Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Summary

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Abstract

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine schwächende Netzhauterkrankung in alternden Bevölkerungen. Es wird allgemein angenommen, dass eine Dysfunktion des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein wichtiges pathobiologisches Ereignis bei AMD ist. Um die Mechanismen zu verstehen, die zu einer RPE-Dysfunktion führen, können Mausmodelle von Forschern verwendet werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Mäuse RPE-Pathologien entwickeln können, von denen einige in den Augen von Personen beobachtet werden, bei denen AMD diagnostiziert wurde. Hier beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung von RPE-Pathologien in Mäusen. Dieses Protokoll umfasst die Präparation und Auswertung von Netzhautquerschnitten mittels Lichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sowie von RPE-Flachfassungen mittels konfokaler Mikroskopie. Wir beschreiben detailliert die häufigsten Arten von murinen RPE-Pathologien, die mit diesen Techniken beobachtet werden, und Möglichkeiten, sie durch unvoreingenommene Methoden für statistische Tests zu quantifizieren. Als Proof-of-Concept verwenden wir dieses RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die RPE-Pathologien zu quantifizieren, die bei Mäusen mit Überexpression des Transmembranproteins 135 (Tmem135) und gealterten Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen beobachtet wurden. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, Standardmethoden zur RPE-Phänotypisierung mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler zu präsentieren, die Mausmodelle der AMD verwenden.

Introduction

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erblindungskrankheit, die Menschen über 55 Jahre betrifft¹. Viele Forscher glauben, dass eine Funktionsstörung innerhalb des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein frühes und entscheidendes pathobiologisches Ereignis bei AMD² ist. Das RPE ist eine Monoschicht polarisierter Zellen, die die Aufgabe hat, die Homöostase benachbarter Photorezeptoren und Aderhautblutgefäße aufrechtzuerhalten³. Es gibt eine Vielzahl von Modellen, um krankheitsassoziierte Mechanismen innerhalb des RPE zu untersuchen, darunter die Zellkulturmodelle

Protocol

Alle Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Wisconsin-Madison genehmigt und stehen in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.

1. Auswertung des RPE der Maus mittels Lichtmikroskopie

1. Stellen Sie in einer Glasflasche einen Fixierpuffer mit einer Endkonzentration von 2 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd bei Raumtemperatur (RT) her.
   HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert höchstens 14 ml Fixierpuffer pro Maus.
   ACHTUNG: Par....

Results

Die Vervollständigung des in diesem Artikel beschriebenen RPE-Phänotypisierungsprotokolls bietet eine quantitative Analyse der strukturellen RPE-Anomalien, die häufig in Mausmodellen der AMD beobachtet werden. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu bestätigen, verwendeten wir es bei Mäusen, von denen bekannt ist, dass sie RPE-Pathologien aufweisen, einschließlich transgener Mäuse, die WT Tmem135 überexprimieren, angetrieben durch den Huhn-Beta-Aktin-Promotor (Tmem135 TG)30, und gealterte C57BL/6J-Mäuse

