Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, zu beschreiben, wie die Korrelation zwischen Membranmobilität und Ionenkanalpermeabilität von Membranproteinen in polymergestützten Droplet-Interface Bilayer (DIB)-Membranen untersucht werden kann ^1,2,3.

Die vorliegende Technik ergänzt eine beeindruckende Reihe fortschrittlicher optischer und oberflächenanalytischer Werkzeuge, wie z. B. die Einzelpartikelverfolgung ^4,5, die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie^6,7 und die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie 8,9,10. Diese liefern wertvolle Einblicke in die dynamische Zusammensetzung und Struktur von Membranen, die membranbasierte Reaktionen beeinflussen^11,12,13. Während die Bewegung und laterale Diffusion von Proteinen von der lokalen Dichte der Proteine in der Membran abhängt, können einzelne Proteinmoleküle auch in Lipid Rafts¹⁴ und durch Protein-Protein-Wechselwirkungen^15,16 gefangen werden. Abhängig von den Proteindomänen, die aus der Membran in die extrazelluläre Umgebung oder das Zytosol ragen, kann die Proteinmobilität von hochmobil bis völlig unbeweglich variieren. Aufgrund der Komplexität der Membran und ihrer peripheren Strukturen ist es jedoch oft schwierig, das Zusammenspiel zwischen der Natur der lateralen Beweglichkeit und der Proteinfunktion zu entschlüsseln¹⁷.

DIB-Membranen haben sich als effiziente Plattform für biophysikalische Einzelmolekülanalysen von Membranproteinen erwiesen 18,19,20,21,22. Sie entstehen durch Selbstorganisation von Lipiden durch den Kontakt von wässrigen Tröpfchen mit hydrogelgestützten Substraten in einer Lipid/Öl-Phase. Ähnlich wie die üblicherweise verwendeten geträgerten Lipiddoppelschichten (SLBs)1,23,24,25 ermöglichen DIBs eine lokale Abstimmung der lateralen Beweglichkeit durch temporäre oder permanente Bindung von Proteinen an die Polymermatrix^, wenn sie mit geeigneten Liganden funktionalisiert^{werden 17}. Letzteres kann als Modellsystem für biochemische Prozesse in Zellmembranen mit heterogener Proteinverteilung dienen¹⁰.

Der hier beschriebene experimentelle Ansatz beruht auf der Fluoreszenz von Ca 2+-sensitiven Farbstoffen, um den Ca 2+-Ionenfluss durch einzelne Kanäle in unmittelbarer Nähe der Membran ^2,22 mittels TIRF-Mikroskopie zu messen. Dieser optische Ansatz begrenzt die Beleuchtung der Probe auf einen Abstand nahe der Membran, was aufgrund der physikalischen Eigenschaften des evaneszenten Anregungslichts zu einer deutlichen Reduzierung des Fluoreszenzhintergrunds führt. Letzteres ist eine Voraussetzung, wenn eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung für die Detektion einzelner Moleküle erforderlich ist. Im Gegensatz zu klassischen elektrophysiologischen Methoden^26,27 sind keine Membranspannungen erforderlich^, um den Ionenfluss durch einzelne Kanäle zu untersuchen. Darüber hinaus erfordert die Methode keine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Molekülen, die die laterale Bewegung der Kanäle in der Membran stören könnten.

Die Methode eignet sich besonders für die Untersuchung von Proteinkanälen, die in die Membran eingebettet sind, auf Einzelmolekülebene, ohne die klassische Elektrophysiologie zu verwenden. Mit Hilfe des mitochondrialen proteinleitenden Kanals TOM-CC von Neurospora crassa^28,29,30 und OmpF, der die Diffusion kleiner hydrophiler Moleküle durch die äußere Membran von Escherichia coli^17,31 unterstützt, zeigen wir^, wie die Membranmobilitäten und Kanalaktivitäten der beiden Proteine untersucht und korreliert werden können. Wir vermuten, dass dieser Ansatz, obwohl er für TOM-CC und OmpF optimiert ist, leicht auf andere Proteinkanäle angewendet werden kann.

1. Proteinproduktion

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird das Verfahren zur Isolierung von OmpF aus Escherichia coli BE BL21(DE3) omp6^31,32, dem LamB und OmpC fehlen, und dem TOM-Kernkomplex aus Neurospora crassa beschrieben (Abbildung 1)^28,29. Letzteres erfordert Mitochondrien, die aus einem N. crassa-Stamm 28 isoliert wurden, der eine 6xHis-markierte Form der TOM-Untereinheit Tom22 enthält (Abbildung 1A), die wie beschrieben²⁸ isoliert werden kann. Die folgenden Protokolle ergeben in der Regel 1-2 mg N. crassa TOM-CC und 10 mg E. coli OmpF. Wenn die Menge angepasst werden soll, ist es wichtig, dass das Protein-Waschmittel-Verhältnis genau eingehalten wird. Sofern nicht anders angegeben, sollten alle Schritte bei 4 °C durchgeführt werden.

