bereitstellung ihres Protokolls zum Multiplexing von Zellteilungsfarbstoffen auf Lymphozyten. Wir danken der Nabelschnurblut-Biobank des Saint Louis Krankenhauses für die Bereitstellung der biologischen Ressourcen, die für die Entwicklung dieses Protokolls erforderlich sind. Die Studie wurde durch ein ATIP-Avenir-Stipendium des CNRS und der Bettencourt-Schueller-Stiftung (an L.P.), Zuschüsse des Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (an L.P. und A.D.), das Idex Paris-Science-Lettres-Programm (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (an L.P.), das Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, an L.P.) und das ITMO MIIC-Stipendium (21CM044, an L.P.) unterstützt. Neben der Förderung durch den Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union ERC StG 758170-Microbar (to L.P.) wurde A.D. durch ein Stipendium der Fondation de France unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht, der für diese Arbeit relevant ist. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -interpretation oder der Entscheidung, die Arbeit zur Veröffentlichung einzureichen.

Der MultiGen-Assay ist ein einfach durchzuführender und kostengünstiger Hochdurchsatz-Assay, der maßgeblich zur Untersuchung von Lymphozyten 23,24,35 und murinen hämatopoetischen Zellen 26,27 beigetragen hat. In dieser Arbeit stellen wir eine neue Entwicklung des Ansatzes vor, der es ermöglicht, ex vivo die frühe Phase des humanen HSPC-Engagements auf Einzelzellebene mit Hilfe von Kurzzeitkulturen zu entschlüsseln (Abbildung 6). Einzelzellige Ex-vivo-Kultursysteme werden in der Regel verwendet, um den langfristigen Verbleib von HSPCs in reife Zellen zu beurteilen, aber einige Schicksale treten früher auf als andere36, was die Analyse möglicherweise in Richtung weniger Schicksale verzerrt. Hinzu kommt, dass diesen Kultursystemen in der Regel Informationen über Spaltungen während der Schicksalsbindung fehlen. Es hat sich gezeigt, dass die ersten Verpflichtungsschritte bereits zu Beginn der Kultur stattfinden, manchmal ohne Teilung26,37, was eine kurzfristige Kultur und die Verfolgung der Teilung unerlässlich macht, um die frühe Schicksalsbindung zu untersuchen. Durch die gleichzeitige Verfolgung des Schicksals, der Teilung und der Verwandtschaft ermöglicht dieser Assay es, die Rolle der ersten Teilung und der Schicksalsentscheidung in menschlichen HSPCs zu verstehen. Mit dem Assay ist es möglich, abzuleiten, nach wie vielen Teilung der Bindungsprozess stattfindet, wie das Gleichgewicht zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung für diese frühen Vorfahren ist und wie diese Eigenschaften über Generationen hinweg vererbt werden. Unseres Wissens nach ist dies der einzige Assay, der diese Art von Messungen für menschliche HSPCs mit Einzelzellauflösung ermöglicht. Darüber hinaus haben wir durch die Verwendung verschiedener Kombinationen von Zellteilungsfarbstoffen den Durchsatz der Analyse erhöht, was diesen Assay zu einem wertvollen Werkzeug für die schnelle Generierung großer Datensätze macht. Die Farbstoffkombinationen ermöglichen es, mehrere Familien in denselben Vertiefungen zu verfolgen, wodurch die Anzahl der Zellen, die für die Analyse in Kurzzeitkultur zur Verfügung stehen, erhöht wird. Die Anzahl der Kombinationen könnte durch die Zugabe anderer Farbstoffe (z. B. gelber Farbstoff) oder die Änderung des Verhältnisses von CFSE und CTV möglicherweise noch weiter erhöht werden. Dies reduziert jedoch die Anzahl der anderen Parameter, die analysiert werden können.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64918/64918fig06.jpg"> Abbildung 6: Schematische Darstellung des Protokolls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64918/64918fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Um die Analyse erfolgreich durchzuführen, ist es aufgrund der großen Anzahl von Wells und der reduzierten Anzahl der zu analysierenden Zellen notwendig, die Durchflusszytometrie-Analyse auf einem Analysator durchzuführen, der mit einem Plattenlesegerät ausgestattet ist. Die neue Generation von Laboranalysatoren ist besonders auf diesen Assay abgestimmt, da die meisten von ihnen ein kleineres Totvolumen haben, um den prozentualen Zellverlust zu reduzieren. Dies wiederum garantiert eine höhere Effizienz bei der Rückgewinnung der gesamten Bohrung, was zu einem Wirkungsgrad führt, der im Bereich von 70 % geschätztwird 26. Die Abschätzung des Zellverlustes während der durchflusszytometrischen Erfassung ist entscheidend für die Analyse jeder einzelnen Familie. Unter der Annahme, dass kein Zelltod vorliegt und die Anzahl der Teilungen gezählt wird, ist es beispielsweise möglich, die Anzahl der Zellen pro Familie zu schätzen. Nichtsdestotrotz ist es wünschenswert, einige Bestätigungsexperimente durchzuführen, insbesondere zur Abschätzung des Zelltods unter den getesteten Kulturbedingungen und zur experimentellen Messung der Wiederfindungsrate unter Verwendung einer definierten Anzahl von Zellen.
