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Gekennzeichnet durch eine Zunahme der Fettgewebemasse (AT) und einen entzündungsfördernden Umbau von AT-Immunzellen, ist Fettleibigkeit zu einem wichtigen weltweiten Problem der öffentlichen Gesundheit geworden, da sie das Risiko, an Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes und Lebererkrankungen zu erkranken, drastisch erhöht. Daher ist die Erforschung der Struktur und Funktion von AT zu einer wichtigen klinischen Herausforderung geworden. In dieser Methodensammlung stellen wir einige hochmoderne Methoden vor, die entwickelt wurden, um die Struktur und Funktion von AT unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.
AT ist ein heterogenes Gewebe, das aus mehreren Zellpopulationen besteht, darunter reife Adipozyten, Fettvorläuferzellen (APCs), fibroinflammatorische Vorläuferzellen (FIPs), Endothelzellen und Immunzellen. Um dieses Gewebe zu charakterisieren, kann daher eine Einzelzell-Phänotypisierung durchgeführt werden. In ihren Artikeln stellen Cho et al. und Peics et al. Protokolle zur Isolierung und Charakterisierung von weißen AT-residenten APCs von Mäusen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) vor1,2. Dieser Schritt ist nicht nur für die Zählung der Anzahl der residenten APCs entscheidend, was ein wichtiger Faktor für die Bestimmung der Kapazität der AT-Expansion ist, sondern auch für die weitere Erforschung der Funktion dieser Zellen auf Einzelzellebene. Peics et al. bieten auch eine Methode zur Isolierung von weißen AT-residenten FIPs2 der Maus an, nicht-adipogene Kollagen-produzierende Zellen, die zur Entwicklung eines entzündungsfördernden Phänotyps beitragen können, von dem bekannt ist, dass er eine Rolle bei der AT-Dysfunktion spielt. In ähnlicher Weise beschreiben Estrada-Gutierrez et al. ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung lebensfähiger reifer Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktionszellen aus humanen viszeralen AT-Biopsien3. Insgesamt sind diese Protokolle der Goldstandard für die Erzeugung einer Einzelzellsuspension aus menschlichem und Maus-AT, was der erste entscheidende Schritt zur weiteren Zählung und funktionellen Phänotypisierung der verschiedenen AT-Zell-Subpopulationen ist.
Die Beziehung zwischen Struktur und Funktion ist in AT von hoher Relevanz. Ein Kennzeichen der AT-Dysfunktion bei Adipositas hängt mit der Zunahme der Adipozytengröße und einem tiefgreifenden Umbau der AT zusammen. Dieser Umbau wirkt sich nicht nur auf die Adipozyten- und Immunzellpopulationen aus, sondern auch auf das Lymph- und das Blutgefäßnetzwerk. Um diese Veränderungen im gesamten AT zu würdigen, entwickeln Gilleron et al. ein sehr einfaches, kostengünstiges und schnelles AT-Clearing-Protokoll4. Dieses unkomplizierte Protokoll visualisiert dreidimensional die Morphologie von AT-Biopsien der gesamten Maus und großen humanen AT-Biopsien. Dazu gehören die neuronalen und vaskulären Netzwerke, die Adipozyten sowie die Verteilung der angeborenen und adaptiven Immunzellen, die allesamt wichtige Parameter für die Untersuchung von Adipositas und den damit verbundenen Pathologien sind. Um den Einfluss von Adipositas auf AT-Lymph- und Blutgefäße zu charakterisieren, stellen Czepielewski et al. eine in vivo-Methode zur gleichzeitigen Färbung der lymphatischen Arborisation und der Blutgefäße durch Injektion von Fluorochrom-konjugierten Lektinenbereit 5. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, die In-vivo-Morphologie beider Netzwerke zu analysieren, einschließlich ihrer Dichte, ihres Volumens und ihrer Verzweigung. Interessanterweise ermöglicht die Kombination dieser Beschriftungsstrategie mit einem AT-Clearing-Verfahren4 eine hochauflösende Abbildung des gesamten AT-Verfahrens der Maus in drei Dimensionen (3D)5. Insgesamt können diese Ansätze die Struktur von AT unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen charakterisieren und Einblicke in die Korrelation zwischen AT-Struktur und -Funktion gewinnen.