1. Isolierung des TOM-Kernkomplexes
   1. Solubilisieren Sie gereinigte N. crassa-Mitochondrien (2 g Protein), die durch differentielle Sedimentation aus ca. 1,5 kg (Nassgewicht) Hyphen gemäß Bausewein et al.30 erhalten wurden, bei einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml in 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 % (w/v) DDM, 20 % (v/v) Glycerin, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) für ³⁰ min bei 4 °C.
      VORSICHT: PMSF ist giftig. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
   2. Die solubilisierten Mitochondrien werden in Ultrazentrifugenröhrchen überführt und die nicht solubilisierten Membranen von den solubilisierten Membranproteinen durch Ultrazentrifugation bei 130.000 x g für 40 min bei 4 °C und Filtration mit Standardfilterpapier getrennt.
   3. Eine vorgepackte Ni-NTA-Säule (Volumen von 5 ml) mit etwa 5 Säulenvolumina (CV) des Puffers A1 (Tabelle 1) wird unter Verwendung eines automatisierten Proteinreinigungssystems ausgeglichen. Lassen Sie die Ni-NTA-Säule während aller Schritte mit einer konstanten Flussrate von 1 ml/min laufen. Verwenden Sie eine Säule mit geringerem Volumen (1 ml), wenn die Proteine aus weniger als 2 g Mitochondrien isoliert wurden.
   4. Laden Sie die solubilisierte Proteinprobe mit einer Flussrate von 1 ml/min auf die Ni-NTA-Säule.
   5. Waschen Sie die Ni-NTA-Säule mit 5 CV Puffer A1 (Tabelle 1), um ungebundene Proteine zu entfernen.
   6. Elutet His-markiertes TOM-CC mit 30% Puffer A2 (Tabelle 1; 300 mM Imidazol) und sammelt den Proteinpeak, wie er im 280-nm-Chromatogramm erscheint (Abbildung 1B).
   7. Für die weitere Aufreinigung von TOM-CC wird die vorgepackte Anionenaustauschsäule (1 ml) mit je 5 CV Puffer B1, B2 und B1 (Tabelle 1) unter Verwendung des automatisierten Proteinreinigungssystems ausgeglichen. Lassen Sie die Anionenaustauschsäule in allen Schritten mit einer konstanten Flussrate von 1 ml/min laufen.
   8. Laden Sie die TOM-CC-Peakfraktion (Schritt 1.1.6) auf die Anionenaustauschsäule (Flussrate von 1 ml/min).
   9. Die ungebundenen Proteine werden entfernt, indem die Säule mit 5 CV Puffer B1 (Tabelle 1) und einem linearen Salzgradienten von 0%-20% Puffer B2 (Tabelle 1) gewaschen wird.
   10. Elutet TOM-CC mit einem linearen Salzgradienten von 20%-35% Puffer B2 und sammelt den Proteinpeakanteil, wie er im 280-nm-Chromatogramm erscheint (Abbildung 1C).
   11. Beurteilen Sie die Reinheit der Probe mit SDS-PAGE (Abbildung 1D) und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem handelsüblichen Proteinassay gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle).
   12. Frieren Sie die Proteinproben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.
       ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff sollte in gut belüfteten Räumen gehandhabt werden. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
        
2. Isolation von OmpF
   1. Der E. coli-Stamm BE BL21(DE3) omp6 ohne LamB und^{OmpC 32} wird aus einem gefrorenen Glycerinvorrat unter sterilen Bedingungen gewonnen und auf eine Luria-Bertani (LB)-Agarplatte gestreift (Tabelle 2). Verteilen Sie dazu die Probe nach und nach gleichmäßig über die gesamte Platte.
   2. Lassen Sie die Probe 5 Minuten lang in den Agar einweichen, bevor Sie die Platte bei geschlossenem Deckel umdrehen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   3. Wählen Sie eine einzelne E. coli-Kolonie aus, beimpfen Sie 7,5 ml LB-Medium (Tabelle 2) mit dieser Einzelkolonie mit einem sterilen Zahnstocher und lassen Sie sie über Nacht (14 h) unter Rühren (170 U/min) bei 37 °C wachsen.
