Entwicklung von Leishmania-Speziesstämmen mit konstitutiver Expression von eGFP

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis- und L . donovani-Stämmen verwendet wird, die das Gen für eGFP als stabiles integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Transfizierte Parasiten wurden unter Begrenzung der Verdünnung kloniert, und Klone mit der höchsten Fluoreszenzintensität in beiden Spezies wurden für die weitere Verwendung in Wirkstoff-Screening-Assays ausgewählt.

Zusammenfassung

Protozoen-Parasiten der Gattung Leishmania verursachen Leishmaniose , eine Krankheit mit unterschiedlichen klinischen Manifestationen, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen sind. Eine Infektion mit L. donovani kann zu einer tödlichen viszeralen Erkrankung führen. In Panama, Kolumbien und Costa Rica ist L. panamensis für die meisten gemeldeten Fälle von kutaner und mukokutaner Leishmaniose verantwortlich. Die Untersuchung einer großen Anzahl von Wirkstoffkandidaten mit den bisher verfügbaren Methoden ist recht schwierig, da sie sehr aufwendig sind, um die Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre Formen des Parasiten zu bewerten oder In-vivo-Assays durchzuführen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Generierung von L. panamensis - und L. donovani-Stämmen mit konstitutiver Expression des Gens, das für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) kodiert, das in den Locus integriert ist, der für 18S rRNA (ssu) kodiert. Das Gen, das für eGFP kodiert, wurde aus einem kommerziellen Vektor gewonnen und durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert, um es anzureichern und Restriktionsstellen für die Enzyme BglII und KpnI hinzuzufügen. Das eGFP-Amplikon wurde durch Agarose-Gel-Reinigung isoliert, mit den Enzymen BglII und KpnI verdaut und in den Leishmania-Expressionsvektor pLEXSY-sat2.1 ligiert, der zuvor mit dem gleichen Enzymsatz verdaut worden war. Der Expressionsvektor mit dem klonierten Gen wurde in E. coli vermehrt, gereinigt und das Vorhandensein des Inserts mittels Kolonie-PCR verifiziert. Das gereinigte Plasmid wurde linearisiert und zur Transfektion von L. donovani - und L. panamensis-Parasiten verwendet. Die Integration des Gens wurde mittels PCR nachgewiesen. Die Expression des eGFP-Gens wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht. Fluoreszierende Parasiten wurden unter Begrenzung der Verdünnung kloniert, und Klone mit der höchsten Fluoreszenzintensität wurden mittels Durchflusszytometrie ausgewählt.

Einleitung

Protozoische Parasiten der Gattung Leishmania verursachen Leishmaniose, eine Krankheit mit einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen. Diese Krankheit ist in 98 Ländern verbreitet und ihre jährliche Inzidenz wird auf 0,9 bis 1,6 Millionen Fälle geschätzt¹. Leishmania-Arten, die für den Menschen pathogen sind, werden in zwei Untergattungen unterteilt, nämlich L. (Leishmanien) und L. (Viannia). Infektion mit einigen Arten, die zur L. Untergattungen (Leishmania), wie L. donovani und L. infantum, können zu viszeraler Leishmaniose (VL) führen, die unbehandelt tödlich verläuft². Arten, die zur L. (Viannia) sind mit den meisten Fällen von kutaner Leishmaniose (CL) und mukokutaner Leishmaniose (MCL) in Mittel- und Südamerika, insbesondere in Panama, Kolumbien und Costa Rica, assoziiert, wobei L. panamensis der wichtigste ätiologische Erreger dieser klinischen Erscheinungsformen ist ^3,4.

Die bestehende Chemotherapie gegen Leishmanien, die Medikamente wie fünfwertige Antimonia, Miltefosin und Amphotericin B umfasst, ist hochgiftig und teuer. Darüber hinaus sind in den letzten Jahrzehnten erhöhte Arzneimittelresistenzen zu den Faktoren hinzugekommen, die die wirksame Behandlung von Patienten weltweit beeinträchtigen⁵. Zwischen den Arten der Gattung Leishmania wurden erhebliche Unterschiede in Bezug auf die Arzneimittelempfindlichkeit nachgewiesen, insbesondere zwischen Arten der Neuen und der Alten Welt ^6,7. Aus diesen Gründen ist es notwendig, die Anstrengungen auf die Identifizierung und Entwicklung neuer Medikamente gegen Leishmanien zu richten, wobei den speziesspezifischen Ansätzen besondere Aufmerksamkeit zu widmen ist. Die Untersuchung großer Bibliotheken von Wirkstoffkandidaten mit herkömmlichen Methoden ist recht schwierig, da diese Methoden sehr mühsam sind, um die Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre Amastigoten zu bewerten oder In-vivo-Experimente durchzuführen⁸; Daher war es notwendig, neue Techniken zu entwickeln, die diese Nachteile verringern, einschließlich der Implementierung von Reportergenen und der Entwicklung von phänotypischen High-Content-Screening-Assays⁹.