Aufgrund der hohen Heterogenität und der enormen Umbaukapazität ist es nicht einfach, die Funktion von Adipozyten in AT in vivo zu analysieren, weshalb mehrere Kultursysteme entwickelt wurden. Der Hauptvorteil all dieser Zellkultursysteme ist das hohe Maß an Kontrolle über die Zellpopulation und die Mikroumgebung. Jäger et al. entwickeln ein einfaches Protokoll zur Manipulation der RNA-Expression in 3T3-L1-differenzierten reifen Adipozyten6. Obwohl dieses Kultursystem weit von den idealen physiologischen Bedingungen entfernt ist, bleiben 3T3-L1-Adipozyten in Bezug auf die Insulinsignalisierung, die Glukoseaufnahme, die Lipogenese und die Lipolyse funktionsfähig. Daher bietet dieses Protokoll ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Expression von Proteinen und nicht-kodierender RNA zu manipulieren und ihre Rolle auf die Funktionen der Adipozyten zu untersuchen. Um idealen physiologischen Bedingungen näher zu kommen, beschreiben Poret et al. eine Methode zur Erzeugung funktionsfähiger reifer Adipozyten unter Verwendung von aus Fettaken gewonnenen Stammzellen (ADSCs), die aus Rhesusaffen AT7 gewonnen wurden. In diesem Protokoll wird erläutert, wie primäre ADSCs isoliert und deren Proliferation und Differenzierung induziert werden. Die Autoren schlagen ferner vor, dass dieses Verfahren an andere Arten angepasst werden kann. Obwohl dieses Kultursystem im Vergleich zur 3T3-L1-Zelllinie näher an idealen physiologischen Bedingungen liegt, werden die reifen Adipozyten, die aus primären ADSCs gewonnen werden, in 2D gezüchtet, was sich von in vivo unterscheidet. Um dieses Problem zu lösen, stellen Batista Jr. et al. ein effizientes Protokoll für ein dreidimensionales Druckgewebekultursystemzur Verfügung 8. In dieser Arbeit erzeugen die Autoren Adipospheroide aus stromalen Gefäßfraktionszellen der Maus und differenzieren Adipozytenvorläufer direkt innerhalb dieses 3D-Kultursystems. Dieser Ansatz ist unwiderruflich näher an idealen physiologischen Bedingungen als die 2D-Kulturmethode, aber der Mangel an Gefäßen, die den Adipozyten im Zentrum der Sphäroide Nährstoffe zuführen könnten, sollte berücksichtigt werden. Die Modulation der Protein- und nicht-kodierenden RNA-Expression, wie sie6 beschrieben wurde, innerhalb dieser Kultursysteme könnte zu weiteren Erkenntnissen über die funktionelle Rolle dieser Ziele in physiologisch relevanteren Adipozyten führen. Ein solch komplexes System muss jedoch erst noch etabliert werden. Das Hauptinteresse dieser ex vivo/in vitro Kultursysteme ist die hohe Kontrolle über die Mikroumgebung, die auch die von den Zellen sezernierten Faktoren umfasst. In dieser Hinsicht isoliert und charakterisiert das Protokoll von Akbar et al. die extrazellulären Vesikel (EVs), die von menschlichen Adipozyten sezerniertwerden 9. Kürzlich wurde festgestellt, dass Elektrofahrzeuge wichtige Stoffwechselregulatoren sind. Diese Methode ist zwingend erforderlich, um die metabolischen Auswirkungen dieser von Adipozyten abgeleiteten EVs unter verschiedenen metabolischen Situationen zu analysieren.
In der vorliegenden Methodensammlung geben wir einen Überblick über den Stand der Technik, Protokolle, die verschiedene Aspekte der AT-Analytik abdecken, darunter ex vivo und in vitro Kultursysteme, 3D-Ganzgewebeexploration und Einzelzellanalyse. Obwohl kein Kultursystem perfekt ist, ist es wichtig, das Kultursystem zu wählen, das an die biologische Fragestellung angepasst ist. Daher bietet diese Methodensammlung einen großen Werkzeugkasten an Verfahren zur Isolierung, Differenzierung und Manipulation von Adipozyten in vitro. Die Kombination all der verschiedenen Methoden, die hier beschrieben werden, führt zu Einblicken in die Morphologie und die Funktion von AT.