Einer der entscheidenden Schritte dieses Protokolls ist die Peak-Zuweisung. Wie bereits erwähnt, hängt eine qualitativ gute Peakverteilung stark von der Isolierung sehr schmaler Peaks bei der Zellsortierung ab. Dennoch ist es immer noch schwierig, die richtige Anzahl von Divisionen anhand der Verteilung eindeutig zuzuordnen. Da die Zellsortierung und die Durchflusszytometrie auf zwei verschiedenen Geräten durchgeführt werden, ist es nicht möglich, die Intensität der einzelnen Signale direkt zu vergleichen, so dass es schwierig sein kann zu wissen, ob der erste Peak, der am rechten Ende des Histogramms beobachtet wird, Peak 0 oder Peak 1 ist. In dieser Hinsicht sind nur wenige Lösungen möglich; Eine Möglichkeit besteht darin, ein orthogonales Experiment durchzuführen, um die Anzahl der von diesen Zellen durchgeführten Teilungen genau zu messen (z. B. Bildgebung lebender Zellen). Eine andere Möglichkeit besteht darin, einfach die Anzahl der Zellen im Well unter einem inversen Hellfeldmikroskop zu zählen, bevor die durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird. Daraus lässt sich eine durchschnittliche Anzahl von Teilungen ableiten (unter der Annahme, dass kein Zelltod stattfindet). Eine Post-hoc-Lösung für die Peak-Zuweisung ist schließlich die Erkennung einer ungewöhnlichen Anzahl von "unmöglichen Familien"; Diese Familien bestehen aus einer größeren Anzahl von Zellen pro Generation als möglich (z. B. fünf Zellen in Generation 2 oder zwei Zellen in Generation 1 und eine Zelle in Generation 2). Die Möglichkeit, unmögliche Familien auszuschließen, wird im Schritt der statistischen Analyse kodiert und kennzeichnet die unmögliche Familie. Ist das Auftreten dieser Fehler zu hoch, ist davon auszugehen, dass die Peak-Zuordnung überarbeitet werden muss.
In dieses Protokoll haben wir einige Beispiele für die Datendarstellung und -analyse für den Assay aufgenommen, da dies zu einem wesentlichen Schritt bei der Generierung und Interpretation großer Datensätze gewordenist 38. Das erste Beispiel ist die Heatmap, die die Gesamtheit aller analysierten Zellen zeigt, geordnet nach Familien. Dies ist ein effizientes Werkzeug, um die allgemeinen Eigenschaften der Daten und mögliche Schlussfolgerungen zu untersuchen: Bestehen Familien aus mehreren Zelltypen oder sind sie tendenziell homogen in ihrer Zusammensetzung? Sind Familien über mehrere Generationen verteilt oder teilen sie sich meist gleich oft? Diese explorative Analyse muss dann durch spezifischere Diagramme und statistische Tests ergänzt werden. Es kann verwendet werden, um symmetrische und asymmetrische Schicksalsbindung, Differenzierung ohne Teilung, die Balance zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung und die Anzahl der Teilung für ein bestimmtes Bindungsschicksal quantitativ zu bewerten. Bei der Versuchsplanung ist es von grundlegender Bedeutung, die Länge der Zellkultur entsprechend der Art der gestellten Fragestellung einzustellen. Für die ersten beiden Fragen (symmetrische/asymmetrische Balance und Differenzierung ohne Teilung) ermöglicht beispielsweise die Planung sehr kurzer Kulturschritte die Isolierung einer großen Anzahl von Familien, die nur eine oder gar keine Teilung durchgeführt haben26. Umgekehrt ermöglichen längere Experimente die Untersuchung der Anzahl der Teilungen, die für eine bestimmte Zellbindung erforderlich sind, da sie Familien in verschiedenen Stadien der Differenzierung beproben. Diese Methode ist jedoch nicht für Langzeitkulturen (2-3 Wochen) ausgelegt, da die Zellfarbstoffverdünnung nicht in der Lage ist, mehr als sieben oder acht Teilungen genau zu verfolgen22. Infolgedessen ist dieses Werkzeug hauptsächlich für die Untersuchung der frühen Bindung hämatopoetischer Vorläuferzellen geeignet und nicht darauf ausgelegt, robuste Schlussfolgerungen über die langfristigen Differenzierungseigenschaften dieser Zellen zu ziehen.