   4. 2 x 1 ml E. coli-Zellen werden mit sterilen Pipetten in 2 x 500 ml LB-Medium (Tabelle 2) überführt und über Nacht (~14 h) bei 37 °C unter Rühren (~170 U/min) in einem Schüttler wachsen gelassen.
   5. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 20 min bei 4 °C geerntet, das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
      Anmerkungen: Das Nassgewicht des Zellpellets beträgt in der Regel 5 g pro 1 l Kultur. An dieser Stelle kann das Protokoll pausiert werden.
   6. Die Zellen werden aufgetaut und resuspendiert (2 g) in 20 ml Lysepuffer C1 (Tabelle 2) und die Suspension dreimal bei 1.000 psi durch ein vorgekühltes (4 °C) Hochdruck-Zellaufschlusssystem mit einem maximalen Probenvolumen von 35 ml gemäß den Anweisungen des Herstellers geleitet.
      ACHTUNG: Die Verwendung einer French Press kann zu schweren Verletzungen führen. Überschreiten Sie niemals die Druckgrenze der verwendeten Zelle. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
   7. Ungebrochene Zellen werden durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 15 min aus dem Lysat entnommen und der Überstand aufgefangen.
   8. Sammeln Sie die Membranen durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 1 h.
   9. Das Membranpellet wird in 10 ml Puffer C2 (Tabelle 2) resuspendiert und mit einem kugelgelagerten Glashomogenisator mit einem gleichen Volumen SDS-Puffer C3 (Tabelle 2) gemischt.
      ACHTUNG: β-Mercaptoethanol im Puffer C3 ist giftig. Befolgen Sie alle relevanten Sicherheitsvorschriften.
   10. Die Suspension wird im Wasserbad bei 50 °C für 30 min inkubiert.
   11. Zentrifugieren Sie die Probe bei 100.000 x g bei 20 °C für 1 h.
   12. Das Membranpellet wird in 10 ml SDS-Puffer C4 (Tabelle 2) unter Verwendung eines kugelgelagerten Glashomogenisators resuspendiert und die Suspension 30 min lang in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert.
       Anmerkungen: Wenn das Pellet nicht resuspendiert werden kann, fügen Sie mehr SDS-Puffer C4 bis zu einem Volumen von 20 ml hinzu.
   13. Zentrifugieren Sie die Probe bei 100.000 x g bei 20 °C für 30 min und sammeln Sie den Überstand.
   14. Mischen Sie den Überstand mit Octylpolyoxyethylen (Octyl POE) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % (w/v) und dialysieren Sie die Probe zweimal gegen Puffer C5 (Tabelle 2) bei 4 °C für 24 h. Verwenden Sie dazu Dialyseschläuche mit einem Cut-off von 20 kDa gemäß den Anweisungen des Herstellers und geben Sie die Probe in den Dialyseschlauch oder das Dialysegerät.
       HINWEIS: Der Abschnitt des Dialyseschlauchs muss angepasst werden, wenn Proteine mit anderen Molekülmassen dialysiert werden.
   15. Beurteilen Sie die Reinheit der Probe mit SDS-PAGE und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem handelsüblichen Proteinassay gemäß dem Protokoll des Herstellers (Table of Materials).
       HINWEIS: Auf 95 °C erhitzte Proben weisen monomere OmpF auf. Nicht erhitzte Proben zeigen OmpF in seiner trimeren Form (Abbildung 1F).
   16. Schockgefrieren Sie dialysiertes OmpF in Aliquoten in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
       ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff sollte in gut belüfteten Räumen gehandhabt werden. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.

2. Optische Einkanalaufzeichnung von Ionenkanälen in DIB-Membranen

ANMERKUNG: In diesem Abschnitt wird das Verfahren zur Herstellung von DIB-Membranen in mikrofabrizierten Polymethylmethacrylat (PMMA)-Kammern² beschrieben, um die laterale Proteinbewegung und den Ionenfluss durch einzelne Ionenkanäle¹⁷ zu überwachen. Die Maße und genauen Zeichnungen für die Herstellung der Kammer finden Sie in Lepthin et ^al.2. Abbildung 2 gibt einen Überblick über den Aufbau der PMMA-Kammer² und die Ausbildung der DIB-Membranen. Sofern nicht anders angegeben, werden alle Schritte bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung einer DIB-Membran und wie der Ca²⁺ -Fluss durch ein Einkanalprotein verwendet wird, um sowohl die Bewegung in der Membran als auch den offen-geschlossenen Zustand des Kanals zu überwachen.