Die Verwendung von Reportergenen hat gezeigt, dass sie das Potenzial haben, die Effizienz des Wirkstoff-Screening-Prozesses zu erhöhen, da sie die Entwicklung von Hochdurchsatz- und In-vivo-Assays erleichtert. Rekombinante Leishmania-Parasiten, die mehrere Reportergene exprimieren, wurden von verschiedenen Forschungsgruppen erzeugt. Reportergene wie β-Galactosidase, β-Lactamase und Luciferase wurden in mehrere Leishmania-Spezies unter Verwendung episomaler Vektoren eingeführt und zeigen einen begrenzten Nutzen für das Wirkstoff-Screening in extra- und intrazellulären Formen des Parasiten 10,11,12,13,14,15. Diese Ansätze haben die Einschränkung, dass sie einen starken Selektionsdruck in der Kultur erfordern, um die Eliminierung des episomalen Konstrukts zu vermeiden, sowie die Verwendung zusätzlicher Reagenzien, um die Aktivität des Reportergens aufzudecken. Umgekehrt wurden das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Variante, das verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP), aufgrund ihrer Flexibilität und Sensitivität sowie der Möglichkeit, den Screening-Prozess mittels Durchflusszytometrie oder Fluorometrie zu automatisieren, bei der Generierung einer großen Anzahl transgener Leishmania-Stämme für In-vitro-Wirkstoff-Screening-Assays verwendet^{15, 16,17,18,19}. Trotz vielversprechender Ergebnisse waren die Kulturen dieser transgenen Stämme sehr heterogen in ihren Fluoreszenzwerten, da die Anzahl der Kopien des GFP-Gens nicht bei allen Parasiten gleich war. Darüber hinaus erforderte die Aufrechterhaltung der Fluoreszenz einen konstanten Selektionsdruck auf die Parasiten in der Kultur, da das GFP-Gen in einem episomalen Konstrukt eingeführt wurde.

Aus den oben genannten Gründen haben sich viele Bemühungen auf die Entwicklung neuer Methoden zur Herstellung stabiler rekombinanter Stämme konzentriert. Diese Bemühungen stützten sich hauptsächlich auf die Integration von Reportergenen in ribosomale Loci, wobei die höheren Transkriptionsraten ribosomaler Gene genutzt wurden²⁰. Es wurden Stämme von L. infantum und L. amazonensis erzeugt, die die Gene integriert haben, die für β-Galactocidase²¹, IFP 1.4, iRFP²² und tdTomato²³ kodieren, und sie wurden auf ihre Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening-Assays untersucht. Verschiedene Gruppen haben L. donovani-Stämme entwickelt, die GFP konstitutiv exprimieren, indem sie ihr kodierendes Gen durch homologe Rekombination in den ribosomalen RNA-Locus 18S (ssu-Locus) integrieren^24,25; Sie zeigten eine stabile und homogene GFP-Expression in der transfizierten Population, einschließlich intrazellulärer Amastigoten 24,25, und sie wurden erfolgreich in Wirkstoff-Screening-Assays implementiert^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 entwickelten Stämme von L. major und L. infantum, die GFP als integriertes Transgen exprimieren. Sie verwendeten den Integrationsvektor pLEXSY, der ursprünglich für die transgene Expression von Proteinen in einem System mit L. tarentolae als Wirt entwickelt wurde²⁸. Der pLEXSY-GFP-Vektor hat sich als sehr effizient für die Generierung verschiedener Leishmania-Stämme erwiesen, die GFP 24,25,27,29,30 konstitutiv exprimieren. Bei diesen Parasiten ist die Fluoreszenz homogen und bleibt in den intrazellulären Formen erhalten, so dass sie in Fußballenläsionen infizierter Mäuse nachgewiesen werden^{kann 27}.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis - und L. donovani-Stämmen verwendet wird, die das für eGFP kodierende Gen als integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Die durch diesen Prozess erzeugten Stämme werden in unserem Labor für die Durchführung von Medikamenten-Screening-Assays verwendet, die die potenzielle Anti-Leishmanie-Aktivität von Molekülen natürlichen und synthetischen Ursprungs bewerten.