Der statistische Rahmen wurde speziell für die Analyse dieser Art von Daten entwickelt und basiert auf dem Konzept der Permutationen26. Dies war notwendig, da eine familiäre Abhängigkeit von der Zelltypverteilung und von der Anzahl der durchgeführten Teilungen beobachtet wurde. Mit anderen Worten, Zellen, die Teil derselben Familie sind, weisen mit größerer Wahrscheinlichkeit ähnliche Phänotypen auf und teilen sich gleich oft. Obwohl eine eingehende Analyse den Rahmen dieser Arbeit sprengen würde, sollten die bereitgestellten statistischen Tests für die Bewertung verschiedener Bedingungen ausreichen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug darstellt, um die zelluläre Dynamik von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ex vivo schnell und kostengünstig zu beurteilen. Aufgrund seiner Flexibilität und Vielseitigkeit in Bezug auf Zeitpunkt, Kulturbedingungen und Art der analysierten HSPCs ermöglicht es das Testen einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen. Als durchflusszytometrischer Assay kann er in den meisten Laboren eingesetzt werden und erfordert keine umfangreichen Vorkenntnisse, was ihn zu einem guten Kandidaten für Screenings und Pilotexperimente macht.

Das vergangene Jahrzehnt war geprägt von der weltweiten Verbreitung von Einzelzellansätzen in der Zell- und Molekularbiologie. In Anlehnung an die Einzelzellgenomik1,2 ist es heute möglich, viele Komponenten einer einzelnen Zelle (z. B. DNA, RNA, Proteine) zu untersuchen, wobei jedes Jahr neue Einzelzell-Omics-Techniken entstehen. Diese Techniken haben alte und neue Fragestellungen für die Bereiche Immunologie, Neurobiologie, Onkologie und andere Bereiche beleuchtet, sowohl mit menschlichen als auch mit Modellorganismuszellen3. Durch die Hervorhebung der Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen führte die Einzelzell-Omik zur Definition eines neuen Modells der Hämatopoese, das sich auf die Heterogenität hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) konzentrierte und sich vom klassischen Modell diskreter homogener Populationen entfernte 4,5.
Einer der wenigen Nachteile aller -omics-Techniken ist die Zerstörung der interessierenden Zelle, was die Möglichkeit ausschließt, ihre Funktionalität zu beurteilen. Umgekehrt liefern andere Einzelzellmethoden, wie z. B. Einzelzelltransplantations-Assays und Lineage-Tracing-Technologien, ein Auslesen der Funktionalität der Vorfahrzelle, indem sie das Schicksal einzelner Zellen in vivo beurteilen 6,7. Bei der Abstammungsverfolgung wird die interessierende Zelle mit einer vererbbaren genetischen7 oder einer fluoreszierenden Markierung8,9 markiert, so dass das Schicksal mehrerer Einzelzellen gleichzeitig verfolgt werden kann. Die Charakterisierung der Ausgangszellen ist jedoch in der Regel auf eine begrenzte Anzahl von Parametern beschränkt, wie z.B. die Expression einiger Oberflächenproteine, die mittels Durchflusszytometrie beurteiltwerden 10. Darüber hinaus erfordern Technologien zur Rückverfolgung von Einzelzelllinien eine aufwändige Detektion der zellulären Markierung, in der Regel durch DNA/RNA-Sequenzierung oder Bildgebung. Gerade dieser letzte Punkt schränkt die Anzahl der Bedingungen ein, die in einem einzigen Experiment getestet werden können.
