Dieser Bericht stellt ein neues Probenvorbereitungsverfahren zur Visualisierung neuromuskulärer Verbindungen in Drosophila-Larven dar. Diese Methode ist im Vergleich zur herkömmlichen Methode wirksamer bei der Verhinderung des Einrollens der Proben und eignet sich besonders für die Ultrastrukturanalyse der neuromuskulären Verbindung von Drosophila .
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Methodenartikel
Optimierung des Probenvorbereitungsprozesses für die Transmissionselektronenmikroskopie von neuromuskulären Verbindungen in Drosophila-Larven
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von Drosophila hat sich zu einem wertvollen Modellsystem im Bereich der Neurowissenschaften entwickelt. Die Anwendung der konfokalen Mikroskopie am Drosophila NMJ ermöglicht es den Forschern, synaptische Informationen zu gewinnen, die sowohl quantitative Daten zur Synapsenhäufigkeit als auch detaillierte Einblicke in ihre Morphologie umfassen. Die diffuse Verteilung und der begrenzte visuelle Bereich des TEM stellen jedoch Herausforderungen für die Ultrastrukturanalyse dar. In dieser Studie wird eine innovative und effiziente Probenvorbereitungsmethode vorgestellt, die den herkömmlichen Ansatz übertrifft. Das Verfahren beginnt mit dem Platzieren eines Metallnetzes am Boden einer Flasche oder eines Reagenzglases mit flachem Boden und dem Positionieren der Larvenproben auf dem Netz. Ein zusätzliches Netz wird über die Proben gelegt, um sicherzustellen, dass sie zwischen den beiden Netzen positioniert sind. Die fixierten Proben werden gründlich dehydriert und infiltriert, bevor mit dem Einbettungsverfahren fortgefahren wird. Dann erfolgt die Einbettung der Proben in Epoxidharz in einer flachen Blattweise, die die Vorbereitung der Muskeln für die Positionierung und Schnitte ermöglicht. Mit diesen Schritten können alle Muskeln der Drosophila-Larven lichtmikroskopisch sichtbar gemacht werden, was die spätere Positionierung und Schnittbestimmung erleichtert. Überschüssiges Harz wird nach dem Lokalisieren des 6. und 7. Muskels der Körpersegmente A2 und A3 entfernt. Es wird eine serielle ultradünne Schnittung des 6. oder 7. Muskels durchgeführt.
Einleitung
Die Elektronenmikroskopie ist eine der idealsten Methoden zur Untersuchung der Ultrastruktur biologischer Materialien, mit der die innere Struktur von Zellen auf der Nanoskala auf der Nanoskala1 visuell und genau demonstriert werden kann. Aufgrund der Komplexität des Probenvorbereitungsprozesses und der hohen Kosten ist die Elektronenmikroskopie jedoch nicht so beliebt wie die Lichtmikroskopie. Jüngste Fortschritte in der Elektronenmikroskopie haben zu einer deutlichen Verbesserung der Bildqualität geführt, die mit einer bemerkenswerten Reduzierung der damit verbundenen Arbeitsbelastung einhergeht. Daher hat die Elektronenmikroskopie eine wichtige Rolle bei der Weiterentwicklung wissenschaftlicher Erkenntnisse in verschiedenen Bereichen übernommen2.
Drosophila ist ein hervorragendes Tiermodell für die Durchführung genetischer Manipulationen, um die räumliche und zeitliche Expression von Zielgenen präzise zu kontrollieren3. Außerdem hat Drosophila die Vorteile einer kurzen Wachstumsphase und einer einfachen Aufzucht im Vergleich zu Säugetiermodellen; Daher wird Drosophila in der Morphologieforschung häufig verwendet 4,5.