1. Herstellung von Lipiden
   1. Die in Chloroform gelöste Lipidstammlösung mit 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (25 mg/ml DPhPC) aus dem Gefrierschrank bei -20 °C entnehmen und auf RT erwärmen. Dazu reicht es in der Regel aus, die Probe einige Minuten lang langsam von Hand zu erwärmen.
      ACHTUNG: Chloroform ist giftig. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und führen Sie alle Verfahren mit Chloroform unter einem Abzug durch.
   2. 380 μl DPhPC-Stammlösung (25 mg/ml DPhPC) werden in eine Durchstechflasche aus Glas überführt. Vermeiden Sie Pipetten mit Gummidichtungen. Verwenden Sie stattdessen Mikroliter-Glasspritzen mit Edelstahlkolben.
   3. Nachdem Sie die Lipidstammlösung gehandhabt haben, überlagern Sie die Lipidstammlösung mit Ar- oder_N2-Gas , um eine Lipidoxidation zu verhindern. Verwenden Sie einen möglichst geringen Gasstrom, um ein Verdampfen des organischen Lösungsmittels, in dem die Lipide gelöst werden, oder ein Spritzen der Lösungsmittelsprays aus der Durchstechflasche zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass die Deckel der Glasfläschchen, die Lipide mit organischem Lösungsmittel enthalten, auf der Innenseite mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichtet sind.
   4. Die Lipidprobe (Schritt 2.1.2) wird unter einem_N2-Strom getrocknet und das restliche organische Lösungsmittel über Nacht unter Vakuum (2,0 mbar) mit einer ölfreien Vakuumpumpe aus der Lipidprobe entfernt.
   5. Lösen Sie den Lipidfilm in einer Hexadecan/Silikonöl-Lösung auf, indem Sie mit einer Mikroliter-Glasspritze gleiche Mengen Hexadecan- und Silikonöl (jeweils 500 μl) auf eine endgültige Lipidkonzentration von 9,5 mg/ml zugeben.
      HINWEIS: Die Lipidlösung ist bei RT mehrere Wochen stabil.
2. Herstellung von Agarose-Hydrogel
   1. Bereiten Sie ca. 1 ml niedrigschmelzende Agaroselösung (0,75 % [w/v]) in doppelt deionisiertem Wasser vor und erhitzen Sie sie 20 Minuten lang in einem Heizblock auf 85 °C, um sie für die Schleuderbeschichtung von Glasdeckgläsern zu verwenden.
      HINWEIS: Die Agaroselösung kann mehrere Wochen bei RT aufbewahrt und mehrmals aufgewärmt werden.
   2. Niedrigschmelzende 2,5%ige (w/v) Agaroselösung in 0,66 M_CaCl2 und 8,8 mM HEPES (pH 7,2) herstellen und in einem Heizblock 20 min auf 85 °C erhitzen. Achten Sie darauf, dass die Agarose gut geschmolzen ist.
      Anmerkungen: Die Agaroselösung ist mehrere Wochen bei RT haltbar und kann mehrmals erhitzt werden, genau wie die Agarose (Schritt 2.2.1), die für die Schleuderbeschichtung verwendet wird.
3. Kammeraufbau aus Polymethylmethacrylat (PMMA) und Bildung von Lipidmonoschichten an der Grenzfläche zwischen Hydrogel Hexadecan/Silikonöl
   1. Legen Sie einige Glasdeckgläser (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) in einen Deckglashalter aus Edelstahl und reinigen Sie sie 10 Minuten lang in einem Glasbecher mit Aceton in einem Ultraschallreiniger. Verwenden Sie gerade genug Aceton, um die Deckgläser einzutauchen, und decken Sie das Becherglas locker mit einer Glasplatte ab, um ein druckloses, geschlossenes System zu schaffen, das das Entweichen von Dämpfen während des Reinigungsprozesses minimiert.
      ACHTUNG: Aceton ist ein leicht entzündliches Lösungsmittel mit niedrigem Flammpunkt. Dampf-Luft-Gemische sind explosiv. Betreiben Sie den Ultraschallreiniger in einem gut belüfteten Bereich. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und beachten Sie die behördlichen Sicherheitsvorkehrungen (z. B. keine offenen Flammen und keine Funken).
   2. Spülen Sie die Glasdeckgläser mit doppelt deionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie unter einem_N2-Strahl.
      HINWEIS: Auf diese Weise gereinigte Deckgläser können mehrere Wochen gelagert werden.
   3. Reinigen und hydrophilisieren Sie ein Deckglas in einem Plasmareiniger mit Sauerstoff (0,5 mbar) für 5 min.
      Anmerkungen: Führen Sie diesen Schritt unmittelbar vor dem Schleudern mit Agaroselösung durch, da die hydrophile Wirkung der Plasmareinigung mit der Zeit nachlässt.