Eine weitere Klasse von Methoden, die zur Untersuchung der Funktionalität einzelner Zellen verwendet werden, sind Ex-vivo-Zellkultivierungssysteme einzelner HSPCs. Diese Goldstandard-Assays sind einfach durchzuführen und beinhalten die Sortierung einzelner Zellen in 96-Well-Zellkulturgefäße und nach der Kultivierung die Charakterisierung des Phänotyps der Zellnachkommen, typischerweise durch Durchflusszytometrie oder morphologische Analyse. Diese Assays wurden hauptsächlich verwendet, um die langfristige Differenzierung von HSPCs in reife Zellen zu charakterisieren, typischerweise nach 2-3 Wochen Kultur11,12. Alternativ wurden sie verwendet, um zu versuchen, ex vivo HSPCs 13,14,15,16,17,18 zu erhalten und zu erweitern, mit dem Versprechen eines medizinischen Nutzens für die Transplantation menschlicher Stammzellen 19. Schließlich wurden sie verwendet, um die frühe Bindung von HSPCs unter Verwendung der Kurzzeitkultur20 zu untersuchen, wobei die geringe Anzahl von Zellen, die in dieser Kultur erzeugt wurden, der wichtigste limitierende Faktor war. Ein Nachteil dieser verschiedenen Arten von Ex-vivo-Assays ist, dass sie die In-vivo-Komplexität nur teilweise widerspiegeln. Dennoch sind sie eine der seltenen Möglichkeiten, die menschliche HSPC-Differenzierung zu untersuchen.
Eine fehlende Information aus bestehenden Einzelzellmethoden (Einzelzell-Omics, Lineage Tracing und Ex-vivo-Kultur) ist der genaue Nachweis von Zellteilungen, ein wesentlicher Parameter, der bei der Untersuchung der HSPC-Dynamik berücksichtigt werdenmuss 21. Eine einfache Möglichkeit, die Anzahl der Teilungen mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen, ist die Verwendung löslicher "Proteinfarbstoffe" wie dem 5-(und 6)-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE)22. Diese Teilungsfarbstoffe diffundieren im Zytoplasma der gefärbten Zellen, werden um die Hälfte verdünnt und bei jeder Zellteilung an die beiden Tochterzellen weitergegeben, so dass bis zu 10 Teilungen gezählt werden können. Durch die Kombination mehrerer Teilungsfarbstoffe ist es möglich, mehrere einzelne Vorläuferzellen in derselben Vertiefung zu besiedeln, da jeder einzelne Farbstoff die Trennung der verschiedenen Nachkommen ermöglicht. Dies ist das Prinzip hinter der Verwendung von Zellfarbstoffen für die klonale Multiplex- und Teilungsverfolgung, das erstmals für murine Lymphozyten eingeführt wurde23,24.
Hier stellen wir die Entwicklung des MultiGen-Assays für den Einsatz mit murinen und humanen HSPCs vor. Es ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung vieler Einzelzellen auf ihre Eigenschaften der Differenzierung, Teilung und Verwandtschaft ex vivo. Dieser einfach durchzuführende und kostengünstige Hochdurchsatz-Assay ermöglicht es, den zellulären Phänotyp, die Anzahl der durchgeführten Teilungen sowie die Zellverwandtschaft und klonale Beziehung zu den anderen Zellen im Well gleichzeitig zu messen. Es kann verwendet werden, um symmetrische und asymmetrische Schicksalsbindung, die Balance zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung und die Anzahl der für ein bestimmtes Bindungsschicksal erforderlichen Teilung quantitativ zu bewerten. Das Protokoll erfordert einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) und ein Durchflusszytometer mit einem Plattenlesegerät sowie die für die Durchführung der Zellkultur erforderliche Ausrüstung. Neben dem technischen Protokoll für die Durchführung des Assays an humanen HSPCs stellen wir auch den detaillierten Analyserahmen zur Verfügung, einschließlich der statistischen Tests, die zur Bewertung der zellulären Eigenschaften im Zusammenhang mit dem Konzept der Zellfamilie25 erforderlich sind. Dieses Protokoll wurde bereits erfolgreich zur Beschreibung des murinen HSPC-Kompartiments26,27 verwendet.
