Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Nur wenige Methoden erlauben es, die Funktionalität hämatopoetischer Vorläuferzellen schnell zu beurteilen. Dieses Protokoll misst den Einfluss der ersten Zellteilungen auf das Zellschicksal und die Zellbindung. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Messung von Teilung und Differenzierung auf Einzelzellebene und mit hohem Durchsatz, ohne dass eine komplexe und umfangreiche Manipulation erforderlich ist.

Diese Methode eignet sich für jede hämatopoetische Population, die in Kultur erhalten werden kann. Es kann also leicht auf die Krebsbiologie, Immunologie und Entwicklungsbiologie angewendet werden. Zu Beginn werden 250 Mikroliter der CD34+-Fraktion gleichmäßig in vier 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen aliquotiert.

Beschriften Sie die Röhrchen wie im Textmanuskript beschrieben. 250 Mikroliter der CD34-Fraktion in weitere vier 15-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen aliquotieren und die Röhrchen etikettieren. Bereiten Sie CFSE-High- und CSFE-Low-Lösungen vor, wie im Textmanuskript beschrieben.

Geben Sie 250 Mikroliter der CFSE-High-Lösung in den CF- und CV-Schlauch, 250 Mikroliter der CFSE-Low-Lösung in den VC-Schlauch und 250 Mikroliter Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ohne fetales Kälberserum (FBS) in den VI-Schlauch. Um eine effiziente Mischung der Zellsuspension im Zellfarbstoff zu gewährleisten, neigen Sie das Röhrchen um 90 Grad und scheiden Sie die CFSE-Lösungen an der Röhrchenwand ab. Halten Sie dann das Röhrchen senkrecht und mischen Sie drei- oder viermal, um eine schnelle Vermischung der CFSE-Lösungen mit den resuspendierten Zellen zu gewährleisten.

Inkubieren Sie die Suspension acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie nach der Inkubation fünf Milliliter DMEM mit 10 % FBS hinzu und stellen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang auf 37 Grad Celsius. Drehen Sie die Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang.

Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration, ohne das Pellet zu stören, und waschen Sie das Pellet mit fünf Millilitern PBS, ETDA. Drehen Sie die Röhrchen erneut und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 40 Mikrolitern PBS, ETDA, resuspendieren. Um die CD34+-Zellen zu färben, bereiten Sie eine Mastermischung von Antikörpern in einem einzigen 0,5-Milliliter-Röhrchen vor.

Fügen Sie sieben Mikroliter aus dem Antikörper-Mastermix zu jeder der vier CD34+-Bedingungen hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen im Färbepuffer mit jeweils ca. 500 Mikrolitern für die Beads in CD34+-Zellen und einem Milliliter für die CD34-Röhrchen. Legen Sie für die Zellensortierung die Gating-Strategie fest, indem Sie Punktdiagramme erstellen.

Visualisieren Sie zunächst die Zellen in einem FSCA- und SSCA-Punktdiagramm und doppelklicken Sie auf das Polygon-Gating-Werkzeug, um die Grundgesamtheit mit geringer Seitenstreuung auszuwählen. Beschriften Sie dieses neu erstellte Gate als Zellen. Klicken Sie im folgenden Punktdiagramm FSCA versus FSCH mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und wählen Sie das Tor Zellen aus dem Dropdown-Menü aus, indem Sie darauf klicken.

Verwenden Sie dasselbe Anschnittwerkzeug, um eine enge Population auf der Diagonalen zwischen den beiden Achsen auszuwählen. Beschriften Sie dieses Gate als einzelne Zellen. Im dritten Punktdiagramm (APC vs. FSH-H) werden die Einzelzellen der Grundgesamtheit dargestellt und die Zellen negativ für die Expression der APC-Abstammung bestimmt.

Kennzeichnen Sie diese neu erstellte Population als "Lineage Negative". Im vierten Diagramm (CFSE vs. CTV) wird die negative Abstammungslinie der Population angezeigt, und es werden vier separate Gatter erstellt, eines für jede Farbstoffkombination. Tor VI ist hier als Beispiel dargestellt.

Verwenden Sie das fünfte und sechste Diagramm, um die Vorläufer von Interesse zu identifizieren. Großzügiges Gate CD34+CD38-Population und die CD34+CD38+ im fünften Diagramm. Wählen Sie dann die CD34+CD38-Population im sechsten Diagramm aus und zeichnen Sie drei Gatter für LMPP, HSC und MPP.

Führen Sie CD34+-Brüche aus und zeichnen Sie mindestens 5.000 Ereignisse im Einzelzellen-Gate auf. Passen Sie das Gate für jede Farbkombination an und stellen Sie ein enges Gate ein, um eine homogene Population auszuwählen. Bereiten Sie die Vorlage für die Plattensortierung mithilfe des Layouts "Experimentsortierung" vor.

Die Vertiefungen mit der Bezeichnung CD34-enthalten 5.000 bis 10.000 Zellen, die nach dem CF-, CV-, VC- und VI-Gatter sortiert sind. Die Bulk-Wells enthalten 500 Zellen, die auf dem Gate CD34+CD38-Wells sortiert sind. Die Single-Cell-Wells enthalten nur ein Ereignis pro Zellteilungsfarbstoffkombination pro Well, also insgesamt vier Ereignisse pro Well. Beginnen Sie als Nächstes mit der Sortierung des CD34-CF im Modus "Yield Purity".