Protokoll

Um die Proben steril zu halten, sollten alle Schritte, die eine Parasitenkultur beinhalten, in einer Haube der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) oder gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften durchgeführt werden. Eine grafische Zusammenfassung dieses Protokolls finden Sie in Abbildung 1.

Abbildung 1: Zusammenfassendes Schema des Protokolls zur Generierung von eGFP-exprimierenden L. panamensis- und L. donovani-Parasiten unter Verwendung der pLEXSY-2.1-Vektorfamilie. Alle sechs Hauptabschnitte, die in diesem Artikel beschrieben werden, sind hier dargestellt. 1) Amplifikation und Insertion des eGFP-Gens in den pLEXSY-2.1-Vektor: Das Zielgen wird amplifiziert, wobei die Erkennungsstellen für die Enzyme KpnI und BglII hinzugefügt werden, und sowohl das eGFP-Amplikon als auch das pLEXSY-Plasmid werden sequenziell mit beiden Enzymen für die anschließende Ligation mit T4-Ligase verdaut. 2) Linearisierung des pLEXSY-Expressionsplasmids: Das pLEXSY + eGFP-Konstrukt wird mit SwaI zur Linearisierung und Aufreinigung der 7-8 kbp-Expressionskassette verdaut. 3) Transfektion und 4) polyklonale Selektion: Leishmania-Promastigoten werden mit der Expressionskassette durch Elektroporation transfiziert und zur antibiotischen Selektion rekombinanter Parasiten wieder in Kultur gebracht. Die Fluoreszenz der Parasiten wird durch Durchflusszytometrie bestätigt. 5) Bestätigung der genomischen Integration und 6) Klonierung durch Begrenzung der Verdünnung: Die Integration der pLEXSY-eGFP-Expressionskassette wird durch diagnostische PCR bestätigt, wobei ein Vorwärtsprimer mit der Expressionskassette und ein Reverse-Primer mit einer Chromosomensequenz hybridisiert wird, die in der Expressionskassette fehlt. Transfizierte Kulturen könnten durch Klonen durch Begrenzung der Verdünnung für fluoreszierende Parasiten angereichert werden, und Klone mit den höchsten mittleren Fluoreszenzintensitäten können für weitere Anwendungen ausgewählt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Amplifikation und Insertion des eGFP-Gens in den pLEXSY-2.1-Vektor

1. Amplifikation des eGFP-Gens
   ANMERKUNG: Da dieses Protokoll die pLEXSY-2.1-Vektorfamilie (siehe Materialtabelle) für die konstitutive Expression von Zielproteinen nach der Integration der Expressionskassette in den chromosomalen 18S rRNA-Locus (ssu) von Leishmania-Spezies verwendet, besteht der erste Schritt darin, die Sequenzen in das eGFP-Gen einzuführen, die die Restriktionsstellen enthalten, die ihre Insertion in pLEXSY-2.1-Vektoren ermöglichen. Da eGFP in diesem Fall nur zytosolisch exprimiert werden muss, wurden die Restriktionsstellen für die Enzyme BglII und KpnI an den 5'- bzw. 3'-Enden des eGFP-Gens hinzugefügt. Die Klonierung mit KpnI führt zur Fusion des Zielproteins mit einem C-terminalen Polyhistidin-Tag aus sechs Resten, gefolgt von einem Stoppcodon, das im pLEXSY-2.1-Plasmid kodiert ist, um das gewünschte Protein weiter aufzureinigen. Aus diesem Grund enthält die umgekehrte Primersequenz kein Stoppcodon.
   1. Abhängig von der Plasmidquelle für eGFP ist die Zielsequenz mit einem Restriktionsanalysewerkzeug wie NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)³¹ zu analysieren, um sicherzustellen, dass sie keine internen Stellen für die für die Klonierung verwendeten Restriktionsenzyme (BglII und KpnI) oder für SwaI, das Enzym, das für die Vektorlinearisierung vor der Transfektion verwendet wird, enthält.
   2. Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die eGFP-Amplifikation, die die Restriktionssequenzen BglII und KpnI enthalten. Zum Beispiel war die eGFP-Quelle für dieses Protokoll das pEGFP-N1-1X-Plasmid³², und die Primersequenzen waren die von Bolhassani et ^al.27 berichteten:
      Vorwärts-Primer (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII-Restriktionsstelle in Fettdruck).
      Reverse Primer (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI Restriktionsstelle in Fettdruck).
   3. Amplifikation des Zielgens mit einer High-Fidelity-Polymerase, um die Erhaltung der kodierenden Sequenz zu gewährleisten. Führen Sie beispielsweise für die Primer EGFP1 und EGFP2 das PCR-Zyklusprotokoll aus, wie von Bolhassani et ^al.27 berichtet. Es wird eine anfängliche Denaturierung von 2 Minuten bei 94 °C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 57 °C und 1 min bei 72 °C. Führen Sie einen letzten Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C durch. Geben Sie die Primer in einer Endkonzentration von 0,2 μM hinzu.
   4. Reinigen Sie das Fragment unter Verwendung eines herkömmlichen PCR-Produktreinigungskits oder einer Standard-Natriumacetat- und Ethanolfällung, wie an anderer Stelle beschrieben³³.
2. Insertion des eGFP in den pLEXSY-2.1 Expressionsvektor
   1. Kürzen Sie die Enden des eGFP-PCR-Produkts mit BglII und KpnI gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      1. Zunächst wird die Reaktion für das Enzym mit der geringsten Salzkonzentration (in diesem Fall KpnI) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt und 1 h bei 37 °C inkubiert.
      2. Dann werden 100 mM NaCl und 10 Einheiten BglII zugegeben und 15 Minuten inkubiert. Reinigen Sie die Reaktion, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben.
   2. Verdauen Sie den pLEXSY-Expressionsvektor mit BglII und KpnI gemäß dem in Schritt 1.2.1 beschriebenen sequentiellen Aufschlussprotokoll.
   3. Ligatieren Sie den pLEXSY-Vektor und das eGFP-Gen mit der T4-Ligase in einem molaren Verhältnis von 1:3 (Vektor:Insert). 100 ng verdautes pLEXSY und 28 ng verdautes eGFP-Produkt werden kurzzeitig zu einer 20-μl-Reaktion gegeben, die Ligasepuffer in einer Endkonzentration von 1x und 3 Einheiten T4-DNA-Ligase enthält. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   4. Transformieren Sie kompetente E. coli-Zellen , wie XL-10, DH5α oder DH10B, mit dem in Schritt 1.2.3 erhaltenen Ligationsprodukt unter Verwendung von Standardtransformationsprotokollen³³. Die transformierten Zellen werden in Luira-Bertani (LB)-Ampicillin-Agar plattiert und 24 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, um rekombinante Klone auszuwählen (pLEXSY-Plasmide sind in E. coli bei 30 °C stabiler als bei 37 °C).
   5. Screening auf das Vorhandensein des Inserts in den Plasmiden mittels Kolonie-PCR.
      1. Einzelne Kolonien auswählen, in 20 μl nukleasefreiem Wasser resuspendieren, 15 Minuten lang bei 95 °C erhitzen und 1 μl des Lysats als DNA-Vorlage für die Kolonie-PCR entnehmen. Verwenden Sie den in Schritt 1.1.2 beschriebenen Vorwärtsprimer für die eGFP-Amplifikation (in diesem Beispiel EGFP1) und den Primer A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') als umgekehrten Primer²⁹.
      2. Der Primer A264 ist so konzipiert, dass er 80 bp nach dem Stoppcodon des Inserts in pLEXSY-2.1-Expressionsvektoren annealisiert. Verwenden Sie beispielsweise für das Primerpaar EGFP1 + A264 ein PCR-Zyklusprotokoll, das aus einer anfänglichen Denaturierung von 2 Minuten bei 94 °C besteht, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 50 °C und 1 min bei 72 °C. Führen Sie einen letzten Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C durch. Die Primer werden in einer Endkonzentration von 0,2 μM zugegeben.
         HINWEIS: Das erwartete Produkt mit diesem Primer-Set ist 859 bp lang. Die Glühstellen für die Primer EGFP1 und A264 sind in Abbildung 2 dargestellt.
   6. Bereiten Sie die gereinigte Plasmid-DNA aus einem positiven Klon für die anschließende Transfektion unter Verwendung eines handelsüblichen Plasmid-Isolierungskits oder einer alkalischen Standardfällung^{vor 33}. Verwenden Sie 50 ml einer Nachtkultur bei 30 °C zur Isolierung von mindestens 10 μg Plasmid/positivem Klon.