Das folgende Protokoll verwendet magnetisch angereicherte CD34+ -Zellen als Ausgangsmaterial28. Auf diese Weise ist es möglich, die humanen HSPCs aus verschiedenen Blutquellen (z.B. Nabelschnurblut, Knochenmark, peripheres Blut) effizient zu färben und zu isolieren. Es ist wichtig, die CD34-Fraktion nicht zu verwerfen, da sie als Teil des Protokolls verwendet wird, um verschiedene Arten von experimentellen Kontrollen einzustellen. Die genannten Zellmengen und -volumina können je nach experimentellem Arbeitsablauf und Bedarf vergrößert oder verkleinert werden. In ähnlicher Weise kann das Protokoll an die Untersuchung verschiedener Arten von Vorläuferzellen angepasst werden, indem einfach die Antikörper modifiziert werden, die für die Zellsortierung und Durchflusszytometrie verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>vWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Polypropylenröhrchen</td><td>vWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polypropylenröhrchen</td><td>vWR</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Kulturplatte mit U-Boden</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human Lin APC</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-7776-72</td><td>Verdünnung 1/40</td></tr><tr><td>ARIA III</td><td>BD</td><td></td><td>Kann durch jeden FACS-Sortierer ersetzt werden, der in der Lage ist, einzelne Zellen in 96-Wells-Platten zu sortieren</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)</td><td>Life Technologies</td><td>C34570</td><td></td></tr><tr><td>Zellspurenviolett (CTV)</td><td>Life Technologies</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>Kompensationsperlen&nbsp;</td><td>BD</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62948-36</td><td>Bereiten Sie eine Lösung 0,5 M in sterilisiertem Wasser</td></tr><tr><td>vor FC-Block Fc1.3216</td><td>BD</td><td>564220</td><td>Verdünnung 1/50</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Dutscher</td><td>S1900-500C</td><td>Batch S00CH</td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD10 PerCP-5.5, Klon HI10a</td><td>Biolegend</td><td>312216</td><td>Verdünnung 1/20</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD123 BUV395, Klon 7G3</td><td>BD</td><td>564195</td><td>Verdünnung 1/15</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD34 APC-Cy7, Klon 581</td><td>Biolegend</td><td>343513</td><td>Verdünnung 1/40</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD38 BV650, Klon HB7</td><td>Biolegend</td><td>356620</td><td>Verdünnung 1/40</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD45RA AF700, Klon HI100</td><td>BD</td><td>560673</td><td>Verdünnung 1/20</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD45RA PE-Cy7, Klon HI100</td><td>BD</td><td>560675</td><td>Verdünnung 1/20</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch CD90 PE, Klon 5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>Verdünnung 1/20</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1X</td><td>Life Technologies</td><td>10010001</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 12x75 mm konische Polypropylen-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZE5&nbsp;</td><td>Biorad</td><td></td><td>Kann durch jedes Durchflusszytometrie-Analysegerät ersetzt werden, das mit einem Plattenleser ausgestattet ist</td></tr><tr><td>Labor vorbereitet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturmedien</td><td></td><td></td><td>Abhängig vom jeweiligen Experiment. Täglich frisch zubereiten und bei +4 Grad lagern; C bis zur Verwendung</td></tr><tr><td>DMEM + 10% FBS</td><td></td><td></td><td>Kann unter sterilen Bedingungen gelagert werden, bei +4 &Grad; C bis zu 1 Jahr. Um 500 mL zuzubereiten, fügen Sie 50 mL FBS zu 450 mL DMEM</td></tr><tr><td>PBS 1X + EDTA 0,1</td><td></td><td></td>% <td>hinzuKann unter sterilen Bedingungen, bei Raumtemperatur, bis zu 1 Jahr gelagert werden. Zur Herstellung von 500 mL fügen Sie 3,42 mL EDTA 0,5 M zu 500 mL hinzu PBS 1X</td></tr><tr><td>Färbepuffer</td><td></td><td></td><td>Kann unter sterilen Bedingungen bei +4 &° gelagert werden; C bis zu 1 Jahr. Um 500 mL zuzubereiten, fügen Sie 2 mL EDTA 0,5 M und 1 mL FBS zu 500 mL PBS 1X</td></tr></tbody></table> hinzu

simultane beurteilung von verwandtschaft, teilungszahl und phänotyp mittels durchflusszytometrie für hämatopoetische stamm- und vorläuferzellen

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Nur wenige Techniken sind in der Lage, Phänotyp und Schicksal derselben Zelle gleichzeitig zu beurteilen. Die meisten der derzeit verwendeten Protokolle zur Charakterisierung des Phänotyps sind zwar in der Lage, große Datensätze zu generieren, erfordern jedoch die Zerstörung der interessierenden Zelle, was es unmöglich macht, ihr funktionelles Schicksal zu beurteilen. Heterogene biologische Differenzierungssysteme wie die Hämatopoese sind daher schwer zu beschreiben. Aufbauend auf Zellteilungs-Tracking-Farbstoffen haben wir ein Protokoll weiterentwickelt, um gleichzeitig Verwandtschaft, Teilungszahl und Differenzierungsstatus für viele einzelne hämatopoetische Vorläuferzellen zu bestimmen. Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung des ex vivo Differenzierungspotentials von murinen und humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen, die aus verschiedenen biologischen Quellen isoliert wurden. Da es auf Durchflusszytometrie und einer begrenzten Anzahl von Reagenzien basiert, kann es außerdem schnell und relativ kostengünstig eine große Datenmenge auf Einzelzellebene generieren. Wir bieten auch die analytische Pipeline für die Einzelzellanalyse, kombiniert mit einem robusten statistischen Rahmenwerk. Da dieses Protokoll die Verknüpfung von Zellteilung und -differenzierung auf Einzelzellebene ermöglicht, kann es verwendet werden, um symmetrische und asymmetrische Schicksalsbindung, die Balance zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung und die Anzahl der Teilung für ein bestimmtes Bindungsschicksal quantitativ zu bewerten. Insgesamt kann dieses Protokoll in experimentellen Designs verwendet werden, die darauf abzielen, die biologischen Unterschiede zwischen hämatopoetischen Vorläuferzellen aus der Einzelzellperspektive zu entschlüsseln.