   4. Montieren Sie ein plasmabehandeltes Deckglas auf einem Spin-Coater (Abbildung 2, Schritt 1).
   5. Beschichten Sie das Deckglas mit einer submikrometerdicken Agaroseschicht, indem Sie langsam 140 μl erhitzte 0,75 % (w/v) niedrigschmelzende Agarose (Schritt 2.2.1) bei 3.000 U/min für 30 s mit einer 200-μl-Pipette zugeben (Abbildung 2, Schritt 1).
      ANMERKUNG: Die Dicke des Agarosefilms kann durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) bestimmt werden, wie¹⁷ beschrieben.
   6. Befestigen Sie das schleuderbeschichtete Deckglas mit der dünnen Schicht des Agarose-Hydrogels sofort an der Unterseite der PMMA-Kammer². Achten Sie darauf, dass das Agarose-Hydrogel nach oben zeigt (Abbildung 2, Schritt 2).
   7. Befestigen Sie die Kanten des Deckglases mit transparentem Klebeband an der mikrobearbeiteten PMMA-Vorrichtung.
   8. Stellen Sie das PMMA-Gerät auf eine auf 35 °C erhitzte Heizplatte (Abbildung 2, Schritt 3).
   9. Gießen Sie vorsichtig 200 μl 2,5%ige Agaroselösung (Schritt 2.2.2) mit einer Pipette (Abbildung 2, Schritt 3) in den Einlass der Kammer, ohne Luftblasen zu erzeugen, damit das dünne Hydrogel, das durch Schleuderbeschichtung aufgetragen wird, mit dem Puffer der 2,5%igen Agaroselösung gleichgewichtet werden kann und hydratisiert bleibt. Stellen Sie sicher, dass die 2,5%ige Agaroselösung um das spinbeschichtete Agarose-Hydrogel herum verteilt wird, aber nicht darüber (Abbildung 3A), was durch leichtes Drücken der PMMA-Kammer auf die Heizplatte vermieden werden kann.
   10. Die Vertiefungen der PMMA-Kammer (Abbildung 2, Schritt 4) werden sofort mit insgesamt 60 μl Lipid/Öl-Lösung (Schritt 2.1.5) abgedeckt, um die Bildung von Lipid-Monolagen an der Agarose-Öl-Grenzfläche einzuleiten und eine Austrocknung der spinbeschichteten Agarose in den Vertiefungen der PMMA-Kammer zu vermeiden. Bewahren Sie das Gerät auf einer heißen Platte bei 35 °C für ca. 2 h auf.
       HINWEIS: Die kreisförmigen Vertiefungen in der PMMA-Kammer haben einen Durchmesser von 0,5 mm und eine Tiefe von 1,8 mm, wie aus der zuvor veröffentlichten Arbeit² hervorgeht.
4. Herstellung von lipidbeschichteten wässrigen Tröpfchen in Hexadecan/Silikonöl-Lösung
   1. 20 μl Lipidhexadecan/Silikonöl-Lösung (Schritt 2.1.5) werden in mehrere mikrofabrizierte Vertiefungen in einer Tröpfchen-Inkubationskammer gegeben (Abbildung 2, Schritt 4). Geeignete Behälter für die Lipidhexadecan/Silikonöl-Lösung sind kleine Aussparungen von 40 mm x 30 mm x 3,5 mm in einer dünnen PMMA-Platte².
   2. Eine Mikrokapillarglasnadel mit einem Spitzenöffnungsdurchmesser von 20 μm wird mit einem vertikalen oder horizontalen Mikropipettenzieher (z. B. zur Herstellung von Patchpipetten oder scharfen Glaselektroden) hergestellt. Schätzen Sie den Öffnungsdurchmesser der Mikrokapillarglasnadel unter einem binokularen Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung in einem Zoombereich zwischen 7,5x und 35x.
      HINWEIS: Die Einstellungen für den Vorheizmodus vor dem Ziehen der Glaskapillare, den Heizmodus für das Ziehen und die Zugkraft sollten im Voraus experimentell gemäß den Herstellerangaben der Zugvorrichtung und der Art der Kapillare ermittelt werden.
   3. Füllen Sie die Mikrokapillarglasnadel mit 5 μl wässriger Injektionslösung, die 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl und 30 nM TOM-Kernkomplex enthält, oder alternativ 20 nM OmpF mit einer Mikrokapillarpipettenspitze. Verwenden Sie zur Herstellung der wässrigen Injektionslösung nur doppelt destilliertes Wasser, das zuvor mit einem chelatbildenden Harz behandelt wurde, das mehrwertige Metallionen (Ca²⁺) bindet.
   4. Montieren Sie die Mikrokapillarglasnadel mit der wässrigen Injektionslösung auf einem piezogetriebenen Nanoinjektor.
   5. 100-200 nL wässrige Tröpfchen (Abbildung 2, Schritt 4) mit 8,8 mM HEPES (pH 7.2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl und 30 nM TOM-Kernkomplex (Schritt 1.1.12) oder alternativ 20 nM OmpF (Schritt 1.2.16) werden mit dem Nanoinjektor in die Vertiefungen in der Tröpfcheninkubationskammer injiziert, die mit einer Lipidhexadecan/Silikonöl-Lösung (siehe 2.1.5) gefüllt sind. Achten Sie darauf, dass sich die Tröpfchen nicht berühren, indem Sie sie im Abstand von mehreren Millimetern (>10 mm) in die Vertiefungen geben. Wenn sich sonst noch keine Lipid-Monolagen an der Grenzfläche zwischen Öl und Puffer gebildet haben, verschmelzen sie zu größeren Tröpfchen.
      HINWEIS: Wenn keine Klassenkapillaren und keine Nanoinjektoren zur Verfügung stehen, können die Tröpfchen alternativ manuell mit Einkanal-Mikroliterpipetten für Volumina zwischen 0,1 μL und 0,5 μL präpariert werden, wie beschrieben². In diesem Fall sind die Tröpfchenvolumina jedoch nicht so genau.
   6. Lassen Sie die Bildung einer Lipidmonoschicht an der Grenzfläche zwischen Tröpfchen und Öl für ca. 2 h zu, indem Sie die PMMA- und Tröpfcheninkubationskammern (Abbildung 2, Schritt 4) auf einer auf 35 °C erhitzten Heizplatte halten.
5. Präparation und Bildgebung einzelner Ionenkanäle in DIB-Membranen
   1. Einzelne wässrige Tröpfchen aus den Vertiefungen der Tröpfchen-Inkubationskammer unter einem Stereomikroskop werden mit einer Einkanal-Mikroliterpipette mit einer 10-μl-Einweg-Polypropylenspitze manuell in die Vertiefungen der PMMA-Kammer überführt (Abbildung 2, Schritt 5). Lassen Sie die Tröpfchen etwa 5 Minuten lang auf die Lipidmonoschichten sinken, die sich an den Hydrogel-Öl-Grenzflächen bilden, um eine Lipiddoppelschicht (Abbildung 3) zwischen den Tröpfchen und dem Agarose-Hydrogel zu bilden.
   2. Montieren Sie die PMMA-Kammer mit DIB-Membranen auf dem Probenhalter eines Inverslichtmikroskops und beurteilen Sie die Membranbildung mit einem 10-fachen Hoffman-Modulationskontrastobjektiv (Abbildung 2, Schritt 6). Die Bildung der DIB-Membran wird durch einen deutlichen weißen Ring an der Grenzfläche zwischen dem Tröpfchen und dem Hydrogel angezeigt (Abbildung 4A). Gebrochene DIB-Membranen zeigen diesen Ring nicht (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Alternativ können die DIB-Membranen bei 10-facher Vergrößerung durch Phasenkontrast- oder DIC-Mikroskopie (Differential Interference Contrast) visualisiert werden.
   3. Wenn sich DIB-Membranen gebildet haben, montieren Sie die PMMA-Kammer auf dem Probenhalter eines TIRF-Mikroskops (Abbildung 2, Schritt 7), das mit einer konventionellen Lichtquelle für die Epifluoreszenzbeleuchtung, einem 488-nm-Laser (P_max = 100 mW) und einer rückwärtig belichteten elektronenmultiplizierenden CCD-Kamera (512 x 512 Pixel; >95% QE) ausgestattet ist, um eine Pixelgröße von ~0,16 μm zu erreichen.
   4. Fokussieren Sie den Rand einer DIB-Membran mit einem Objektiv mit 10-facher Vergrößerung unter Epifluoreszenzbeleuchtung mit einer hochintensiven Lichtquelle unter Verwendung eines GFP-Filtersets.
   5. Fokussieren Sie den gleichen Rand der DIB-Membran bei hoher Vergrößerung mit einem 100x/N.A. 1.49 apochromaten Öl-TIRF-Objektiv, ebenfalls unter Epifluoreszenzbeleuchtung, mit der hochintensiven Lichtquelle unter Verwendung eines GFP-Filtersatzes, der die Visualisierung der schwachen Hintergrundfluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs Fluo-8 im Tröpfchen ermöglicht (Abbildung 4C).
   6. Ändern Sie die Filtereinstellung von GFP auf den Quadband-TIRF-Filtersatz.
   7. Schalten Sie den 488 nm Laser ein und stellen Sie die Intensität des Lasers auf der Objektivlinse auf einen Wert zwischen 8 mW und 10 mW ein.
      HINWEIS: Da es oft keine quantitativen Informationen über die Laserintensität an der Objektivlinse gibt, sollten die Einstellungen der Laserintensität vorher in separaten Messungen am Objektiv kalibriert werden, wobei ein optisches Laserleistungsmessgerät mit einem Fotodiodensensor gemäß den Herstellerangaben ausgestattet ist.
      ACHTUNG: Um einen sicheren Betrieb des Lasers zu gewährleisten, muss sich der Bediener über die möglichen Gefahren der Laserstrahlung und die Unfallverhütungsvorschriften im Klaren sein.
   8. Um einzelne Ionenkanäle zu visualisieren, stellen Sie den TIRF-Winkel und die Verstärkung der EMCCD-Kamera (z. B. EM-Verstärkungsmultiplikator-Einstellung: 285) so ein, dass offene Ionenkanäle in der DIB-Membran als kontrastreiche Fluoreszenzflecken auf dunklem Hintergrund erscheinen (Abbildung 4D-G) und das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis bei visueller Inspektion ein Maximum erreicht. Achten Sie darauf, dass die Flecken, die dem Ca²⁺-Fluss durch einzelne Ionenkanäle entsprechen, scharf bleiben und eine runde Form haben, mit hoher Intensität in der Mitte und allmählich abnehmend zur Peripherie hin. Membranen ohne Kanäle zeigen nur Hintergrundfluoreszenz (Abbildung 4C).
   9. Bevor Sie die Bewegung und die Aktivität einzelner Kanäle im Laufe der Zeit aufzeichnen, überprüfen Sie, ob fluoreszierende Punkte scharf sind, um sicherzustellen, dass sich die Ionenkanäle in den DIB-Membranen rekonstituiert haben und sich seitlich in der Membranebene bewegen. Ist dies nicht der Fall, könnte dies darauf hindeuten, dass ein fluoreszierendes Molekül in das vom Laser in der Nähe der Membran erzeugte evaneszente Feld ein- und austaucht.
   10. Zeichnen Sie eine Reihe von Membranbildern auf, die eine ordnungsgemäße Verfolgung der Position und die Überwachung des offen-geschlossenen Zustands der einzelnen Ionenkanäle ermöglichen. Um die Art der lateralen Beweglichkeit (z. B. freie Bewegung vs. transiente Verankerung [als Referenz, siehe¹⁶]) und den Zustand der Kanalaktivität (z. B. offen oder geschlossen) zu bestimmen, erfassen Sie ausreichend lange (z. B. 30 s bis 1 min) und gut abgetastete Trajektorien (z. B. Bildrate von 48 ^s-1).
       ANMERKUNG: Die Beobachtung der kanalisierten, eingeschränkten oder Hopfendiffusion¹⁶ erfordert, dass die Abtastrate schnell genug ist, um die uneingeschränkte Diffusion innerhalb der Grenzen zu messen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Abtastzeit der Daten ausreichend lang ist, um den Übergang von der uneingeschränkten zur eingeschränkten Diffusion zu messen (für Details siehe Jacobson et ^al.16).
6. Bild- und Datenverarbeitung
   ANMERKUNG: Open-Source-Bildverarbeitungspakete³³ oder selbstgeschriebene Routinen¹⁷ , die auf kommerziellen Softwarepaketen basieren, können verwendet werden, um die raumzeitliche Dynamik einzelner Ionenkanäle in DIBs zu analysieren. Um die laterale Membranbeweglichkeit mit dem Ionenfluss durch die einzelnen Kanäle korrelieren zu können, sollten keine Filteralgorithmen angewendet werden.
   1. Korrigieren Sie Bildzeitreihen für das Bleaching, indem Sie Standardverfahren³⁴ unter Verwendung selbst geschriebener Routinen anwenden, indem Sie die durchschnittliche Bildintensität des gesamten Bildes an anpassen, wobei t der Bildindex (Zeit) und a_kdie Anpassungsparameter ist. Korrigieren Sie dann die Zeitreihe nach , wobei I(t) die Intensität ist. Alternativ können Sie für erste Datenanalysen Hintergrundkorrekturen durchführen, indem Sie eine Open-Source-Software mit implementierten Rolling-Ball-Algorithmen³³ und einem Rolling-Ball-Radius verwenden, abhängig vom Punkt und der Pixelgröße der Kamera (z. B. 50 Pixel).
