Quantifizierung des Replikationsstresses in Ovarialkarzinomzellen mittels einzelsträngiger DNA-Immunfluoreszenz

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Quantifizierung des Gehalts an einzelsträngiger DNA in Zellen. Diese effiziente und reproduzierbare Methode kann verwendet werden, um den Replikationsstress zu untersuchen, ein häufiges Merkmal bei mehreren Eierstockkrebsarten. Darüber hinaus ist dieser Assay mit einer automatisierten Analysepipeline kompatibel, was seine Effizienz weiter erhöht.

Zusammenfassung

Replikationsstress ist ein Kennzeichen mehrerer Eierstockkrebsarten. Replikationsstress kann aus mehreren Quellen entstehen, einschließlich Doppelstrangbrüchen, Transkriptions-Replikationskonflikten oder amplifizierten Onkogenen, was unweigerlich zur Erzeugung von einzelsträngiger DNA (ssDNA) führt. Die Quantifizierung der ssDNA bietet daher die Möglichkeit, das Ausmaß des Replikationsstresses in verschiedenen Zelltypen und unter verschiedenen DNA-schädigenden Bedingungen oder Behandlungen zu bewerten. Neue Erkenntnisse deuten auch darauf hin, dass ssDNA ein Prädiktor für das Ansprechen auf Chemotherapeutika sein kann, die auf die DNA-Reparatur abzielen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Immunfluoreszenz-basierte Methodik zur Quantifizierung von ssDNA. Diese Methodik beinhaltet die Markierung des Genoms mit einem Thymidin-Analogon, gefolgt von der antikörperbasierten Detektion des Analogons am Chromatin unter nicht denaturierenden Bedingungen. Abschnitte der ssDNA können als Herde unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Die Anzahl und Intensität der Herde steht in direktem Zusammenhang mit dem im Zellkern vorhandenen ssDNA-Gehalt. Wir beschreiben auch eine automatisierte Pipeline zur Quantifizierung des ssDNA-Signals. Die Methode ist schnell und reproduzierbar. Darüber hinaus macht die Einfachheit dieser Methodik sie für Hochdurchsatzanwendungen wie Arzneimittel- und genetische Screenings zugänglich.

Einleitung

Genomische DNA ist häufig mehreren Angriffen aus verschiedenen endogenen und exogenen Quellen ausgesetzt¹. Die Häufigkeit endogener Schäden korreliert direkt mit den Konzentrationen von Stoffwechselnebenprodukten wie reaktiven Sauerstoffspezies oder Aldehyden, die bei mehreren Krebsarten, einschließlich Eierstockkrebs, intrinsisch höher sind ^2,3. Es ist zwingend erforderlich, dass DNA-Schäden effizient behoben werden. Andernfalls kann es genotoxische Läsionen und folglich Mutagenese fördern. Die Fähigkeit von Zellen, genotoxische Läsionen zu reparieren, hängt von der Funktionalität fehl....

Protokoll

HINWEIS: In diesen Schritten wurde die Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR3 verwendet, aber dieses Protokoll ist allgemein auf mehrere andere Zelllinien anwendbar, einschließlich solcher, die aus nicht-ovariellen Quellen stammen. Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Plattieren der Zellen

1. Stellen Sie Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser her.
   1. Autoklavierte Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit Poly-L-Lysin-Lösung geben und 15 Minuten lang auf eine Wippe legen.
   2. Die Lösung wird in einer Gewebekulturhaube abgesa....

Ergebnisse

Repräsentative Bilder und die Quantifizierung der IdU-Herde aus den Kernen, die von den unbehandelten Zellen und den mit 0,5 mM Hydroxyharnstoff für 24 h behandelten Zellen stammen, sind in Abbildung 4 dargestellt. Beide Kerne sind im DAPI-Kanal gefärbt und identifizierbar. Die Analyse dieser Bilder besteht darin, die Anzahl der Herde in jedem Kern zu quantifizieren. Die Anzahl der Herde ist proportional zum Grad der Replikationsspannung.

Diskussion

Wie im Protokoll erwähnt, ist es wertvoll, einige experimentelle Kontrollen einzubeziehen, um sicherzustellen, dass der Assay funktioniert. Dazu gehören sowohl eine nicht IdU-behandelte Probe als auch eine nicht mit Primärantikörpern behandelte Probe. Beide Negativkontrollen sollten Zellen liefern, die durch DAPI gefärbt sind, aber kein IdU-Signal enthalten.

Basierend auf den experimentellen Bedingungen und den verwendeten Zelllinien können unterschiedliche Antikörperverdünnungen erforderlich .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3% Paraformaldehyd (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g Saccharose + 100 mL 10X PBS + Wasser, um ein Volumen von 925 mL zu erreichen. Fügen Sie 75 mL 40% methanolfreies PFA hinzu, mischen Sie es und machen Sie Aliquots von 50 mL vor der Lagerung Lagerung: Lagern in -20 °; C
5-iod-2'-desoxyuridin (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Für 10 mM Bestand: 3,541 mg IdU in 1 mL 1 N flüssiges Ammoniak auflösen Lagerung: Gelagert in -20 & Grad; C
Anti-BrdU Antikörper	BD Biosciences	347580	Lagerung: In 4 & Grad lagern; C
Anti-Maus Alexa Fluor Plus 488 Sekundärantikörper	Thermo Scientific	A32766	Lichtempfindlich - im Dunkeln aufbewahren Lagerung: In 4 & Grad lagern; C
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Hergestellt durch Zugabe einer spezifischen Masse zum Volumen von PBS Lagerung: In 4 μg lagern; C
Rundes Abdeckglas	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften 72230-01
NIS GA3 Software	Nikon
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Wachstumsmedien: RPMI ergänzt mit L-Glutamin, 0,01 mg/ml Rinderinsulin; fötales Rinderserum bis zu einer Endkonzentration von 20% und 1X Pen Strep Lagerung: Gefriermedien: Wachstumsmedien + 5% DMSO und gelagert in -80 & deg; C
Poly-L-Lysin-Lösung	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Lagerung: In 4 & Grad lagern; C
ProLong Diamond Eindeckmittel gegen Ausbleichen mit DAPI	Thermo Scientific	P36962	Lagerung: In 4 & Grad lagern; C
Trypsin-EDTA, 0,25	Genesee Scientific	25-510	Lagerung: In 4 μg lagern; C
Wasser, steril gefiltert	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Lagerung: Lagerung in 4 Grad; C

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