Hier wird eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik vorgestellt, die es ermöglicht, gleichzeitig die Anzahl der Zellteilungen, den Phänotyp der Oberflächenzellen und die zelluläre Verwandtschaft zu messen. Diese Eigenschaften können statistisch mit einem auf Permutation basierenden Framework getestet werden.

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Nur wenige Methoden erlauben es, die Funktionalität hämatopoetischer Vorläuferzellen schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll misst den Einfluss der ersten Zellteilungen auf das Zellschicksal und die Zellbindung. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Messung von Teilung und Differenzierung auf Einzelzellebene und mit hohem Durchsatz, ohne dass eine komplexe und umfangreiche Manipulation erforderlich ist.Diese Methode eignet sich für jede hämatopoetische Population, die in Kultur erhalten werden kann. Es kann also leicht auf die Krebsbiologie, Immunologie und Entwicklungsbiologie angewendet werden. Zu Beginn werden 250 Mikroliter der CD34+-Fraktion gleichmäßig in vier 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen aliquotiert.Beschriften Sie die Röhrchen wie im Textmanuskript beschrieben. 250 Mikroliter der CD34-Fraktion in weitere vier 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen aliquotieren und die Röhrchen etikettieren. Bereiten Sie CFSE-High- und CSFE-Low-Lösungen vor, wie im Textmanuskript beschrieben.Geben Sie 250 Mikroliter der CFSE-High-Lösung in den CF- und CV-Schlauch, 250 Mikroliter der CFSE-Low-Lösung in den VC-Schlauch und 250 Mikroliter Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ohne fetales Kälberserum (FBS) in den VI-Schlauch. Um eine effiziente Mischung der Zellsuspension im Zellfarbstoff zu gewährleisten, neigen Sie das Röhrchen um 90 Grad und scheiden Sie die CFSE-Lösungen an der Röhrchenwand ab. Halten Sie dann das Röhrchen senkrecht und mischen Sie drei- oder viermal, um eine schnelle Vermischung der CFSE-Lösungen mit den resuspendierten Zellen zu gewährleisten.Inkubieren Sie die Suspension acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nach der Inkubation fünf Milliliter DMEM mit 10 % FBS hinzu und stellen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang auf 37 Grad Celsius. Drehen Sie die Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang.Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration, ohne das Pellet zu stören, und waschen Sie das Pellet mit fünf Millilitern PBS, ETDA. Drehen Sie die Röhrchen erneut und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 40 Mikrolitern PBS, ETDA, resuspendieren. Um die CD34+-Zellen zu färben, bereiten Sie eine Mastermischung von Antikörpern in einem einzigen 0,5-Milliliter-Röhrchen vor.Fügen Sie sieben Mikroliter aus dem Antikörper-Mastermix zu jeder der vier CD34+-Bedingungen hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen im Färbepuffer mit jeweils ca. 500 Mikrolitern für die Beads in CD34+-Zellen und einem Milliliter für die CD34-Röhrchen. Legen Sie für die Zellensortierung die Gating-Strategie fest, indem Sie Punktdiagramme erstellen.Visualisieren Sie zunächst die Zellen in einem FSCA- und SSCA-Punktdiagramm und doppelklicken Sie auf das Polygon-Gating-Werkzeug, um die Grundgesamtheit mit geringer Seitenstreuung auszuwählen. Beschriften Sie dieses neu erstellte Gate als Zellen. Klicken Sie im folgenden Punktdiagramm FSCA versus FSCH mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und wählen Sie das Tor Zellen aus dem Dropdown-Menü aus, indem Sie darauf klicken.Verwenden Sie dasselbe Anschnittwerkzeug, um eine enge Population auf der Diagonalen zwischen den beiden Achsen auszuwählen. Beschriften Sie dieses Gate als einzelne Zellen. Im dritten Punktdiagramm (APC vs. FSH-H) werden die Einzelzellen der Grundgesamtheit dargestellt und die Zellen negativ für die Expression der APC-Abstammung