Nicht zutreffend
Methodenartikel
14. Juli 2023
Nicht zutreffend
Die Skelettmuskulatur bedeckt ~40% des menschlichen Körpers und ist ein wichtiges Organ, das wichtige Funktionen von der Bewegung über die Atmung bis hin zum Stoffwechsel unterstützt. Wichtig ist, dass es eine einzigartige Fähigkeit hat, sich nach Verletzungen selbst zu reparieren und mit dieser Regenerationsfähigkeit eine vollständige funktionelle und strukturelle Wiederherstellung von schweren Schäden in weniger als einem Monat gewährleistet. Mehrere Zelltypen wurden mit dieser bemerkenswerten Reparaturfähigkeit in Verbindung gebracht, wobei die Muskelstammzellen eine zentrale Rolle spielen.
Muskelforscher auf der ganzen Welt haben mehrere Assays entwickelt, um die Skelettmuskulatur auf funktioneller, molekularer und zellulärer Ebene zu analysieren. Jede Technik hat ihre eigenen Stärken, wobei In-vivo-Tests an Tiermodellen die Option mit der größten Relevanz für den Menschen und die Komplexität lebender Organismen darstellen. Die In-vitro- und Ex-vivo-Pendants gewinnen an Boden, da Forschungsgruppen weltweit bestrebt sind, Tierversuche im Hinblick auf das international anerkannte Replacement-Reduction-Refinement (3R)-Prinzip zu minimieren. Ziel dieser Methodensammlung war es, in vivo und ex vivo Modelle für molekulare, zelluläre und funktionelle Muskelstudien über Spezies hinweg bereitzustellen.
Montandon et al.1 beschreiben Techniken zur schnellen Charakterisierung von Muskelregenerationsphänotypen bei Zebrafischen von Kontroll- und Mutantengenotypen. Zunächst werden Embryonen mit Material genotypisiert, das von anästhesierten Tieren abgeschüttelt wird. Dies ist eine aufregende Aussicht, da die meisten Protokolle, die die Genotypisierung von genetisch veränderten Embryonen beinhalten, eine gleichzeitige Tötung des Embryos erfordern. Anschließend wird die Regeneration durch das Stechen in eine bestimmte Region der Muskulatur der Zebrafischlarvenlarve induziert. Dank der optischen Eigenschaften des Sarkomers kann die Integrität des verletzten Muskels mit Hilfe der Bildgebung nach der Verletzung beurteilt werden. Dieses Protokoll ist für Wissenschaftler, die sich mit der Muskelregeneration befassen, von großem Interesse, da es sich um eine schnelle, potenziell hochdurchsatzfähige Methode handelt, um verschiedene Mutanten auf regenerative Defekte zu untersuchen.
Hüttner et al.2 und Pegoli et al.3 stellen eine Methode vor, die zelluläre und molekulare Untersuchungen von Muskelstammzellen, der Zellpopulation, die den Kern der Muskelregeneration bildet, ermöglicht. Die Methode ist sehr interessant für Forscher, die sich auf frühe Aktivierungsstudien und Zell-Nischen-Interaktionen konzentrieren. Die Methode der Einzelmyofaserkulturen ermöglicht die Kultivierung und Untersuchung von Muskelstammzellen bis zu 96 Stunden, während sie noch mit den Muskelfasern assoziiert sind und Signale aus dieser naheliegenden, endogenen Nische erhalten. Die Technik ist aufgrund der vielen heiklen Schritte, die Hüttner et al.2 sorgfältig erklären (z.B. sanfte Muskeldissektion und Dissoziation), besonders schwierig zu etablieren. Die Autoren gehen noch einen Schritt weiter und beschreiben das siRNA-Targeting für funktionelle Analysen von Faktoren, die das Verhalten von Stammzellen beeinflussen können, und sie unterstreichen, wie wichtig es ist, siRNA-transfizierte mit kontrolltransfizierten Zellen aus derselben Maus und demselben Muskel zu vergleichen. Parallel dazu beschreiben Pegoli et al.3 , wie diese Methode angepasst werden kann, um Muskelstammzellen im Zusammenhang mit der Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie und dem frühen postnatalen Leben zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf den Herausforderungen liegt, die mit der Muskelfragilität in diesem Zusammenhang verbunden sind. Um die Effizienz des Protokolls zu erhöhen, leiten sie die Leser mit Bildern von Fasern mit gutem und schlechtem Überleben an und unterstreichen die Notwendigkeit, die Verdauungszeit "empirisch zu validieren".
Zaidan et al.4 beschreiben ein ex vivo Kultursystem des Skelettmuskels, das die Produktion von ruhenden Reservezellen begünstigt, während gleichzeitig eine Reihe anderer Zelltypen erhalten bleiben, die beide unter alternativen Kultursystemen eine Herausforderung darstellen. Daher kann diese Methode für Forscher nützlich sein, die sich an Ruhestudien oder Nischen-Stammzell-Interaktionen orientieren, auch unter Bedingungen, die molekulare Signalwege mit Medikamenten, siRNAs oder Vektoren modifizieren. Das Protokoll beinhaltet eine schnelle Dissektion der Muskeln der Hintergliedmaßen, gefolgt von einer enzymatischen Verdauung und Filtration. Danach werden die Zellen in Kultur gegeben, wobei innerhalb einer Woche Reservezellen auftreten. Das Protokoll ermöglicht die großflächige Amplifikation dieser Reservezellen mit der Möglichkeit der Bildgebung lebender Zellen mit genetisch markierten Mäusen, wie z. B. Pax7nGFP.
Park et al.5 zeigen, wie Nitrat und Nitrit im Skelettmuskel, einem der wichtigsten Nitratspeicherorgane, gemessen werden können. Die beschriebene Methode ist insbesondere für Forscher interessant, die sich mit der Belastungsphysiologie und neurologischen oder metabolischen Störungen im Zusammenhang mit dem Salpeteroxidzyklus befassen. Obwohl es eine bedeutende technologische Entwicklung gibt, um Nitrat- und Nitritmessungen zu erleichtern, gibt es mehrere Parameter, die das Endergebnis beeinflussen können und von den Autoren sorgfältig beschrieben und verglichen werden (z. B. Homogenisierungsmethode, Biopsiegröße, Muskeltyp).
Hessel et al.6 beschreiben sehr detailliert ein Verfahren zur Entnahme von Biopsien aus dem Musculus tibialis anterior von menschlichen Patienten, um Fasern von ausreichender Länge für mechanische Experimente zu erhalten. Die Autoren betonen, dass Patienten mit kürzlicher Schädigung des Muskels ausgeschlossen werden sollten. Sobald die Einverständniserklärung der in Frage kommenden Patienten eingeholt wurde, wird Ultraschall verwendet, um die beste Stelle im Muskel für die Biopsieentnahme zu beurteilen. Nach der Besprechung des idealen Injektionswegs führt das Team die Biopsie mit einer speziellen Nadel durch. Abschließend werden die postoperative Patientenversorgung und die Methoden der Gewebeaufbereitung detailliert beschrieben. Diese Methode ist besonders für Mediziner-Wissenschaftler interessant, die die Gewebeentnahme von Patienten für mechanische Untersuchungen von Muskelfasern standardisieren wollen.
In dieser Methodensammlung werden mechanische Studien von Brightwell et al.7 und Corona et al.8 vorgestellt. In diesen Artikeln werden Methoden zur Messung der Kraft in kleinen und großen Tiermodellen diskutiert. Neuromuskuläre Erkrankungen oder Verletzungen wirken sich negativ auf die Muskelkraft aus. Daher zielen Bewegung, Ernährung und therapeutische Interventionen darauf ab, sie wiederherzustellen. Brightwell et al.7 beschreiben eine Methode zur Bewertung der Quadrizepsmuskelfunktion bei Mäusen in analoger Weise zu Methoden, die bei menschlichen Patienten verwendet werden. Zunächst enthalten sie Schritte zur Vorbereitung der für das Experiment erforderlichen Geräte und Software. Als nächstes wird die Maus betäubt und in Position gebracht, damit die Extensorfunktion ausgewertet werden kann. Elektroden werden zur Induktion der Kontraktion im distalen Teil des Quadrizeps platziert, ein optimaler Strom wird bewertet und Messungen des isometrischen tetanischen Spitzendrehmoments werden aufgezeichnet und analysiert. Unter Verwendung eines größeren Tiermodells beurteilen Corona et al.8 das isometrische Drehmoment im Dorsalflexormuskel der Hintergliedmaßen des Schweins und zeigen die Schritt-für-Schritt-Geräteeinstellungen und das Protokoll zur Kraftmessung. Bemerkenswert ist, dass sie Wellenfronten von hoher und niedriger Qualität aufweisen, um eine optimale Ergebniserfassung zu gewährleisten. Sie erkennen die Stärken dieser nicht-invasiven Technik, die Längsschnittanalysen desselben Tieres ermöglicht, diskutieren aber auch ausführlich die kritischen Schritte (z. B. Nervenstimulation, mechanische Ausrichtung) und Methodengrenzen.
Auf dem Gebiet der Skelettmuskelforschung gibt es noch viele offene Fragen: Welche Gene sind entscheidend für die Muskelregeneration, wie erhalten Satellitenzellen das Regenerationspotenzial über die Lebenszeit so vieler verschiedener Organismen aufrecht und wie wird die Muskelfunktion bei verschiedenen Krankheitszuständen beeinflusst? Diese Sammlung zeigt eine Reihe moderner Techniken zur Untersuchung der Muskelfunktion und -reparatur auf molekularer und mechanischer Ebene unter Verwendung einer Vielzahl von Modellsystemen. Durch die Bereitstellung detaillierter Protokolle haben die Autoren dieser Arbeiten bereits dazu beigetragen, die Konsistenz und Transparenz für die Grundlagen- und angewandte Skelettmuskelforschung zu erhöhen.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
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