Bei Drosophila-Larven sind die Boutons der neuromuskulären Verbindung (NMJ) in den Muskeln weit verbreitet 6,7, und die Immunfärbung von NMJ kann leicht Aufschluss über die Synapsenmenge und -morphologie geben 8,9 . Die NMJ-Boutons im 6./7. Muskel der Segmente A2 und A3 eignen sich gut für quantitative und morphologische Untersuchungen mittels Lichtmikroskopie. Dies liegt an ihrer Größe und Häufigkeit 10,11. Daher gelten Drosophila-Larven NMJs als nützliches Modell für die neurowissenschaftliche Forschung12.
Es ist jedoch schwierig, die NMJ-Bouton-Ultrastruktur mit dem TEM zu beobachten. Da das Scanfenster der Transmissionselektronenmikroskopie schmal ist, ist es schwierig, die weit verteilten NMJ-Boutons13 zu positionieren. Der andere Grund ist, dass die Körperwand von Drosophila während des Alkoholdehydratisierungsschritts des Probenvorbereitungsprotokolls7 anfällig für Kräuseln ist.
In traditionellen Studien wurden in der Regel Boutons zwischen dem 6. und 7. Muskel des A2- und A3-Segments als Probenmaterial ausgewählt, da sie häufig vorkommen und eine Größevon 14,15 haben. Der 6. und 7. Muskel des Segments A2 undA 3 sind größer als die anderen Muskeln und enthalten mehr Boutons. Bei der Vorbereitung der Proben für die Elektronenmikroskopie neigten die fixierten Proben jedoch dazu, dünn zu werden und sich zu kräuseln, was zu einer Fehlpositionierung des 6. und 7. Muskels desA2- undA3-Segments führte.
Wir berichten hiermit über ein neues Verarbeitungsverfahren, das das Kräuseln der Proben im Vergleich zur traditionellen Methode der Probenvorbereitung 7,16 wirksamer verhindert, indem es die Proben während der anschließenden Dehydratisierung flach bleiben lässt, wodurch eine bessere Positionierung der neuromuskulären Verbindungen der Drosophila-Larven ermöglicht wird.
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Protokoll
HINWEIS: Über die in diesem Artikel verwendete Methode zur Probenvorbereitung der Transmissionselektronenmikroskopie wurde bereits berichtet16. Es ist wichtig zu beachten, dass die Auswahl der Reagenzien und die Anpassung der Dosierung je nach Probe notwendig sind. Es gibt viele giftige chemische Reagenzien, die bei der Probenvorbereitung verwendet werden, daher muss der Bediener bestimmte Schutzmaßnahmen ergreifen, wie z. B. das Tragen von Schutzkleidung und Handschuhen und das Arbeiten in einem Abzug.
1. Verfahren zum Sezieren, Fixieren und Platzieren
- Dissektion
- Die wandernden Larven des späten 3. Stadiums werden in Jan-Lösung präpariert und die gesamte Körperwand auf der Grundlage der Standardverfahren17 erhalten. Bereiten Sie Jans Lösung wie folgt vor: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35 mM Saccharose, 5 mM HEPES, pH 7,4
HINWEIS: Die Körperwand von Drosophila-Larven bezieht sich auf die äußere Hülle oder das Integument des Larvenstadiums der Fruchtfliege Drosophila. Dazu gehören die Kutikula, die Epidermiszellen und das darunterliegende Gewebe, das das Exoskelett der Larve bildet. Die Körperwand bietet strukturelle Unterstützung und Schutz und dient als Barriere zwischen dem Larvenkörper und der äußeren Umgebung17.
- Die wandernden Larven des späten 3. Stadiums werden in Jan-Lösung präpariert und die gesamte Körperwand auf der Grundlage der Standardverfahren17 erhalten. Bereiten Sie Jans Lösung wie folgt vor: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35 mM Saccharose, 5 mM HEPES, pH 7,4
- Fixierung
- Fixieren Sie die Larvenkörperwand in der Präparierkammer bei 4 °C über Nacht mit dem Fixiermittel. Zur Herstellung des Fixiermittels 2 % Glutaraldehyd und 2 % Formaldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,4) mischen
- Spülen Sie die Proben mehrmals mit Natriumcacodylatpuffer.
