Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.
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Methodenartikel
Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine schwächende Netzhauterkrankung in alternden Bevölkerungen. Es wird allgemein angenommen, dass eine Dysfunktion des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein wichtiges pathobiologisches Ereignis bei AMD ist. Um die Mechanismen zu verstehen, die zu einer RPE-Dysfunktion führen, können Mausmodelle von Forschern verwendet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Mäuse RPE-Pathologien entwickeln können, von denen einige in den Augen von Personen beobachtet werden, bei denen AMD diagnostiziert wurde. Hier beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung von RPE-Pathologien in Mäusen. Dieses Protokoll umfasst die Präparation und Auswertung von Netzhautquerschnitten mittels Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sowie von RPE-Flachfassungen mittels konfokaler Mikroskopie. Wir beschreiben detailliert die häufigsten Arten von murinen RPE-Pathologien, die mit diesen Techniken beobachtet werden, und Möglichkeiten, sie durch unvoreingenommene Methoden für statistische Tests zu quantifizieren. Als Proof-of-Concept verwenden wir dieses RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die RPE-Pathologien zu quantifizieren, die bei Mäusen mit Überexpression des Transmembranproteins 135 (Tmem135) und gealterten Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen beobachtet wurden. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Standardmethoden zur RPE-Phänotypisierung mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler zu präsentieren, die Mausmodelle der AMD verwenden.
Einleitung
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erblindungskrankheit, die Menschen über 55 Jahre betrifft1. Viele Forscher glauben, dass eine Funktionsstörung innerhalb des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein frühes und entscheidendes pathobiologisches Ereignis bei AMD2 ist. Das RPE ist eine Monoschicht polarisierter Zellen, die die Aufgabe hat, die Homöostase benachbarter Photorezeptoren und Aderhautblutgefäße aufrechtzuerhalten3. Es gibt eine Vielzahl von Modellen, um krankheitsassoziierte Mechanismen innerhalb des RPE zu untersuchen, darunter die Zellkulturmodelle
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Protokoll
Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Wisconsin-Madison genehmigt und stehen in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.
1. Auswertung des RPE der Maus mittels Lichtmikroskopie
- Stellen Sie in einer Glasflasche einen Fixierpuffer mit einer Endkonzentration von 2 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd bei Raumtemperatur (RT) her.
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert höchstens 14 ml Fixierpuffer pro Maus.
ACHTUNG: Par....
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Ergebnisse
Die Vervollständigung des in diesem Artikel beschriebenen RPE-Phänotypisierungsprotokolls bietet eine quantitative Analyse der strukturellen RPE-Anomalien, die häufig in Mausmodellen der AMD beobachtet werden. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu bestätigen, verwendeten wir es bei Mäusen, von denen bekannt ist, dass sie RPE-Pathologien aufweisen, einschließlich transgener Mäuse, die WT Tmem135 überexprimieren, angetrieben durch den Huhn-Beta-Aktin-Promotor (Tmem135 TG)30, und gealterte C57BL/6J-Mäuse
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Diskussion
In diesem Artikel haben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung der strukturellen RPE-Pathologien von Mausmodellen vorgestellt. Wir beschrieben die Schritte, die für die Verarbeitung der Augen für verschiedene bildgebende Verfahren wie Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie erforderlich sind, sowie die Quantifizierung typischer Pathologien, die mit diesen bildgebenden Verfahren beobachtet werden. Wir haben die Wirksamkeit unseres RPE-Phänotypisierungsprotokolls durch die Untersuchu.......