Discussion

In diesem Artikel haben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Beurteilung der strukturellen RPE-Pathologien von Mausmodellen vorgestellt. Wir beschrieben die Schritte, die für die Verarbeitung der Augen für verschiedene bildgebende Verfahren wie Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie erforderlich sind, sowie die Quantifizierung typischer Pathologien, die mit diesen bildgebenden Verfahren beobachtet werden. Wir haben die Wirksamkeit unseres RPE-Phänotypisierungsprotokolls durch die Untersuchu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 M Cacodylat-Puffer pH7,2	PolyScientiifc R& D Company	S1619
Slide Box			100 Für dieses Protokoll werden zwei benötigt (eine für H& E-gebeizte Dias und eine für RPE-Flat-Halterungen.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Kann zur Herstellung von verdünnten Ethanollösungen in diesem Protokoll verwendet werden.
1-Wege-Absperrhahn, 2 weibliche Luer-Locks	Qosina	11069
1x Phosphat-Pufferlösung (PBS)			Vorgefertigt 1x PBS kann in diesem Protokoll verwendet werden.
2,0 mL Mikroröhrchen	Genesee Scient	24-283-LR
24 Hohlraum Einbettkapsel Ersatzform	Elektronenmikroskopie Sciences	70165
24 Zoll PVC-Schlauch mit Luer-Enden	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Elektronenmikroskopie Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Lager	2293-CASE
Saugfähige Unterlagen mit wasserdichter Feuchtigkeitsbarriere (23 Zoll x 24 Zoll)	VWR	56616-031
Einstellbar 237 ml  Sprühflasche	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Konjugierter Esel Anti-Kaninchen IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminiumfolie
BD Präzisionsgleiter 19 Gauge Spritzennadel	Sigma-Aldrich
Adlerfarn-Pinzetten; Gekrümmt; Feine Kreuzverzahnungen; 4" Länge, 1 mm Spitzenbreite	Roboz Chirurgisches Instrument	RS-5211	In diesem Protokoll als gebogene Pinzette bekannt.
Kamelhaarbürste	Elektronenmikroskopie	Sciences 65575-02
Kohlendioxid-Euthanasiekammer
Kohlendioxid-Durchflussmesser
Kohlendioxid-Tank
Castaloy Zinken-Verlängerungsklemmen	Fisher Scientific	05-769-7Q
L-förmiger Sockelständer aus Gusseisen	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Programm			Zum Download verfügbar: https://cellprofiler.org/releases
Klarer Nagellack	Elektronenmikroskopie Sciences	72180
Colorfrost Objektträger Lavendel	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
destilliertes H20-Wasser			aus dem Milli-Q Reinigungssystem verwendet.
Dumont Pinzette mit dünner Spitze; Muster #55	Roboz Chirurgisches Instrument	RS-4984	In diesem Protokoll als Pinzetten mit feiner Spitze bekannt, und für dieses Protokoll werden 3 benötigt (zwei für Dissektionen und eine für die elektronenmikroskopische Bearbeitung).
Elektronenmikroskopie-Gitterhalter	Elektronenmikroskopie-Wissenschaften	71147-01
EPON 815	Harz-Elektronenmikroskopie-Wissenschaften	14910
Epredia Mark-It Gewebemarkierung Gelber Farbstoff	Fisher Scientsp;	22050460	Bitte befolgen Sie das Protokoll des Herstellers, wenn Sie diesen Gewebemarkierungsfarbstoff verwenden.
Epredia Eindeckmittel	Fisher Scientific	22-110-610	Verwendung für die Montage H& E Folien.
Fiber-Lite Mi-150 Beleuchtungsserie, 150 W Halogen-Lichtquelle	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Lichtquelle für Präpariermikroskope.
Fiji ImageJ Programm			Zum Download verfügbar: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Abzug
Glutaraldehyd 2,5 % in Phosphatpuffer, pH 7,4, 32 %	Elektronenmikroskopie	Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmissionselektronenmikroskop (JEOL) mit einem ORIUS (1000) CCD-Kamera
Labor-Tischschüttler			Für diese Experimente werden zwei benötigt. Einer sollte Raumtemperatur haben, während der andere in einem Kühlraum mit 4 Grad Celsius stehen sollte.
Laser Cryo Tag Labels	Elektronenmikroskopie Sciences	77564-05
Bleicitrat	Elektronenmikroskopie	Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramikrotom
Leica Reichert Ultracut S Mikrotom
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Verwenden Sie diese Deckgläser für die RPE-Flachhalterungen, da sie erhöhte Kanten haben und die Dicke des RPE aufnehmen.
Mayer's Hämatoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Mikro-Präparierfederschere	Roboz Chirurgisches Instrument	RS-5600	Im Protokoll als Mikropräparierschere bekannt.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mäuse			Jedes AMD-Mausmodell und die entsprechenden Bedienelemente können für dieses Protokoll verwendet werden.
Mikro-Präparierschere; Standardausführung; Gekrümmt; Scharfe Spitzen; 24 mm Klingenlänge; 4,5" Gesamtlänge	Roboz Chirurgisches Instrument	RS-5913	In diesem Protokoll als gebogene Schere bekannt.
Microsoft Excel
Mikrotubengestelle
Nikon A1RS Konfokalmikroskop
Normales Eselsserum	SouthernBiotech	0030-01
Nummer 11 Sterile Einweg-Skalpellklingen	VWR	21909-380
Osmiumtetroxid	Elektronenmikroskopie	19150
Paraformaldehyd, 32%	Elektronenmikroskopie	15714-S
Bleistift
Petrischale	VWR	21909-380
Pipettenspitzen
Pipetten
Polyklonaler Anti-ZO-1-Antikörper	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylenoxid-Elektronenmikroskopie	Sciences	20412
Rasierklinge	VWR	10040-386
Flache Ablage für Mausperfusionen
Shandon Eosin Y Alkoholiker	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Heftklammern	642736
Slide Rack zum Färben	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Färbeschale mit Abdeckung	Grainger	49WF30	Benötigen Sie 15 für H& E Färbeverfahren.
Target Vollkunststoff-Einweg-Luer-Slip-Spritze 50 ml	Thermo Scientific	S7510-50	Verwenden Sie nur den Spritzenzylinder.
Timer	Fisher	1464917
Uranylacetat	Elektronenmikroskopie Sciences	22400
Vakuumofen
Vectashield Eindeckmedium	Vector Laboratories	H-1000	Verwendung für die Montage von RPE Flat Mounts.
Xylol	Fisher Wissenschaftlich
Zeiss Axio Imager 2 Lichtmikroskop			Dieses Mikroskop hat die Fähigkeit, zusammengesetzte 20-fache Bilder zu erzeugen. Wenn ein Lichtmikroskop nicht über diese Fähigkeit verfügt, dann machen Sie Bilder der gesamten Netzhaut, die sich leicht überlappen. Verwenden Sie Adobe Photoshop, um diese Bilder zusammenzufügen. Bitte beachten Sie die Handbücher des Adobe Photoshop-Programms für das Zusammenfügen von Bildern.
Zeiss Stemi 2000 Präpariermikroskop	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	65575-02