2. Linearisierung des pLEXSY-Expressionsplasmids

1. Verwenden Sie mindestens 10 μg des gereinigten pLEXSY-eGFP-Plasmids für den Aufschluss mit SwaI (Erkennungsstelle: 5'-ATTTAAAT-3'). 3-4 h bei 25 °C verdauen und bei 65 °C 20 min erhitzen.
2. Lassen Sie das Aufschlussprodukt in Agarose-Gelelektrophorese laufen, um die resultierenden Fragmente zu trennen. Dieser Aufschluss erzeugt zwei Fragmente, ein 2,9 kbp großes Fragment, das die für die Replikation und Selektion in E. coli notwendigen Elemente repräsentiert, und ein 7-8 kbp großes Fragment, das die linearisierte Expressionskassette darstellt.
3. Reinigen Sie die Expressionskassette mit einem handelsüblichen Agarose-Gel-Extraktionskit.

3. Transfektion von L. panamensis und L. donovani durch Elektroporation

ANMERKUNG: Die Leishmania-Kultur wird wie an anderer Stelle beschrieben^{durchgeführt 34}. In diesem Beispiel wurden L. panamensis und L. donovani Promastigoten in Schneiders Insektenmedium kultiviert, mit 20 % (v/v) fötalem Kälberserum (FBS) und 50 μg/ml Gentamicin ergänzt und bei 26 °C inkubiert.

1. Züchten Sie die Parasitenkulturen, bis genügend Promastigoten in der Log-Phase oder in der frühen stationären Phase vorhanden sind, um etwa 4 x 10⁷ Parasiten pro Transfektion zu verwenden. Die maximale Zelldichte pro Kulturkolben vor Erreichen der stationären Phase kann je nach Leishmania-Spezies und wie gut die Stämme an die Laborbedingungen angepasst sind, variieren. Fassen Sie bei Bedarf den Inhalt mehrerer Kulturflaschen zusammen.
2. Zentrifugieren Sie die Parasitenkultur bei 2.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT).
3. Das Pellet wird in einem Elektroporationspuffer bei 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2_HPO4 und 6 mM Glukose; pH 7,5)²⁷ resuspendiert, um eine Konzentration von 1 x 10⁸ Parasiten/ml zu erhalten. 10 Min. auf Eis legen.
   HINWEIS: Der Elektroporationspuffer muss vor der Verwendung durch Filtern sterilisiert werden.
4. Parallel dazu konstruieren Pre-Chill-Röhrchen mit 2-10 μg linearisiertem pLEXSY-eGFP in einem maximalen Volumen von 50 μL Wasser oder 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0) und Elektroporationsküvetten von d = 2 mm.
5. Geben Sie 350 μl vorgekühlte Parasiten in das Röhrchen mit dem linearisierten Plasmid und geben Sie die gesamten 400 μl in die Elektroporationsküvette auf Eis. Parallel dazu werden die Parasitenzellen ohne Plasmid-DNA als Negativkontrolle elektropoliert.
6. Elektropolieren Sie mit einem dieser beiden Protokolle:
   Exponentieller Zerfall: 450 V, 450 μF, ein Puls.
   Zeitkonstante: 450 V, T = 3,5 ms, ein Impuls.
   HINWEIS: Diese Protokolle wurden mit einem kommerziellen Genpulser (Table of Materials) mit PC- und CE-Modulen ausgeführt.
7. Stellen Sie die Küvette für 10 Minuten wieder auf Eis und überführen Sie die elektroporierten Parasiten in 5 ml des geeigneten Nährmediums. In diesem Beispiel wurde Schneiders Insektenmedium verwendet, das mit 20% (v/v) FBS angereichert wurde. 20 h bei 26 °C inkubieren.

4. Polyklonale Selektion in Kultur

1. Etwa 20 Stunden nach der Elektroporation werden die Kulturen unter dem Mikroskop beobachtet. Mindestens die Hälfte der Parasitenpopulation sollte eine optisch gute Morphologie und Motilität aufweisen (tropfenförmige Promastigoten mit oszillierendem Flagellum, das sich durch das Medium bewegt und/oder aktive Parasitenaggregate bildet). Fügen Sie je nach verwendetem pLEXSY-Plasmid das geeignete selektive Antibiotikum hinzu. In diesem Beispiel wird pLEXSY-sat2.1 verwendet, das Streptothricin-Acetyltransferase als Selektionsmarker enthält. Verwenden Sie daher Nourseothricin als selektives Antibiotikum in einer Konzentration von 0,1 mg/ml.
2. Verfolgen Sie die Kulturen mikroskopisch, bis ein deutlicher Unterschied zwischen den mit und ohne Plasmid-DNA elektroporierten Parasiten zu sehen ist.
3. Verifizieren Sie die Fluoreszenz des Parasiten durch Durchflusszytometrie.
   1. 1 ml der stationären Phasenkultur bei 2.000 x g für 3 min bei RT zentrifugieren. Zweimal in PBS waschen und das endgültige Pellet in 1 ml PBS resuspendieren.
      HINWEIS: Die Fluoreszenz von eGFP kann im FL1-Kanal der meisten kommerziellen Zytometer nachgewiesen werden. Die Verstärkungseinstellungen für die Vorwärts- und Seitenstreuung sowie der FL1-Kanal können je nach Zytometer variieren. Für dieses Beispiel wurde ein CyFlow-Raumzytometer (Sysmex) verwendet.
   2. Führen Sie die Proben aus, erfassen Sie 20.000 Ereignisse mit einer Geschwindigkeit von 0,5 μl/s, und legen Sie die Verstärkungswerte für die Kanäle Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) und Fluoreszenz 1 (FL-1) auf 225,0, 200,0 bzw. 520,0 fest. Führen Sie eine Kontrollprobe mit nicht-fluoreszierenden Parasiten durch, um die Parasitenpopulation in einem FSC- und SSC-Punktdiagramm zu bestimmen.
   3. Erzeugen Sie ein Gatter (G1), das die Parasitenpopulation enthält, und filtern Sie den FL-1-Kanal durch dieses Tor, um die Autofluoreszenz von Promastigoten zu bestimmen und ein Bereichsgatter (G2) für den FL-1-Kanal einzustellen.
   4. Führen Sie die transfizierten Parasiten aus, um zu überprüfen, ob Fluoreszenz vorhanden ist. Notieren Sie den Prozentsatz der fluoreszierenden Parasiten in G1 und die mittlere Fluoreszenzintensität in G2.

5. Bestätigung der genomischen Integration

ANMERKUNG: Die Integration der pLEXSY-eGFP-Expressionskassette kann durch diagnostische PCR bestätigt werden, wobei ein Vorwärtsprimer verwendet wird, der mit der Expressionskassette hybridisiert (variiert je nach verwendetem pLEXSY-2.1-Vektor) und der umgekehrte Primer F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3'), der zu einer chromosomalen ssu-flankierenden Sequenz hybridisiert, die in der Expressionskassette fehlt. In diesem Beispiel wird der F2999-Forward-Primer (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') verwendet, da er in der pLEXSY-sat2.1-Expressionskassette hybridisiert. Eine schematische Darstellung der integrierten Expressionskassette und der Primer-Annealing-Stellen für die diagnostische PCR ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Reinigen Sie die genomische DNA aus 2-5 ml einer stationären Parasitenkultur durch konventionelle Phenol/Chloroform-Extraktion³⁵ oder mit einem handelsüblichen Kit.
2. Die diagnostische PCR für pLEXSY-sat2.1 wird unter Verwendung eines Zyklusprotokolls durchgeführt, das aus einer anfänglichen Denaturierung von 2 Minuten bei 94 °C besteht, gefolgt von 30 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 30 s bei 53 °C und 1 min bei 72 °C. Führen Sie einen letzten Verlängerungsschritt von 10 Minuten bei 72 °C durch. Die Primer werden in einer Endkonzentration von 0,2 μM zugegeben.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der integrierten Expressionskassette. Kästchen, die als Chr-S (grau) gekennzeichnet sind, stellen die benachbarten chromosomalen Sequenzen des 18S rRNA-Locus (ssu) dar, in den die Expressionskassette integriert ist. Die integrierte Expressionskassette besteht aus 5'- und 3'-Sequenzen (blau) für die homologe Rekombination in den ssu-Locus , einem zusätzlichen ribosomalen Leishmania-Promotor (rot) für eine verbesserte Proteinproduktion, dem eGFP-Gen (grün), einem Selektionsmarkergen (gelb) und drei nicht translatierten Regionen (hellgrau)), nämlich utr1, 2 und 3, die die Spleißsignale für die posttranskriptionelle mRNA-Prozessierung zur optimierten Expression von eGFP und des Selektionsmarkers in Leishmania-Parasiten liefern. Annealing-Stellen für Vorwärts- und Reverse-Primer, die zur Überprüfung des Insert-Vorhandenseins mittels Kolonie-PCR (Schritt 1.2.5) verwendet werden, sind durch die schwarzen Pfeile gekennzeichnet, die als cpcr-fwd (EGFP1-Primer) bzw. cpcr-rev (A264-Primer) gekennzeichnet sind und ein 859-bp-Produkt abgrenzen. Die Annealing-Stellen für Vorwärts- und Reverse-Primer, die für den Nachweis der genomischen Integration mittels diagnostischer PCR (Schritt 5) verwendet werden, sind durch die schwarzen Pfeile gekennzeichnet, die als sat-fwd (F2999-Primer) bzw. ssu-rev (F3002-Primer) gekennzeichnet sind und ein 2.271-bp-Produkt abgrenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Klonen durch Begrenzung der Verdünnung (optional)