- Bereiten Sie 1% OsO4 in Cacodylatpuffer vor. Die Proben werden 2 h lang in 1 %OsO 4 fixiert, gefolgt von mehreren Spülungen in destilliertem Wasser.
HINWEIS: Die doppelte Fixierung mit Aldehyden und OsO4 bietet einen besseren Schutz der zellulären Ultrastruktur. Außerdem kann OsO4 das Probengewebe färben, wodurch der Kontrast zwischen dem Licht und der Probe deutlicher wird18. - Färben Sie die Proben der neuromuskulären Verbindung von Drosophila 2 Stunden lang mit 2 % gesättigtem Uranylacetat, gefolgt von mehreren Spülungen mit deionisiertem Wasser (Abbildung 1A).
- Platzierung der Probe
- Schneiden Sie mit einer Schere zwei runde Stücke aus Metallgewebe ähnlicher Größe (Porengröße 270 μm) ab.
- Legen Sie vorher ein Metallgewebe (270 μm) auf den Boden einer Flasche mit flachem Boden.
- Legen Sie die fixierten Larvenproben auf das Netz und legen Sie dann ein weiteres Netz darauf, so dass die Proben zwischen den beiden Netzen platziert werden.
2. Dehydrierung
HINWEIS In dieser Arbeit wurde die Ethanolgradienten-Dehydratisierungsmethode verwendet.
- Die Proben werden in einem ansteigenden Konzentrationsgradienten von Ethanol nacheinander (50 %, 70 %, 85 %, 95 % je einmal, 100 % zweimal) jeweils 20 Minuten lang bei 4 °C dehydriert.
- Spülen Sie die Proben zweimal jeweils 5 Minuten lang mit Propylenoxid bei Raumtemperatur (Abbildung 1C).
3. Infiltration
HINWEIS: Die Infiltration ist einer der notwendigen Schritte für die Vorbereitung der TEM-Proben. Die Infiltration ermöglicht den allmählichen Ersatz des Dehydratisierungsmediums durch das Einbettmedium in der Probe, um das Füllen des Zellzwischenraums mit dem Einbettmedium19 zu ermöglichen.
- Die Proben werden in die gemischte Lösung aus Propylenoxid und Epoxidharz in einem Verhältnis von 1:1 und 1:2 für jeweils 1 h gegeben, gefolgt von reinem Epoxidharz für 2 h bei Raumtemperatur.
4. Einbetten
- Bereiten Sie eine Polyethylenfolie vor und schneiden Sie sie in ein großes Quadrat (ca. 5 × 5 cm) und eine kleine rechteckige Hohlstütze (ca. 2 × 2 cm). Klebe das kleine Quadrat mit dem großen Quadrat zusammen.
- Ausreichend Epoxidharz in der Mitte des großen Quadrats vorpositionieren.
- Legen Sie die Proben mit der Muskelseite nach oben in das vorpositionierte Epoxidharz. Verwenden Sie ein Stereoskop.
- Geben Sie einige Tropfen Harz zu den Proben und bedecken Sie sie dann mit PE-Folie (etwas größer als der Abstandshalter) (Abbildung 1D-E).
- Polymerisieren Sie die Proben bei 37 °C, 42 °C bzw. 60 °C für 24 Stunden (Abbildung 1F).
5. Verfahren der Sektion
- Entfernen Sie die überschüssigen Teile der Larvenkörperwand mit einer scharfen Klinge und behalten Sie ein Trapez bei, einschließlich des Segments A2/A 3 .
HINWEIS: Die obere Linie sollte sich in der Nähe des 13. Muskels befinden, und die Grundlinie sollte von der Probe weg zum Epoxidharz sein. Die Höhe zwischen der Ober- und Grundlinie beträgt ca. 5-8 mm. - Entfernen Sie das Trapez vom Rest der Probe und kleben Sie es mit dem A/B-Kleber auf die mit Harz gefüllte Kapsel.
