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Alle mehrzelligen Organismen auf der Erde, einschließlich Tiere und Pflanzen, entwickelten sich vor ~1,7 Milliarden Jahren aus einzelligen Eukaryoten1. Im Unterschied zu primitiven Prokaryoten haben eukaryotische Zellen einen membrangebundenen Kern und viele membranumschlossene Organellen in ihrem Zytoplasma, einschließlich Mitochondrien, des Golgi-Apparats, des endoplasmatischen Retikulums (ER), Lysosomen und Vesikel. Diese Organellen bilden Kompartimente, in denen spezialisierte biologische Funktionen und hocheffiziente Stoffwechselaktivitäten lokalisiert sind. Aufgrund der begrenzten Auflösung der Lichtmikroskopie enthalten die meisten intrazellulären Organellen funktionelle Strukturen, die unter die Lichtbeugungsgrenze fallen, was ihre Visualisierung schwierig macht2. Innovative mikroskopische und biologische Markierungstechniken ermöglichen die hochauflösende Visualisierung ultrafeiner Architekturen und der in vivo Dynamik von Organellen. Diese Sammlung vereint neuere Methoden, die es geschafft haben, verschiedene intrazelluläre Organellen über verschiedene Spezies hinweg zu markieren und abzubilden und so unser Verständnis der raumzeitlichen Regulation der Organellenbiologie zu erweitern.
In den letzten Jahrzehnten haben die Entwicklung von Fluoreszenzsensoren und die Markierung von Proteinen in lebenden Zellen unser Verständnis der Dynamik intrazellulärer Netzwerke, der Signaltransduktion und der Zell-Zell-Interaktionen erheblich erleichtert. Durch den Einsatz fortschrittlicher anorganischer Synthesemethoden wurden fluoreszierende Halbleiter-Nanokristalle mit nanoskaliger Größe, auch Quantenpunkte oder QD genannt, als neue Klasse optischer Reporter erfunden. Normalerweise sind QD-Partikel innerhalb von 2–10 nm groß und weisen eine hohe Lichtempfindlichkeit, Stabilität und geringe Zytotoxizität für Zellen auf. QD-Partikel haben sich als Alternativen zu organischen Farbstoffen und fluoreszierenden Proteinen herausgestellt, um intrazelluläre Prozesse mit hoher Auflösung abzubilden. Im Protokoll von Aishwarya et al. beschreiben die Autoren die QD-vermittelte Immunmarkierung mit anschließender Bildgebung mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)3. Durch die Durchführung von Antikörper-gezielter QD-Markierung und Bildgebung unter TEM in Superauflösung gelang es den Autoren, die Sigmar1-Lokalisierung auf mehreren Zellorganellen in adulten Mausherzzellen sichtbar zu machen und seine Anreicherung auf den Lysosomen und den mitochondrialen Membranen hervorzuheben. Neben der hohen Auflösung und hohen Empfindlichkeit von QD-TEM erwähnen die Autoren auch einige Nachteile der Methoden. Zum Beispiel zerstört das Osmiumtetroxid, das bei der QD-vermittelten Immunmarkierung verwendet wird, die Eigenschaften der Probe irreversibel, und die Optimierung der Fixierungs- und Antigen-Demaskierungsschritte ist ein wichtiges, aber herausforderndes Element, um qualitativ hochwertige Bilder zu gewährleisten.
Neben QD wurden viele andere Farbstoffe erfolgreich zur Markierung von Organellen in lebenden Zellen eingesetzt. Diese Methoden haben die Live-Bildgebung des Transformations- oder Translokationsprozesses von Zellorganellen in vivo ermöglicht. Manchmal werden mehrere organellenspezifische Farbstoffe verwendet, um verschiedene Arten von Organellen gleichzeitig sichtbar zu machen. In dem Protokoll von Liu, Li et al.4 stellen die Autoren ein detailliertes Protokoll für die Lebendfärbung und Bildgebung von Mitochondrien und Lysosomen in embryonalen Fibroblastenzellen (MEF) der Maus unter Verwendung von zwei verschiedenen Farbstoffen zur Verfügung: MitoTracker Green und LysoTracker Red4. In dieser Studie zeigten beide Farbstoffe eine hohe Fluoreszenzempfindlichkeit und Stabilität, die spezifisch für Mitochondrien bzw. Lysosomen ist. Darüber hinaus beobachteten und dokumentierten die Autoren erfolgreich den kritischen in vivo zellulären Prozess der Mitophagie, der durch Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)-phenylhydrazon (FCCP) in MEF-Zellen unter Verwendung des Protokolls induziert wurde. In der Diskussion erwähnen die Autoren, dass das Protokoll mit verschiedenen Zelllinien oder Zellen aus Geweben angewendet werden kann, indem die Farbstoffkonzentration und die Färbezeit optimiert werden.
Durch die Verwendung von Reporterkonstrukten, die aus organellenspezifischen Proteinen bestehen, die mit fluoreszierenden Tags fusioniert sind, kann man in vivo die Dynamik und Expressionsmuster von Organellen ohne Immunmarkierung beobachten. In dem Protokoll von Liu, Zhu et al.5 stellen die Autoren ein detailliertes Protokoll für die Abbildung der meisten Arten von subzellulären Organellen in der lebenden knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae5 zur Verfügung. Für Anfänger, die mit knospenden Hefen arbeiten, ist dieses Protokoll hilfreich, um zu lernen, wie man die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen identifiziert und Organellen von Interesse mithilfe von Zeitraffer-Bildgebung verfolgt. Eine Einschränkung des Protokolls besteht darin, dass die meisten der im Protokoll verwendeten Konstrukte nicht zur Markierung von Organellen in anderen Spezies verwendet werden können. Für verschiedene Arten von eukaryotischen Zellen müssten die organellenspezifischen Muster fluoreszierender Proteine noch durch Antikörper-Immunfärbung validiert werden.
Zunächst wurde ein Antikörper-Aufnahmeassay für die spezifische Lebendmarkierung des endosomalen Notch/Delta-Signalwegs in den Sinnesorgan-Vorläufern von Drosophila notum6 entwickelt. Aufgrund der dosissensitiven Natur des Notch/Delta-Signalwegs ist die Expression eines Reporterkonstrukts in Zellen nicht geeignet, um den Notch/Delta-Signalweg in vivo sichtbar zu machen, da eine zusätzliche Kopie des Reporter-fusionierten Gens die normale Signalübertragung und damit das Schicksal der Zellen unterbrechen würde. In dem Protokoll von Zhao und Guo7 wenden die Autoren den Antikörperaufnahme-Assay zur Abbildung des endosomalen Notch/Delta-Transports in den radialen Glia-Vorläuferzellen des sich entwickelnden Zebrafischgehirnsan 7. Im Protokoll wird nach der Mikroinjektion eines anti-DeltaD-Atto647N-konjugierten Antikörpers präzise in den embryonalen Hinterhirnventrikel 24 hpf (Stunden nach der Befruchtung) der gesamte Prozess des endosomalen Transports unter Verwendung des internalisierten Anti-DeltaD-Atto647N-Antikörpers während der Mitose der radialen Gliavorläuferzellen aufgezeichnet. In der Studie wurde festgestellt, dass der Antikörperaufnahme-Assay die Notch/Delta-Signalgebung nicht beeinträchtigte. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um andere Membranliganden-Rezeptor-Signale sichtbar zu machen, vorausgesetzt, ein Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne des interessierenden Proteins steht zur Verfügung.
Jüngste Entwicklungen in der Expansionsmikroskopie (ExM), bei denen die Probe innerhalb eines quellfähigen Hydrogels physikalisch expandiert wird, haben es ermöglicht, konventionelle konfokale Mikroskope für die hochauflösende Bildgebung zu verwenden. Seit seiner Erfindung wurde ExM mit vielen verschiedenen Arten von biologischen Proben getestet8. Eine der größten Herausforderungen von ExM ist der Verlust des Fluoreszenzsignals während der Polymerisations- und Aufschlussschritte. Das neu entwickelte ExM mit Etikettenretention hat das Problem mit den trifunktionalen Ankern9 gelöst. In dem Protokoll von Park et al.10 beschreiben die Autoren, wie man mit einem Satz trifunktionaler Anker10 eine Label-Retention-ExM (LR-ExM) durchführt. Das Protokoll verbessert die Bildgebung der Expansionsmikroskopie, indem es nicht nur Signalverluste verhindert, sondern auch eine hocheffiziente Markierung mit SNAP- oder CLIP-Tags fördert. In ihrer Studie konnten die Autoren erfolgreich mehrfarbige LR-ExM für eine Vielzahl von subzellulären Strukturen nachweisen und erreichten eine einzelmolekulare Auflösung, wenn LR-ExM mit superauflösender stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) kombiniert wurde.
Mit der schnellen Entwicklung der hochauflösenden Mikroskopie und dem Aufkommen neuartiger Fluoreszenzmarkierungstechniken können wir weitere Verbesserungen bei den Methoden und Protokollen zur Visualisierung intrazellulärer Organellen mit einer noch nie dagewesenen Auflösung erwarten. Diese Bemühungen sind bereit, neue Durchbrüche im Verständnis der Dynamik und Funktionen intrazellulärer Organellen zu bringen.