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Offenlegungen
Die Autoren dieses Protokolls haben keine Offenlegungen und Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich bei Satoshi Kinoshita und dem Translational Research Initiatives in Pathology Laboratory (TRIP) der University of Wisconsin (UW) für die Vorbereitung unseres Gewebes auf die Lichtmikroskopie. Dieser Kern wird von der Abteilung für Pathologie und Labormedizin der UW, dem Carbone Cancer Center der University of Wisconsin (P30 CA014520) und dem Büro des Direktors-NIH (S10OD023526) unterstützt. Die konfokale Mikroskopie wurde am UW Biochemistry Optical Core durchgeführt, der mit Unterstützung des UW Department of Biochemistry Endowment eingerichtet wurde. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse des National Eye Institute (R01EY022086 an A. Ikeda;....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Cacodylat-Puffer pH7,2 | PolyScientiifc R& D Company | S1619 | |
| Slide Box | 100 Für dieses Protokoll werden zwei benötigt (eine für H& E-gebeizte Dias und eine für RPE-Flat-Halterungen.) | ||
| 100% Ethanol | MDS Warehouse | 2292-CASE | Kann zur Herstellung von verdünnten Ethanollösungen in diesem Protokoll verwendet werden. |
| 1-Wege-Absperrhahn, 2 weibliche Luer-Locks | Qosina | 11069 | |
| 1x Phosphat-Pufferlösung (PBS) | Vorgefertigt 1x PBS kann in diesem Protokoll verwendet werden. | ||
| 2,0 mL Mikroröhrchen | Genesee Scient | 24-283-LR | |
| 24 Hohlraum Einbettkapsel Ersatzform | Elektronenmikroskopie Sciences | 70165 | |
| 24 Zoll PVC-Schlauch mit Luer-Enden | Fisher Scientific | NC1376778 | |
| 400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids | Elektronenmikroskopie Sciences | T400-Cu | |
| 95% Ethanol | MDS Lager | 2293-CASE | |
| Saugfähige Unterlagen mit wasserdichter Feuchtigkeitsbarriere (23 Zoll x 24 Zoll) | VWR | 56616-031 | |
| Einstellbar 237 ml Sprühflasche | VWR | 23609-182 | |
| Alexa Fluor488 Konjugierter Esel Anti-Kaninchen IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Aluminiumfolie | |||
| BD Präzisionsgleiter 19 Gauge Spritzennadel | Sigma-Aldrich | ||
| Adlerfarn-Pinzetten; Gekrümmt; Feine Kreuzverzahnungen; 4" Länge, 1 mm Spitzenbreite | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5211 | In diesem Protokoll als gebogene Pinzette bekannt. |
| Kamelhaarbürste | Elektronenmikroskopie | Sciences 65575-02 | |
| Kohlendioxid-Euthanasiekammer | |||
| Kohlendioxid-Durchflussmesser | |||
| Kohlendioxid-Tank | |||
| Castaloy Zinken-Verlängerungsklemmen | Fisher Scientific | 05-769-7Q | |
| L-förmiger Sockelständer aus Gusseisen | Fisher Scientific | 11-474-207 | |
| Cell Prolifer Programm | Zum Download verfügbar: https://cellprofiler.org/releases | ||
| Klarer Nagellack | Elektronenmikroskopie Sciences | 72180 | |
| Colorfrost Objektträger Lavendel | VWR | 10118-956 | |
| Computer | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| destilliertes H20-Wasser | aus dem Milli-Q Reinigungssystem verwendet. | ||
| Dumont Pinzette mit dünner Spitze; Muster #55 | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-4984 | In diesem Protokoll als Pinzetten mit feiner Spitze bekannt, und für dieses Protokoll werden 3 benötigt (zwei für Dissektionen und eine für die elektronenmikroskopische Bearbeitung). |
| Elektronenmikroskopie-Gitterhalter | Elektronenmikroskopie-Wissenschaften | 71147-01 | |
| EPON 815 | Harz-Elektronenmikroskopie-Wissenschaften | 14910 | |
| Epredia Mark-It Gewebemarkierung Gelber Farbstoff | Fisher Scientsp; | 22050460 | Bitte befolgen Sie das Protokoll des Herstellers, wenn Sie diesen Gewebemarkierungsfarbstoff verwenden. |
| Epredia Eindeckmittel | Fisher Scientific | 22-110-610 | Verwendung für die Montage H& E Folien. |
| Fiber-Lite Mi-150 Beleuchtungsserie, 150 W Halogen-Lichtquelle | Dolan-Jenner Industries | Mi-150 | Lichtquelle für Präpariermikroskope. |
| Fiji ImageJ Programm | Zum Download verfügbar: https://imagej.net/downloads | ||
| Flexaframe Castaloy Hook Connector | Thermo Scientific | 14-666-18Q | |
| Abzug | |||
| Glutaraldehyd 2,5 % in Phosphatpuffer, pH 7,4, 32 % | Elektronenmikroskopie | Sciences 16537-05 | |
| JEM-1400 Transmissionselektronenmikroskop (JEOL) mit einem ORIUS (1000) CCD-Kamera | |||
| Labor-Tischschüttler | Für diese Experimente werden zwei benötigt. Einer sollte Raumtemperatur haben, während der andere in einem Kühlraum mit 4 Grad Celsius stehen sollte. | ||
| Laser Cryo Tag Labels | Elektronenmikroskopie Sciences | 77564-05 | |
| Bleicitrat | Elektronenmikroskopie | Sciences 17800 | |
| Leica EM UC7Ultramikrotom | |||
| Leica Reichert Ultracut S Mikrotom | |||
| LifterSlips | Thermo Fisher Scientific | 22X22I24788001LS | Verwenden Sie diese Deckgläser für die RPE-Flachhalterungen, da sie erhöhte Kanten haben und die Dicke des RPE aufnehmen. |
| Mayer's Hämatoxylin | VWR | 100504-406 | |
| McPherson-Vannas Mikro-Präparierfederschere | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5600 | Im Protokoll als Mikropräparierschere bekannt. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Mäuse | Jedes AMD-Mausmodell und die entsprechenden Bedienelemente können für dieses Protokoll verwendet werden. | ||
| Mikro-Präparierschere; Standardausführung; Gekrümmt; Scharfe Spitzen; 24 mm Klingenlänge; 4,5" Gesamtlänge | Roboz Chirurgisches Instrument | RS-5913 | In diesem Protokoll als gebogene Schere bekannt. |
| Microsoft Excel | |||
| Mikrotubengestelle | |||
| Nikon A1RS Konfokalmikroskop | |||
| Normales Eselsserum | SouthernBiotech | 0030-01 | |
| Nummer 11 Sterile Einweg-Skalpellklingen | VWR | 21909-380 | |
| Osmiumtetroxid | Elektronenmikroskopie | 19150 | |
| Paraformaldehyd, 32% | Elektronenmikroskopie | 15714-S | |
| Bleistift | |||
| Petrischale | VWR | 21909-380 | |
| Pipettenspitzen | |||
| Pipetten | |||
| Polyklonaler Anti-ZO-1-Antikörper | Thermo Fisher Scientific | 402200 | |
| Propylenoxid-Elektronenmikroskopie | Sciences | 20412 | |
| Rasierklinge | VWR | 10040-386 | |
| Flache Ablage für Mausperfusionen | |||
| Shandon Eosin Y Alkoholiker | VWR | 89370-828 | |
| Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker | Heftklammern | 642736 | |
| Slide Rack zum Färben | Grainger | 49WF31 | |
| Squared Cover Glass Slips | Fisher Scientific | 12-541B | |
| Färbeschale mit Abdeckung | Grainger | 49WF30 | Benötigen Sie 15 für H& E Färbeverfahren. |
| Target Vollkunststoff-Einweg-Luer-Slip-Spritze 50 ml | Thermo Scientific | S7510-50 | Verwenden Sie nur den Spritzenzylinder. |
| Timer | Fisher | 1464917 | |
| Uranylacetat | Elektronenmikroskopie Sciences | 22400 | |
| Vakuumofen | |||
| Vectashield Eindeckmedium | Vector Laboratories | H-1000 | Verwendung für die Montage von RPE Flat Mounts. |
| Xylol | Fisher Wissenschaftlich | ||
| Zeiss Axio Imager 2 Lichtmikroskop | Dieses Mikroskop hat die Fähigkeit, zusammengesetzte 20-fache Bilder zu erzeugen. Wenn ein Lichtmikroskop nicht über diese Fähigkeit verfügt, dann machen Sie Bilder der gesamten Netzhaut, die sich leicht überlappen. Verwenden Sie Adobe Photoshop, um diese Bilder zusammenzufügen. Bitte beachten Sie die Handbücher des Adobe Photoshop-Programms für das Zusammenfügen von Bildern. | ||
| Zeiss Stemi 2000 Präpariermikroskop | Elektronenmikroskopie Wissenschaften | 65575-02 |
Referenzen
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
- Bhutto, I., Lutty, G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