bestimmt.Kennzeichnen Sie diese neu erstellte Population als "Lineage Negative". Im vierten Diagramm (CFSE vs. CTV) wird die negative Abstammungslinie der Population angezeigt, und es werden vier separate Gatter erstellt, eines für jede Farbstoffkombination. Tor VI ist hier als Beispiel dargestellt.Verwenden Sie das fünfte und sechste Diagramm, um die Vorläufer von Interesse zu identifizieren. Großzügiges Gate CD34+CD38-Population und die CD34+CD38+ im fünften Diagramm. Wählen Sie dann die CD34+CD38-Population im sechsten Diagramm aus und zeichnen Sie drei Gatter für LMPP, HSC und MPP.Führen Sie CD34+-Brüche aus und zeichnen Sie mindestens 5.000 Ereignisse im Einzelzellen-Gate auf. Passen Sie das Gate für jede Farbkombination an und stellen Sie ein enges Gate ein, um eine homogene Population auszuwählen. Bereiten Sie die Vorlage für die Plattensortierung mithilfe des Layouts "Experimentsortierung" vor.Die Vertiefungen mit der Bezeichnung CD34-enthalten 5.000 bis 10.000 Zellen, die nach dem CF-, CV-, VC- und VI-Gatter sortiert sind. Die Bulk-Wells enthalten 500 Zellen, die auf dem Gate CD34+CD38-Wells sortiert sind. Die Single-Cell-Wells enthalten nur ein Ereignis pro Zellteilungsfarbstoffkombination pro Well, also insgesamt vier Ereignisse pro Well. Beginnen Sie als Nächstes mit der Sortierung des CD34-CF im Modus "Yield Purity".Klicken Sie auf die Schaltfläche Erwerben und dann auf die Schaltfläche Sortieren. Klicken Sie auf Erwerben und dann auf die Schaltfläche Sortieren, um sicherzustellen, dass Sie 0160 als Reinheitsgrad angekreuzt haben. Sortieren Sie schließlich die interessierenden Zellen, eine Zelle pro Well, in Einzelzellreinheit und stellen Sie sicher, dass Sie die Option Indexsortierung aktiviert haben.Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 300 g und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell unter der Haube über ein Papiertuch drehen. Geben Sie acht Mikroliter stehenden Puffer in die Vertiefungen A1 bis A4 und anschließend acht Mikroliter der Mischung in die anderen Vertiefungen. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter Färbepuffer pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen.Zentrifugieren und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 85 Mikrolitern Färbepuffer resuspendieren. Starten Sie die Analyse auf dem Durchflusszytometer im Erfassungsmodus, indem Sie die entsprechende Vorlage verwenden und auf Benutzerdefiniert klicken. Nachdem Sie die gewünschten Fluorophore aus der Liste ausgewählt haben, stellen Sie den Plattenaufbau entsprechend der Plattenvorlage ein, die um die Anzahl der Vertiefungen korrigiert ist, die mindestens eine Zelle enthalten.Aktivieren Sie die Option Rühren und wählen Sie 100 Mikroliter als Begrenzung des Erfassungsvolumens. Stellen Sie dann die Erfassungsrate auf nicht mehr als einen Mikroliter pro Sekunde ein, da eine niedrigere Geschwindigkeit das pro Well analysierte Gesamtvolumen verbessert. Für ein repräsentatives Gating verketten Sie die verschiedenen Bulk-Wells in einer einzigen Datei.Klicken Sie auf Extras und Parameter ableiten, um den transformierten Wert zu erhalten. Fügen Sie die angegebene Formel in das Formelfeld ein. Wenden Sie das Gating auf jede Farbe einzeln als Histogrammdiagramm an.Stellen Sie für CF und VI CFSE-A bzw. CTV-A auf der X-Achse ein. Legen Sie für CV und VC den neu abgeleiteten Parameter auf der X-Achse fest und legen Sie dann die Gatter für jeden Peak fest. Wenden Sie die Anspritzung auf jede einzelne einzelne Zelle an.Stellen Sie sicher, dass Sie den abgeleiteten Parameter zu jedem analysierten Well hinzufügen. Überprüfen Sie manuell jedes Farbtor für jedes Well, um Ereignisse zu erkennen, die fälschlicherweise einem bestimmten Peak zugeordnet sind. Die durchflusszytometrische Analyse nach der Zellkultur erfordert ein präzises Gating, um die Verwandtschaft jeder einzelnen Zelle zusammen mit der zellulären