- Bestätigen Sie die Position des 6. und 7. Muskels des Segments A2 und A3 unter dem Lichtmikroskop (Abbildung 1G) und halten Sie die Tangentialebene parallel zum 6. Muskel.
- Ein Fünftel der Probe entlang der beiden Seiten des Segments A3 abschneiden.
HINWEIS: Entfernen Sie den größten Teil des 6. Muskels und behalten Sie 1/3 der Breite des 7. Muskels bei. - Bereiten Sie mit einem ultradünnen Mikrotom einen ultradünnen Schnitt der Probe vor, beginnend mit dem 6. Muskel.
HINWEIS: Jede Scheibe ist ca. 90 nm dick. - Befestigen Sie so viele Scheiben wie möglich an jedem Kupfernetz.
- Führen Sie die Transmissionselektronenmikroskopie wie zuvor beschriebendurch 16.
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Ergebnisse
Die Körperwand der Drosophila-Larve besteht aus 30 identifizierbaren Muskelfasern, die in einem regelmäßigen Muster angeordnet sind, und sieht nach der Dissektion und Fixierung wie eine dünne Scheibe aus21 (Abbildung 1A). Die Probe bleibt während des Dehydratisierungsprozesses aufgrund des Vorhandenseins der Metallgewebe flach (Abbildung 1B, C). Der Körpermuskel der Larve wird in einer dünnen Platte aus Epoxidhar...
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Diskussion
Drosophila-Larvenproben neigen dazu, sich während der Dehydrierung zusammenzurollen, da die Proben dünn sind, was es schwierig macht, den neuromuskulären Übergang genau zu lokalisieren, wodurch die Schwierigkeit und der Arbeitsaufwand für die Probenvorbereitung erhöht werden. Die traditionelle Verbesserung besteht darin, die Probe7 zu kürzen, aber die Proben waren immer noch unterschiedlich stark gewellt.
Bei unserer Methode gibt es zwei kritische Schritte: Ers...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China Grant 32070811 und dem Analysis Test Fund 11240090971 der Southeast University (China) unterstützt. Wir danken dem Labor für Elektronenmikroskopie und dem Zentrum für morphologische Analyse, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, China.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating |
| Agent Drosophila Stocks | Bloomington | none | Die in dieser Studie verwendeten Wildtyp-Kontroll-Drosophila-Stämme waren alle W1118 und wurden nach Standardkulturmethoden aufgezogen |
| Reagenzgläser aus Glas mit flachem Boden | Haimen Chenxing Experimentelle Ausrüstung Unternehmen | keine | Reagenzgläser aus Glas mit flachem Boden (Flasche)mit Schwammstopfen (oder Flaschenverschluss) |
| K4M Vernetzer | Agar Scientific | Kat# 1924B | Die Einbettungsharze basieren auf einer hochvernetzten Acrylat- und Methacrylat-Formel |
| K4M Harz (Monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Harz Monomer |
| Polyvinyl Film | Haimen Chenxing Experimentelle Ausrüstung Unternehmen | keine | Transparente Polyethylenfolie ist die beste, Dicke von ca. 0,2 mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI #02827-AF | Dodecenyl Bernsteinsäureanhydrid |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Beschleuniger |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI #02828-AF | Härter für Epoxid |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI SPI #0259-AB | Harz Monomer |
| Stahlgitter | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Netz aus Kupfer oder Edelstahl |
| Transmissionselektronenmikroskopie | Hitachi H-7650 11416692 | Alle Gitter (auf denen Proben gesammelt wurden) wurden mit Bleicitrat gefärbt und unter einer Transmissionselektronenmikroskopie betrachtet. | |
| Ultradünnes Mikrotom | Leica UC7 ultradünnes Mikrotom | 595915 | Alle Schnittvorgänge werden auf einem ultradünnen Mikrotom Leica UC7 mit einem Diamantmesser durchgeführt |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan
