Method Article

"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

DOI:

10.3791/64952

⸱

March 24th, 2023

 ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay, 3Deptartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 4Chan Zuckerberg Biohub

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir einen Proteomik-Workflow zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms verschiedener Zelltypen. Dieser Arbeitsablauf umfasst die Anreicherung von Proteinen auf der Zelloberfläche, die anschließende Probenvorbereitung, die Analyse mit einer LC-MS/MS-Plattform und die Datenverarbeitung mit spezieller Software.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten zehn Jahren hat die massenspektrometrische Proteomik eine tiefgreifende Charakterisierung biologischer Systeme in einer breiten Palette von Anwendungen ermöglicht. Das Zelloberflächenproteom ("Oberflächenom") bei menschlichen Krankheiten ist von großem Interesse, da Plasmamembranproteine das primäre Ziel der meisten klinisch zugelassenen Therapeutika sowie ein Schlüsselmerkmal zur diagnostischen Unterscheidung erkrankter Zellen von gesundem Gewebe sind. Die fokussierte Charakterisierung von Membran- und Oberflächenproteinen der Zelle blieb jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Komplexität der zellulären Lysate, die die interessierenden Proteine durch andere Proteine mit hoher Abundanz maskieren. Um diese technische Barriere zu überwinden und das Zelloberflächenproteom verschiedener Zelltypen mit Hilfe der massenspektrometrischen Proteomik genau zu definieren, ist es notwendig, das Zelllysat für Zelloberflächenproteine vor der Analyse auf dem Massenspektrometer anzureichern. In diesem Artikel wird ein detaillierter Arbeitsablauf für die Markierung von Zelloberflächenproteinen aus Krebszellen, die Anreicherung dieser Proteine aus dem Zelllysat und die anschließende Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse vorgestellt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteine dienen als grundlegende Einheiten, durch die die meisten zellulären Funktionen ausgeführt werden. Die Charakterisierung der Struktur und Funktion relevanter Proteine ist ein wesentlicher Schritt, um biologische Prozesse zu verstehen. In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte in der Massenspektrometrietechnologie, der Analysesoftware und den Datenbanken den genauen Nachweis und die Messung von Proteinen auf einer proteomweiten Skala ermöglicht1. Die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik kann in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, von der grundlagenwissenschaftlichen Analyse biochemischer Signalwege über die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele in einem translationalen Umfeld bis hin zur Diagnose und Überwachung von Krankheiten in der Klinik2. Beim Screening nach neuartigen Wirkstoffzielen ist die Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms besonders wichtig, da über 65 % der derzeit zugelassenen Humanarzneimittel auf Zelloberflächenproteine abzielen3. Auch das Gebiet der Krebsimmuntherapie stützt sich vollständig auf krebsspezifische Zelloberflächenantigene, um Tumorzellen anzugreifen und spezifisch zu eliminieren4. Die massenspektrometrische Proteomik kann daher als vielversprechendes Werkzeug dienen, um neue Zelloberflächenproteine für therapeutische Eingriffe zu identifizieren.

Es gibt jedoch einige Einschränkungen bei der Verwendung herkömmlicher Proteomik-Methoden, um Tumorzellen auf neue Ziele für Zelloberflächenproteine zu untersuchen. Ein Hauptproblem ist, dass Oberflächenproteine nur einen sehr kleinen Teil der gesamten Proteinmoleküle in einer Zelle ausmachen. Daher werden Fragmente dieser Proteine bei der massenspektrometrischen Analyse des Ganzzelllysats durch eine hohe Abundanz intrazellulärer Proteine maskiert5. Diese Einschränkung macht es schwierig, das Proteom der Zelloberfläche mit einem herkömmlichen Proteomik-Workflow genau zu charakterisieren. Um diese Herausforderung zu bewältigen, ist es notwendig, Wege zu entwickeln, um Zelloberflächenproteine aus dem Ganzzelllysat anzureichern, bevor sie mit dem Massenspektrometer analysiert werden. Eine dieser Methoden beinhaltet die Oxidation und Biotinmarkierung von glykosylierten Zelloberflächenproteinen in den intakten Zellen und die anschließende Anreicherung dieser biotinylierten Proteine aus dem Lysat mit einem Neutravidin-Pulldown, ein Prozess, der als "cell surface capture" bezeichnet wurde6. Da man davon ausgeht, dass ~85% der Oberflächenproteine von Säugetierzellen glykosyliert sind7, dient dies als effektive Methode zur Anreicherung des Zelloberflächenproteoms aus dem gesamten Zelllysat. Dieser Artikel beschreibt einen vollständigen Arbeitsablauf, beginnend mit kultivierten Zellen, von der Biotinmarkierung auf der Zelloberfläche bis hin zur anschließenden Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse (Abbildung 1). Über mehrere Replikate hinweg bietet diese Methode eine robuste Abdeckung des Zelloberflächenproteoms einer bestimmten Probe. Die Verwendung dieser Methode zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms sowohl von Tumorzellen als auch von gesunden Zellen kann die Entdeckung neuartiger Zelloberflächenantigene erleichtern, um potenzielle immuntherapeutische Ziele zu identifizieren8.

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Protocol

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HINWEIS: AMO1-Plasmozytomzellen wurden für dieses Zelloberflächenproteom-Experiment verwendet. Das gleiche Protokoll kann auch für andere Zelltypen verwendet werden, einschließlich einer breiten Palette von Suspensions- und adhärenten Zelllinien9, sowie für verschiedene Arten von Primärproben10. Die Zellzahlen (Ausgangsmaterial für das Experiment) müssen jedoch in der Regel für eine gleichwertige Proteomabdeckung optimiert werden. Weitere Informationen zu Materialien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle. Einzelheiten zu Puffern und Reagenzien und deren Zusammensetzung finden Sie in Tabelle 1.

1. Markierung von Zelloberflächen mit Biotin

  1. Die kultivierten Zellen und das Pellet werden ca. 3,5 × 107 lebende Zellen durch Zentrifugation (5 min bei 500 × g, 24 °C) gezählt.
    HINWEIS: Die AMO1-Plasmozytomzellen wurden vor der Entnahme alle 3 Tage mit frischem Medium durchgelassen.
  2. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie 1 ml kalte (4 °C) Dulbecco-phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) (kein Kalzium, kein Magnesium) hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren.
  3. Pelletieren Sie die Zellen erneut (wie in Schritt 1.1) und wiederholen Sie den Waschschritt (Schritt 1.2) noch einmal (insgesamt zwei Wäschen).
  4. Nach dem zweiten Waschen pelletieren Sie die Zellen (wie in Schritt 1.1) und resuspendieren sie in 990 μl kaltem D-PBS durch vorsichtiges Pipettieren.
  5. Bereiten Sie zuvor eine Stammlösung von 160 mM Natriummetaperiodat (NaIO4) vor. In 50 μL Aliquots aufteilen und bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern. In Schritt 1.4 werden 10 μl 160 mM Natriummetaperiodatlösung in die Zellsuspension gegeben, gründlich gemischt und 20 Minuten lang bei 4 °C auf einem End-to-End-Rotor inkubiert.
  6. Nach Abschluss der Inkubation werden die Zellen pelletiert (wie in Schritt 1.1), der Überstand dekantiert und in 1 ml kaltem D-PBS resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal (insgesamt drei Wäschen). Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 989 μl D-PBS.
  7. Bereiten Sie zuvor eine Stammlösung von 100 mM Biocytinhydrazid vor. In 50 μl Aliquots aufteilen und bis zu 6 Monate bei -20 °C lagern. In Schritt 1.6 werden 1 μl Anilin und 10 μl 100 mM Biocytinhydrazid in die Zellsuspension gegeben, gründlich gemischt und auf einem End-to-End-Rotor 60 min bei 4 °C inkubiert.
  8. Nach Abschluss der Inkubation werden die Zellen pelletiert (wie in Schritt 1.1), der Überstand dekantiert und in 1 ml kaltem D-PBS resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).
  9. Nach dem dritten Waschen wird der Überstand vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt und das Küvettenpellet durch Einlegen des Röhrchens in die Flüssigkeit N2 eingefroren. Legen Sie das gefrorene Pellet bei -80 °C, bis es mit der Lyse und dem Abziehen fortfährt.

2. Zelllyse und Biotin-Pulldown

  1. Tauen Sie das gefrorene Zellpellet auf Eis auf.
  2. 500 μl 2x Lysepuffer zum Pellet geben, gründlich mischen und 30 s.
    HINWEIS: Kräftiges Pipettieren und Vortexen kann erforderlich sein, um das Pellet vollständig zu lysieren. Einige unlösliche Rückstände (z. B. DNA) sind akzeptabel, da sie im nachfolgenden Beschallungsschritt entfernt werden.
  3. Beschallung des Zelllysats auf Eis (drei Stöße à 20 s, 60 % Einschaltdauer).
  4. Zentrifugieren Sie das Lysat, um verbleibende Rückstände zu pelletieren (10 min bei 17.200 × g bei 4 °C).
  5. Während das Lysat zentrifugiert, geben Sie 100 μl Neutravidin-Agarose-Harzkügelchen in eine Filtrationssäule. Befestigen Sie die Säule an einem Vakuumverteiler, saugen Sie sie sanft ab und waschen Sie die Perlen, indem Sie 3 ml Waschpuffer 1 darüber fließen lassen.
  6. Entfernen Sie die Filtrationssäule aus dem Vakuumverteiler, verschließen Sie den Boden und geben Sie das geklärte Zelllysat in die Säule mit den Kügelchen. Verschließen Sie die Oberseite der Säule und inkubieren Sie das Lysat mit den Kügelchen auf einem End-to-End-Rotor für 120 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Wenn Sie die Oberseite der Säule verschließen, halten Sie die untere Kappe fest an Ort und Stelle, da sie sich sonst lösen kann und das Zelllysat während der Inkubation austreten kann.
  7. Bereiten Sie die Waschpuffer 1, 2 und 3 vor (ca. 5 ml jedes Waschpuffers pro Probe, siehe Tabelle 1) und legen Sie sie in ein 42 °C warmes Wasserbad
  8. Nachdem das Lysat die Inkubation beendet hat, setzen Sie die Filtrationssäule wieder auf den Vakuumverteiler, wenden Sie ein sanftes Vakuum an und waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 5 mL Waschpuffer 1 darüber fließen lassen.
    HINWEIS: Mehr als 5 ml der Waschpuffer können zum Waschen verwendet werden; Zusätzliches Waschen kann den Hintergrund und die unspezifische Bindung an die Perlen reduzieren.
  9. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 5 mL Waschpuffer 2.
  10. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 5 mL Waschpuffer 3.
  11. Sobald der letzte Waschpuffer vollständig durch die Kügelchen geflossen ist, entfernen Sie die Säule aus dem Verteiler. Geben Sie 100 μl "Lyse"-Lösung zu den Kügelchen und geben Sie sie mit einer Pipette in ein 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Drehen Sie das Röhrchen kurz, um die Kügelchen abzusetzen, und entfernen Sie 50 μl der Lösung, ohne die abgesetzten Kügelchen zu stören.
    HINWEIS: Für die Reagenzien in diesem Schritt und allen nachfolgenden Schritten wird ein im Handel erhältliches Proteomik-Probenvorbereitungskit verwendet. Das Kit bietet einen optimierten, vereinfachten Arbeitsablauf für die Probenvorbereitung. Diese Schritte können jedoch auch unabhängig vom Kit durchgeführt werden, wobei ein traditioneller Proteomik-Workflow verwendet wird, wie in Verma et al.9 beschrieben. Wenn die Kügelchen an der Seite oder am Boden der Säule kleben bleiben, lassen Sie die Kügelchen, die in das Röhrchen übertragen wurden, sich absetzen, und verwenden Sie eine zusätzliche "Lyse"-Lösung im Röhrchen, um die verbleibenden Kügelchen zu übertragen.
  12. Stellen Sie das Rohr auf einen Heizblock/Shaker bei 65 °C und schütteln Sie es bei 1.000 U/min für 10 min.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist für die Reduktion und Alkylierung von Cysteinrückständen vor dem Aufschluss erforderlich.

3. Proteinverdauung

  1. Das getrocknete Trypsin wird durch Zugabe von 210 μl der "Resuspend"-Lösung resuspendiert ("Digest"-Röhrchen im Kit, gelagert bei -20 °C). Pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass das gesamte getrocknete Trypsin resuspendiert wird.
  2. Nach Abschluss der Inkubation geben Sie 50 μl der resuspendierten Trypsinlösung zu den Kügelchen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 °C und schütteln Sie es mindestens 90 Minuten lang bei 500 U/min, um das Protein zu verdauen.
  3. Sobald der Aufschluss abgeschlossen ist, überführen Sie die Lösung mit den Kügelchen in eine Spin-Säule und setzen Sie die Säule in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung ein. Drehen Sie das Röhrchen (500 × g für 5 min bei Raumtemperatur [RT]), um die verdaute Peptidlösung von den Kügelchen zu trennen.
    HINWEIS: In diesem Stadium kann eine PNGase-Behandlung an den Kügelchen durchgeführt werden, sobald sie von der Peptidlösung getrennt sind, um biotinylierte Peptidfragmente aus den Streptavidin-Kügelchen zu eluieren. Diese Peptidprobe kann dann als separate, sekundäre Peptidprobe durch den restlichen Arbeitsablauf geführt werden, die analysiert und mit der Primärprobe aus der On-Bead-Trypsinisierung verglichen werden kann. Der PNGase-Ansatz wird wahrscheinlich komplementäre Daten zur On-Bead-Trypsinisierung liefern, da die eingefangene N-glykosylierte Asparagine aufgrund der MS-nachweisbaren Seitenkettenmodifikation zusätzlich spezifiziert sind12. Der Nachteil dieses sequentiellen Elutionsansatzes ist jedoch die doppelte Zeit des Massenspektrometers pro Probenanalyse.
  4. Fügen Sie 100 μl der "Stop"-Lösung hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen und die Peptidlösung anzusäuern.

4. Entsalzung von Peptiden

  1. Setzen Sie mit einem Röhrchenadapter eine Entsalzungssäule in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung ein. Geben Sie die gesamte angesäuerte Peptidlösung in die Säule. Die Säule (3.800 × g für 3 min) drehen, so dass die Lösung durch die Säule fließt. Die Peptide sind nun an die Säule gebunden; Verwerfen Sie den Durchfluss.
  2. 200 μl "Wash 1"-Lösung in die Säule geben und schleudern (3.800 × g für 3 min, RT). Verwerfen Sie den Durchfluss.
  3. 200 μl "Wash 2"-Lösung in die Säule geben und schleudern (3.800 × g für 3 min, RT). Verwerfen Sie den Durchfluss.
  4. Übertragen Sie die Säule in ein neues, beschriftetes 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung. Geben Sie 100 μl "Elut"-Lösung in die Säule und schleudern Sie sie (3.800 × g für 3 min, RT). Geben Sie weitere 100 μl "Elu"-Lösung in die Säule und schleudern Sie sie (3.800 × g für 3 min, RT). Die Peptide werden nun von der Säule in das Röhrchen eluiert.
  5. Geben Sie die Peptidlösung in eine Vakuumzentrifuge und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Die getrockneten Peptide werden bis zur Quantifizierung bei -80 °C bei -80 °C platziert und auf dem Massenspektrometer analysiert.

5. Peptid-Resuspension und Quantifizierung

  1. Resuspendieren Sie die eingetrockneten Peptide in 20 μl Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure, 2 % Acetonitril).
  2. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Peptide (17.200 × g für 10 min), um unlösliche Rückstände zu pelletieren.
  3. Bereiten Sie Peptidstandards für den kolorimetrischen Peptidquantifizierungsassay vor.
    1. Geben Sie 5 μl 1.000 mg/ml Peptidstammlösung in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte.
    2. Führen Sie eine siebenstufige serielle Verdünnung in der Platte mit deionisiertem (DI) Wasser wie folgt mit 5 μl jedes Standards pro Vertiefung durch: 1.000 mg/ml, 500 mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,25 mg/ml und 15,625 mg/ml. Geben Sie 5 μl DI-Wasser in eine achte Vertiefung für den Rohling.
  4. Geben Sie 4 μl DI-Wasser in drei separate Vertiefungen der 96-Well-Platte. Geben Sie 1 μl der resuspendierten Peptidlösung in jede Vertiefung, um ein Gesamtvolumen von 5 μl zu erhalten. < br /> HINWEIS: Wenn Sie die Peptidlösung zur Quantifizierung pipettieren, pipettieren Sie vorsichtig von der Oberseite der Lösung, um eine Störung abgesetzter Rückstände zu vermeiden.
  5. Berechnen Sie, wie viel funktionierendes Reagenz benötigt wird (45 μl pro Vertiefung erforderlich). Bereiten Sie das erforderliche Volumen des kolorimetrischen Assay-Arbeitsreagenzes vor; Wirbeln Sie das Arbeitsreagenz vor, um eine ordnungsgemäße Durchmischung der Komponenten zu gewährleisten.
  6. Geben Sie jeweils 45 μl des Arbeitsreagenzes in die Standard- und Probenvertiefungen.
    HINWEIS: Machen Sie die Standards in Duplikaten und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um einen minimalen Unterschied im Zeitpunkt der Zugabe des Reagenzes zu den Wells zu gewährleisten.
  7. Die Platte mit Alufolie abdecken und bei 37 °C 15 min inkubieren.
  8. Analysieren Sie die Platte mit einem automatisierten Plattenlesegerät. Verwenden Sie die für die Standardproben aufgezeichneten Absorptionswerte, um eine lineare Standardkurve zu erstellen. Bestimmen Sie die Gleichung aus der Normkurve und demR2-Wert. Wenn derR2-Wert angemessen ist (≥0,95), verwenden Sie die Standardkurve, um die Konzentration der resuspendierten Peptide zu bestimmen, wobei die fünffache Verdünnung in der kolorimetrischen Testplatte berücksichtigt wird.

6. Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analyse der verdauten Peptide

  1. Passen Sie die Konzentration der Peptidproben durch Zugabe von Lösungsmittel A auf 0,2 μg/μl an und überführen Sie 10 μl in ein 0,6 mL Röhrchen mit geringer Proteinbindung.
  2. Legen Sie das Röhrchen in den LC-Autosampler.
  3. Stellen Sie die Parameter LC und MS/MS gemäß Abbildung 2 und Abbildung 3 ein.
  4. Injizieren Sie 5 μl (1 μg) der Peptidprobe zur Analyse in das LC-MS/MS-Setup.
    HINWEIS: Die hier gezeigten LC-MS/MS-Einstellungen sind nur repräsentativ für die Abbildungen. Abhängig von der Verfügbarkeit des LC- und MS-Instruments können Benutzer die Einstellungen für den LC-Gradienten und die MS/MS-Parameter ändern, um eine tiefe Proteomabdeckung zu erhalten. Für diese Arbeit wurde die MS-Datenanalyse mit MaxQuant https://www.maxquant.org/, die Sekundärdatenanalyse mit Perseus https://maxquant.net/perseus/ und die Pathway-Analyse mit https://reactome.org/ durchgeführt.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für dieses Experiment haben wir das Zelloberflächenproteom einer Tumorzelllinie charakterisiert, indem wir N-glykosylierte Membranproteine intakter Zellen mit Biotin markiert und diese markierten Proteine aus dem gesamten Zelllysat mit einem Neutravidin-Pulldown angereichert haben (Abbildung 1). Darüber hinaus führten wir eine Proteomanalyse mittels LC-MS/MS durch, um angereicherte Zelloberflächenproteine zu charakterisieren. Anders als bei der Ganzzell-Proteomanalyse ging es hier d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die unvoreingenommene Charakterisierung von Tausenden von unbekannten Proteinen in einem bisher unmöglichen Maßstab ermöglicht hat. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Proteine zu identifizieren und zu quantifizieren sowie eine Reihe von Erkenntnissen über die Struktur- und Signalkapazitäten von Zellen und Geweben zu gewinnen, indem wir die Vielfalt der in einer bestimmten Probe vorhandenen Proteine charakterisieren. Die Massenspektr...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Kamal Mandal (Abteilung für Labormedizin, UCSF) für die Hilfe bei der Einrichtung des LC-MS/MS-Laufs, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) für die Hilfe bei der Datenanalyse und Dr. Audrey Reeves (Abteilung für Labormedizin, UCSF) für die Hilfe bei der Datenanalyse. Die entsprechende Arbeit im A.P.W.-Labor wird vom NIH R01 CA226851 und dem Chan Zuckerberg Biohub unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2B wurden unter Verwendung von BioRender.com erstellt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
96X iST ProbenvorbereitungskitPreOmicsP.O.00027Proteomics-Probenvorbereitungskit. Enthält Reagenzien für die Reduktion, Alkylierung und den Aufschluss. Fügen Sie auch Entsalzungssäulen und Reagenzien hinzu.
Pierce Quantitativer kolorimetrischer Peptid-AssayThermo23275Peptid-Quantifizierungskit. Enthält Peptidstandards und Komponenten von Arbeitsreagenzien.
Reagenzien
AcetonitrilFisherA955-1
AmmoniumbicarbonatMillipore Sigma09830-1KG
BiocytinhydrazidBiotium90060
D-PBS (ohne Calcium- und Magnesiumsalze)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL003-225B01
AmeisensäureHoneywell94318
Halt Protease- und Phosphatase-Inhibitor Einweg-CocktailThermo1861280
Neutravidin AgaroseharzThermo29204
Phosphatgepufferte KochsalzlösungUCSF-ZellkulturanlageCCFAL001-22J01
RIPA-Lysepuffer, 10xMillipore Sigma20-188
NatriumchloridFisherBP358-212
NatriummetaperiodatAlfa Aesar13798
Trypanblauer Fleck (0,4%)Gibco15250-061
Ultrarein 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-038
Harnstoff (Proteomics-Qualität)VWRM123-1KG
strong>Ausrüstung
TC20 Automatisierter ZellzählerBio-Rad1450102
PrismR MikrozentrifugeLabnet InternationalC2500-R-230V
UltraschallgerätVWRBranson Sonifier 240
VakuumverteilerPromegaPromega Vac-Man
Shaking HeatblockEppendorfEppendorf Thermomixer C
End-to-End-RotatorLabnetRevolver Verstellbarer Rotator
LCThermoUltimate 3000 HPLC und UHPLC
Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap MassenspektrometerThermoIQLAAEGAAPFALGMBDK
Mikroplatten-ReaderBiotekBiotek Synergy 2 
VakuumkonzentratorLabconco7810010
Supplies
1,5 mL Protein LoBind RöhrchenEppendorf22431081
1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen
FiltrationssäulenBio-Rad7326008
Spin SäulenThermoArtikel-Nr.: 69725
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References

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