Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven

Summary

Dieser Bericht stellt ein neues Probenvorbereitungsverfahren zur Visualisierung neuromuskulärer Verbindungen in Drosophila-Larven dar. Diese Methode ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer bei der Verhinderung des Einrollens der Proben und eignet sich besonders für die Ultrastrukturanalyse der neuromuskulären Verbindung von Drosophila .

Abstract

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von Drosophila hat sich zu einem wertvollen Modellsystem im Bereich der Neurowissenschaften entwickelt. Die Anwendung der konfokalen Mikroskopie am Drosophila NMJ ermöglicht es den Forschern, synaptische Informationen zu gewinnen, die sowohl quantitative Daten zur Synapsenhäufigkeit als auch detaillierte Einblicke in ihre Morphologie umfassen. Die diffuse Verteilung und der begrenzte visuelle Bereich des TEM stellen jedoch Herausforderungen für die Ultrastrukturanalyse dar. In dieser Studie wird eine innovative und effiziente Probenvorbereitungsmethode vorgestellt, die den herkömmlichen Ansatz übertrifft. Das Verfahren beginnt mit dem Platzieren eines Metallnetzes am Boden einer Flasche oder eines Reagenzglases mit flachem Boden und dem Positionieren der Larvenproben auf dem Netz. Ein zusätzliches Netz wird über die Proben gelegt, um sicherzustellen, dass sie zwischen den beiden Netzen positioniert sind. Die fixierten Proben werden gründlich dehydriert und infiltriert, bevor mit dem Einbettungsverfahren fortgefahren wird. Dann erfolgt die Einbettung der Proben in Epoxidharz in einer flachen Blattweise, die die Vorbereitung der Muskeln für die Positionierung und Schnitte ermöglicht. Mit diesen Schritten können alle Muskeln der Drosophila-Larven lichtmikroskopisch sichtbar gemacht werden, was die spätere Positionierung und Schnittbestimmung erleichtert. Überschüssiges Harz wird nach dem Lokalisieren des 6^. und 7^. Muskels der Körpersegmente A₂ und A₃ entfernt. Es wird eine serielle ultradünne Schnittung des 6^. oder 7^. Muskels durchgeführt.

Introduction

Die Elektronenmikroskopie ist eine der idealsten Methoden zur Untersuchung der Ultrastruktur biologischer Materialien, mit der die innere Struktur von Zellen auf der Nanoskala auf der Nanoskala¹ visuell und genau demonstriert werden kann. Aufgrund der Komplexität des Probenvorbereitungsprozesses und der hohen Kosten ist die Elektronenmikroskopie jedoch nicht so beliebt wie die Lichtmikroskopie. Jüngste Fortschritte in der Elektronenmikroskopie haben zu einer deutlichen Verbesserung der Bildqualität geführt, die mit einer bemerkenswerten Reduzierung der damit verbundenen Arbeitsbelastung einhergeht. Daher hat die Elektronenmikroskopie eine wicht....

Protocol

HINWEIS: Über die in diesem Artikel verwendete Methode zur Probenvorbereitung der Transmissionselektronenmikroskopie wurde bereits berichtet¹⁶. Es ist wichtig zu beachten, dass die Auswahl der Reagenzien und die Anpassung der Dosierung je nach Probe notwendig sind. Es gibt viele giftige chemische Reagenzien, die bei der Probenvorbereitung verwendet werden, daher muss der Bediener bestimmte Schutzmaßnahmen ergreifen, wie z. B. das Tragen von Schutzkleidung und Handschuhen und das Arbeiten in einem Abzug.

1. Verfahren zum Sezieren, Fixieren und Platzieren

1. Dissektion
   1. Die wandernden Larv....

Results

Die Körperwand der Drosophila-Larve besteht aus 30 identifizierbaren Muskelfasern, die in einem regelmäßigen Muster angeordnet sind, und sieht nach der Dissektion und Fixierung wie eine dünne Scheibe aus²¹ (Abbildung 1A). Die Probe bleibt während des Dehydratisierungsprozesses aufgrund des Vorhandenseins der Metallgewebe flach (Abbildung 1B, C). Der Körpermuskel der Larve wird in einer dünnen Platte aus Epoxidhar.......

Discussion

Drosophila-Larvenproben neigen dazu, sich während der Dehydrierung zusammenzurollen, da die Proben dünn sind, was es schwierig macht, den neuromuskulären Übergang genau zu lokalisieren, wodurch die Schwierigkeit und der Arbeitsaufwand für die Probenvorbereitung erhöht werden. Die traditionelle Verbesserung besteht darin, die Probe⁷ zu kürzen, aber die Proben waren immer noch unterschiedlich stark gewellt.

Bei unserer Methode gibt es zwei kritische Schritte: Ers.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Epoxypropane	SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD	JYJ 037-2015	Penetrating
Agent Drosophila Stocks	Bloomington	none	Die in dieser Studie verwendeten Wildtyp-Kontroll-Drosophila-Stämme waren alle W1118 und wurden nach Standardkulturmethoden aufgezogen
Reagenzgläser aus Glas mit flachem Boden	Haimen Chenxing Experimentelle Ausrüstung Unternehmen	keine	Reagenzgläser aus Glas mit flachem Boden (Flasche)mit Schwammstopfen (oder Flaschenverschluss)
K4M Vernetzer	Agar Scientific	Kat# 1924B	Die Einbettungsharze basieren auf einer hochvernetzten Acrylat- und Methacrylat-Formel
K4M Harz (Monomer B)	Agar Scientific	Lot# 631557	Harz Monomer
Polyvinyl Film	Haimen Chenxing Experimentelle Ausrüstung Unternehmen	keine	Transparente Polyethylenfolie ist die beste, Dicke von ca. 0,2 mm
SPI Chem DDSA	SPI	SpI #02827-AF	Dodecenyl Bernsteinsäureanhydrid
SPI-Chem DMP-30 Epoxy	SPI	02823-DA	Beschleuniger
SPI-Chem NMA	SPI	SpI #02828-AF	Härter für Epoxid
SPI-PON 812 Epoxy	SPI	SPI SPI #0259-AB	Harz Monomer
Stahlgitter	Yuhuiyuan Gardening Store(online)	none	Netz aus Kupfer oder Edelstahl
Transmissionselektronenmikroskopie	Hitachi H-7650 11416692		Alle Gitter (auf denen Proben gesammelt wurden) wurden mit Bleicitrat gefärbt und unter einer Transmissionselektronenmikroskopie betrachtet.
Ultradünnes Mikrotom	Leica UC7 ultradünnes Mikrotom	595915	Alle Schnittvorgänge werden auf einem ultradünnen Mikrotom Leica UC7 mit einem Diamantmesser durchgeführt