"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

Akul Naik; Sanjeeva Srivastava; Arun P. Wiita

doi:10.3791/64952

Methodenartikel

"Cell Surface Capture"-Workflow zur markierungsfreien Quantifizierung des Zelloberflächenproteoms

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DOI:

10.3791/64952

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24. März 2023

Akul Naik¹ , Sanjeeva Srivastava¹^,² , Arun P. Wiita¹^,³^,⁴

¹Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, ²Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay, ³Deptartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, ⁴Chan Zuckerberg Biohub

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen Proteomik-Workflow zur Charakterisierung des Zelloberflächenproteoms verschiedener Zelltypen. Dieser Arbeitsablauf umfasst die Anreicherung von Proteinen auf der Zelloberfläche, die anschließende Probenvorbereitung, die Analyse mit einer LC-MS/MS-Plattform und die Datenverarbeitung mit spezieller Software.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren hat die massenspektrometrische Proteomik eine tiefgreifende Charakterisierung biologischer Systeme in einer breiten Palette von Anwendungen ermöglicht. Das Zelloberflächenproteom ("Oberflächenom") bei menschlichen Krankheiten ist von großem Interesse, da Plasmamembranproteine das primäre Ziel der meisten klinisch zugelassenen Therapeutika sowie ein Schlüsselmerkmal zur diagnostischen Unterscheidung erkrankter Zellen von gesundem Gewebe sind. Die fokussierte Charakterisierung von Membran- und Oberflächenproteinen der Zelle blieb jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Komplexität der zellulären Lysate, die die interessierenden Proteine durch andere Proteine mit hoher Abundanz maskieren. Um diese technische Barriere zu überwinden und das Zelloberflächenproteom verschiedener Zelltypen mit Hilfe der massenspektrometrischen Proteomik genau zu definieren, ist es notwendig, das Zelllysat für Zelloberflächenproteine vor der Analyse auf dem Massenspektrometer anzureichern. In diesem Artikel wird ein detaillierter Arbeitsablauf für die Markierung von Zelloberflächenproteinen aus Krebszellen, die Anreicherung dieser Proteine aus dem Zelllysat und die anschließende Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Analyse vorgestellt.

Einleitung

Proteine dienen als grundlegende Einheiten, durch die die meisten zellulären Funktionen ausgeführt werden. Die Charakterisierung der Struktur und Funktion relevanter Proteine ist ein wesentlicher Schritt, um biologische Prozesse zu verstehen. In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte in der Massenspektrometrietechnologie, der Analysesoftware und den Datenbanken den genauen Nachweis und die Messung von Proteinen auf einer proteomweiten Skala ermöglicht¹. Die auf Massenspektrometrie basierende Proteomik kann in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, von der grundlagenwissenschaftlichen Analyse biochemischer Signalwege über die Iden....