Klicken Sie auf die Schaltfläche Erwerben und dann auf die Schaltfläche Sortieren. Klicken Sie auf Erwerben und dann auf die Schaltfläche Sortieren, um sicherzustellen, dass Sie 0160 als Reinheitsgrad angekreuzt haben. Sortieren Sie schließlich die interessierenden Zellen, eine Zelle pro Well, in Einzelzellreinheit und stellen Sie sicher, dass Sie die Option Indexsortierung aktiviert haben.

Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 300 g und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte schnell unter der Haube über ein Papiertuch drehen. Geben Sie acht Mikroliter stehenden Puffer in die Vertiefungen A1 bis A4 und anschließend acht Mikroliter der Mischung in die anderen Vertiefungen. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter Färbepuffer pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen.

Zentrifugieren und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Zellen in 85 Mikrolitern Färbepuffer resuspendieren. Starten Sie die Analyse auf dem Durchflusszytometer im Erfassungsmodus, indem Sie die entsprechende Vorlage verwenden und auf Benutzerdefiniert klicken. Nachdem Sie die gewünschten Fluorophore aus der Liste ausgewählt haben, stellen Sie den Plattenaufbau entsprechend der Plattenvorlage ein, die um die Anzahl der Vertiefungen korrigiert ist, die mindestens eine Zelle enthalten.

Aktivieren Sie die Option Rühren und wählen Sie 100 Mikroliter als Begrenzung des Erfassungsvolumens. Stellen Sie dann die Erfassungsrate auf nicht mehr als einen Mikroliter pro Sekunde ein, da eine niedrigere Geschwindigkeit das pro Well analysierte Gesamtvolumen verbessert. Für ein repräsentatives Gating verketten Sie die verschiedenen Bulk-Wells in einer einzigen Datei.

Klicken Sie auf Extras und Parameter ableiten, um den transformierten Wert zu erhalten. Fügen Sie die angegebene Formel in das Formelfeld ein. Wenden Sie das Gating auf jede Farbe einzeln als Histogrammdiagramm an.

Stellen Sie für CF und VI CFSE-A bzw. CTV-A auf der X-Achse ein. Legen Sie für CV und VC den neu abgeleiteten Parameter auf der X-Achse fest und legen Sie dann die Gatter für jeden Peak fest. Wenden Sie die Anspritzung auf jede einzelne einzelne Zelle an.

Stellen Sie sicher, dass Sie den abgeleiteten Parameter zu jedem analysierten Well hinzufügen. Überprüfen Sie manuell jedes Farbtor für jedes Well, um Ereignisse zu erkennen, die fälschlicherweise einem bestimmten Peak zugeordnet sind. Die durchflusszytometrische Analyse nach der Zellkultur erfordert ein präzises Gating, um die Verwandtschaft jeder einzelnen Zelle zusammen mit der zellulären Phänotypisierung festzustellen.

Die Definition und Zuordnung von Peaks sind entscheidende Aspekte der Durchflusszytometrie. Die Histogramme zeigen zwei Beispiele für Familien, die auf mehrere Peaks verteilt sind, eines mit zwei ähnlichen Intensitätspeaks und eines mit zwei unterschiedlichen Intensitätspeaks. Verschiedene Arten der Datendarstellung und statistischen Tests werden hier für zwei separate Experimente gezeigt, die nach 72 Stunden für HSCs und MPPs durchgeführt wurden.

Die Heatmap für die Bedingung HSC-Differenzierung repräsentiert verschiedene Zellfamilien, sowohl im Zellschicksal als auch in der Zellteilung. Das Histogramm, das den Verbleib von HSCs und MPPs abgeleiteten Zellfamilien vergleicht, ist hier dargestellt. Für beide Zelltypen wird der Vergleich zwischen der Bedingung GT und der Bedingungsdifferenzierung zusammen mit den statistischen Tests für MPPs angezeigt.

Hier werden Histogramme gezeigt, die den Prozentsatz der Zellfamilien pro Generation und die Art der Symmetrie oder Asymmetrie des Schicksals für die erste Teilung vergleichen. Die Verteilung der Schicksale pro Generation für MPPs und die Bedingungsdifferenzierung sind hier dargestellt. Dieses Verfahren erfordert die Isolierung von Zellen in großen Mengen, um die geeignete Gating-Strategie festzulegen.

Es ist daher besser, die Färbung mit mindestens 10.000 Zellen zu beginnen. Die Kombination dieser Methode mit kontinuierlichen Messungen, wie z. B. der Bildgebung lebender Zellen, kann sehr leistungsfähig sein, da beide zusammen eine detaillierte Beschreibung der frühen Vorläuferzellen der Zelldynamik liefern können. Dieser Ansatz wurde erstmals von den Hopkins Labs für die T-Zell-Biologie entwickelt.

Diese Version, die für Blutstammzellen angepasst wurde, wird nun auf die Krebs- und Stammzellbiologie ausgeweitet.