1. Nach Bestätigung der Fluoreszenz durch Durchflusszytometrie wird eine Verdünnung rekombinanter Parasiten in einer Konzentration von fünf Promastigoten/ml^{hergestellt 36}.
2. Geben Sie 100 μl dieser Verdünnung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Auf diese Weise werden die Platten mit einer durchschnittlichen Dichte von 0,5 Promastigoten/Vertiefung ausgesät, wodurch sichergestellt wird, dass einige Vertiefungen einen einzigen Parasiten erhalten, während die Wahrscheinlichkeit minimiert wird, mehr als einen Parasiten pro Vertiefung³⁶ zu haben.
3. Lassen Sie den Teller mindestens 12 h ungestört. Verfolgen Sie die Platte mikroskopisch bei einer minimalen Vergrößerung von 100x, bis Vertiefungen mit Parasitenwachstum entdeckt werden.
4. Wenn eine Plattenvertiefung voller Parasiten ist, verwenden Sie den Inhalt, um eine 5-ml-Kultur zu impfen. Dies dauert 1-2 Wochen.
5. Wenn geklonte Kulturen die stationäre Phase erreichen, überprüfen Sie die Fluoreszenz mit Hilfe der Durchflusszytometrie, wie in Schritt 4.3 beschrieben. Wählen Sie die Klone aus, die für weitere In-vitro - und In-vivo-Assays verwendet werden sollen, basierend auf dem Prozentsatz der fluoreszierenden Parasiten und der mittleren Fluoreszenzintensität, die im FL-1-Kanal gemessen wird. Streben Sie Klone mit 98%-99% fluoreszierenden Parasiten an und wählen Sie diejenigen mit der höchsten mittleren Fluoreszenzintensität aus.

Ergebnisse

Nach dem Aufbau des pLEXSY-eGFP-Konstrukts und der Transformation kompetenter E. coli-Zellen erzeugen Kolonien, die das Konstrukt mit dem eGFP-Insert enthalten, nach Durchführung der in Abschnitt 1.2 beschriebenen Kolonie-PCR (Abbildung 3A) ein ca. 859 bp-Produkt. Der vollständige Aufschluss des gereinigten Plasmids aus positiven Kolonien unter Verwendung von SwaI sollte zwei charakteristische Fragmente in der Gelelektrophorese ergeben, ein 2,9 kbp-Fragment, das der Teil de...