Phänotypisierung festzustellen.Die Definition und Zuordnung von Peaks sind entscheidende Aspekte der Durchflusszytometrie. Die Histogramme zeigen zwei Beispiele für Familien, die auf mehrere Peaks verteilt sind, eines mit zwei ähnlichen Intensitätspeaks und eines mit zwei unterschiedlichen Intensitätspeaks. Verschiedene Arten der Datendarstellung und statistischen Tests werden hier für zwei separate Experimente gezeigt, die nach 72 Stunden für HSCs und MPPs durchgeführt wurden.Die Heatmap für die Bedingung HSC-Differenzierung repräsentiert verschiedene Zellfamilien, sowohl im Zellschicksal als auch in der Zellteilung. Das Histogramm, das den Verbleib von HSCs und MPPs abgeleiteten Zellfamilien vergleicht, ist hier dargestellt. Für beide Zelltypen wird der Vergleich zwischen der Bedingung GT und der Bedingungsdifferenzierung zusammen mit den statistischen Tests für MPPs angezeigt.Hier werden Histogramme gezeigt, die den Prozentsatz der Zellfamilien pro Generation und die Art der Symmetrie oder Asymmetrie des Schicksals für die erste Teilung vergleichen. Die Verteilung der Schicksale pro Generation für MPPs und die Bedingungsdifferenzierung sind hier dargestellt. Dieses Verfahren erfordert die Isolierung von Zellen in großen Mengen, um die geeignete Gating-Strategie festzulegen.Es ist daher besser, die Färbung mit mindestens 10.000 Zellen zu beginnen. Die Kombination dieser Methode mit kontinuierlichen Messungen, wie z. B. der Bildgebung lebender Zellen, kann sehr leistungsfähig sein, da beide zusammen eine detaillierte Beschreibung der frühen Vorläuferzellen der Zelldynamik liefern können. Dieser Ansatz wurde erstmals von den Hopkins Labs für die T-Zell-Biologie entwickelt.Diese Version, die für Blutstammzellen angepasst wurde, wird nun auf die Krebs- und Stammzellbiologie ausgeweitet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

RNA-Sequenzierung und Bioinformatik-Analysen wurden verwendet, um deutlich und differentiell exprimiert Transkriptionsfaktoren in Lin-CD34 + und Lin-CD34- Subpopulationen von Maus EMLcells identifizieren. Diese Transkriptionsfaktoren könnten eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Wechsel zwischen Selbsterneuerung Lin-CD34 + und teilweise differenziert Lin-CD34- Zellen spielen.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Einrichtung kompetitiver Knochenmarktransplantationsexperimente an Mäusen, um die Funktion hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen ohne vorherige Reinigung von Stammzellen durch Zellsortierung zu untersuchen.

Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung

Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Quantifizierung der Spender gewonnenen Zellen ist erforderlich, um Engraftment nach Stammzelltransplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien überwachen. Eine Kombination von Flow Cytometry-basierte Zellsortierung Kolonie Bildung Assay und anschließende Analyse von kurzen Tandem, die wiederholt verwendet werden, um die Verbreitung zu beurteilen und Differenzierung im Fach erythroiden Vorläuferzellen.

Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Hier beschreiben wir eine neuartige durchflusszytometrische Methode zur prospektiven Isolierung von Vorläuferzellen der frühen Burst-bildenden Einheit erythroid (BFU-e) und der koloniebildenden Einheit erythroid (CFU-e) direkt aus frischem Knochenmark und Milz der Maus. Dieses Protokoll, das auf der Grundlage von Einzelzell-Transkriptomdaten entwickelt wurde, ist das erste, das alle erythroiden Vorläuferzellen des Gewebes mit hoher Reinheit isoliert.

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur simultanen Analyse von Zellteilungen, Oberflächenphänotyp und Verwandtschaft bei hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen mit minimaler Manipulation.

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

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