Diskussion

Die Vor- und Nachteile verschiedener Reportergene wurden an mehreren Protozoen-Parasiten untersucht. Unter ihnen sind GFP und eGFP intrinsisch fluoreszierend und ermöglichen eine einfache Quantifizierung und Bildgebung. Die Fluoreszenzaktivität dieser Proteine kann mit minimaler Manipulation mittels Fluoreszenzmikroskopie, Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Es wurden nur wenige Studien zur Erzeugung von GFP-exprimierendem L durchgeführt. (Viannia)-Stämmen, trotz der nachgewiesen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96 Well Mikrotiterplatten	Corning	CLS3340	Flachboden, klares, schwarzes Polystyrol, steril, Deckel
	Agarose Sigma-Aldrich	A4718
Ampicillin-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, geeignet für Zellkultur
BglII-Restriktionsenzym	New England BioLabs	R0144S	2.000 Einheiten. 10.000 Einheiten/ml
Zellkulturflaschen	Corning	CLS430168	Oberfläche 25 cm2, schräger Hals, Kappe (Steckdichtung)
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Nicht verfügbar
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G7021	Pulver, BioReagenz, geeignet für Zellkultur, geeignet für Insektenzellkultur, geeignet für pflanzliche Zellkultur, ≥ 99,5%
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	F7524
Gel-Ladepuffer	Sigma-Aldrich	G2526	Die Migrationsgeschwindigkeit variiert mit der Gelzusammensetzung. Vor dem Laden 1:3 bis 1:6 mit der Probe verdünnen.
Gene Pulser Xcell Elektroporationssystem	Bio-Rad	1652660	Das System besteht aus einer Haupteinheit, zwei Zubehörmodulen, dem Kapazitätsextender (CE-Modul) und dem Impulsregler (PC-Modul) sowie einer ShockPod-Küvettenkammer.
Gene Pulser/MicroPulser Elektroporationsküvetten	Bio-Rad	1652086	Packung à 50, 0,2 cm– Spaltsterile Elektroporationsküvette, zur Verwendung mit den Gene Pulser- und MicroPulser-Systemen, für Säugetierzellen und andere eukaryotische Zellen
Gentamicin-Lösung	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in deionisiertem Wasser, flüssig, 0,1 μ m filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkultur
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES Lösung	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7,0-7,6, steril filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkultur
Inverses Mikroskop	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF Restriktionsenzym	New England BioLabs	R3142S	4.000 Einheiten. 20.000 Einheiten/ml
LB Bouillon mit Agar	Sigma-Aldrich	L3147	Stark referenziertes, nährstoffreiches mikrobielles Wachstumspulvermedium mit Agar, geeignet für reguläre  E.coli  Kultur.
LB Brühe	Sigma-Aldrich	L2542	Flüssiges mikrobielles Wachstumsmedium
Mini-Sub Cell GT Horizontales Elektrophoresesystem	Bio-Rad	1640300	Mini-Horizontales Elektrophoresesystem, bestehend aus 8- und 15-Well-Kämmen, 7 cm x 10 cm UV-transparentem Tablett
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Exprimierende eGFP-mRNA, fusioniert mit 1 Tandem-Wiederholung eines pLEXSYcon2.1-Expressionskits mit 50-Basen-Sequenz
	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Enthält den integrativen konstitutiven Expressionsvektor pLEXSY-sat2.1. Antibiotikaauswahl von Transfektantien mit Nourseothricin (NTC, clonNAT). Enthält alle Primer für diagnostische PCRs und Sequenzierungen.
Kaliumchlorid-Millipore		529552	Molekularbiologie - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	Bis zu 15 μ; g transfektionsbereites Plasmid aus 3-ml-Kulturen.
Schneider″ s Insektenmedium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium, das in unserem Labor zur Kultivierung von Leishmanien verwendet wird.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S3014	für Molekularbiologie, DNase, RNase und Protease, nicht nachgewiesen, ≥ 99% (Titration)
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagenz, geeignet für Zellkulturen, geeignet für Insektenzellkulturen, ≥ 99,0 %, rieselfähig, Redi-Dri
SwaI-Restriktionsenzym	New England BioLabs	R0604S	2.000 Einheiten. 10.000 Einheiten/ml
Spritzenfilter	Corning	CLS431212	regenerierte Zellulosemembran, Ø 4  mm, Porengröße 0,2  μ m
T100 Thermocycler	Bio-Rad	1861096	Thermocycler-System, bestehend aus 96-Well-Thermocycler, Netzkabel, Schlauchstützring
T4 DNA-Ligase	Promega	M1801	Verbindet zwei DNA-Stränge mit kohäsiven oder stumpfen Enden
Tris-Borat-EDTA-Puffer	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagenz, geeignet für Elektrophorese, 10-faches Konzentrat
Wizard Genomic DNA Aufreinigungskit	Promega	A1120
Wizard SV Gel- und PCR-Reinigungssystem	Promega	A9285
XL10-Gold Ultracompetent	Cells Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0,1 mL. Verfügt über das Kanamycin-Resistenz-Gen auf dem F'-Episom für die extrem anspruchsvolle Klonierung in Chloramphenicol-resistenten Vektoren. Wirkungsgrad: > 5 x 10 9 Transformatoren/µ g pUC18-DNA.