   2. Bestimmen Sie die räumlichen Positionen und Amplituden eines Fluoreszenzflecks innerhalb einer definierten Region of Interest (ROI) (z. B. 30 x 30 Pixel), indem Sie I(t) zu einem bestimmten Zeitpunkt t an eine zweidimensionale Gaußsche Funktion mit planarer Neigung anpassen, die mögliche lokale Beleuchtungsgradienten gemäß berücksichtigt. Dabei ist x = (x, y) der ROI mit der Fluoreszenzintensitätsinformation, A und σ sind die Amplitude und Breite des Gauß-Spektrums, p_k sind Parameter, die die Hintergrundintensität des ROI charakterisieren, und μ = (x 0, y ₀) definiert die Position des Gauß-Betrags. Der Ionenfluss durch einen einzelnen Kanal ist durch den Parameter A gegeben. Die Trajektorie des Kanals ist durch x gegeben und ermöglicht es, die laterale Beweglichkeit des Kanals zu bestimmen. Alternativ ist es möglich, die Positionen und Intensitäten einzelner Spots unter Verwendung von Open-Source-Plattformen³³ und Plug-Ins wie^{beschrieben 35,36} zu bestimmen. Schätzen Sie die Positionsgenauigkeit³⁷ nach Umrechnung der EMCCD-Kameraanzeige in Photonenzahlen³⁸.
   3. Zeichnen Sie die Fluoreszenzamplitude A über der Zeit und die entsprechende Trajektorie x auf, um eine mögliche Korrelation zwischen der Kanaldiffusivität und dem Ionenfluss durch den Kanal zu bestimmen. Führen Sie dies mit einer beliebigen Grafiksoftware durch. Bei freier lateraler Kanalbewegung wird der laterale Diffusionskoeffizient D durch lineare Regression der Zeitverzögerung τ bestimmt und die mittlere quadratische Verschiebung der Punkte von x nach berechnet .
      HINWEIS: Typische Diffusionskoeffizienten¹⁷ für TOM-CC und OmpF, die sich in DIB-Membranen frei bewegen, liegen zwischen 0,5 und 1,5 μm^{2 s-1}. Moleküle, deren Diffusionskonstante kleiner als 0,01 mm²·^s-1 ist, werden als immobilisiert¹⁷ definiert.

Die elektrodenfreie optische Einkanalaufzeichnung in Echtzeit zeigt das Zusammenspiel zwischen lateraler Proteinbewegung und der Funktion einzelner Ionenkanäle in DIB-Membranen. Die Rekonstitution des mitochondrialen TOM-Core-Komplexes (Abbildung 1A) in eine DIB-Membran (Abbildung 4D) zeigt eine starke zeitliche Korrelation zwischen lateraler Mobilität und Ionenpermeabilität (Abbildung 5A). Die TOM-CC-Anspritzung scheint empfindlich auf die Art der seitlichen Bewegung17 zu reagieren. Bewegte Kanäle zeigen durch ihre Poren einen Ca2+-Fluss und hohe Fluoreszenzpunktintensitäten. Eingeschlossene, sich nicht bewegende Moleküle weisen niedrige und mittlere Fluoreszenzintensitäten auf. Für die allgemeine Proteinimportpore der Mitochondrien TOM-CC zeigte dieser Einzelmolekülansatz eine starke zeitliche Korrelation zwischen lateraler Mobilität und Ionenpermeabilität, was darauf hindeutet, dass der TOM-CC-Kanal mechanosensitive Eigenschaften besitzt17. Ein seitlicher Stopp frei beweglicher TOM-CC-Moleküle geht mit einem teilweisen oder vollständigen Verschluss des TOM-CC-Kanals einher. Die Abbildung von DIB-Membranen mit OmpF (Abbildung 1E und Abbildung 4F), das fast vollständig in die Membran eingebettet ist, zeigt keine Stop-and-Go-Effekte (Abbildung 5B). Zufällige Stopps von OmpF sind nicht mit einer Änderung der Intensität und damit mit dem Schließen seiner Poren verbunden. Anhand der Fluoreszenzsignale38 kann die Positionsgenauigkeit der einzelnen Kanäle im Bereich zwischen 5 und 10 nm abgeschätzt werden. Es ist jedoch zu beachten, dass diese Genauigkeit nicht erreicht werden kann, wenn die Kanäle aufgrund der beweglichen Verankerung mit dem Agarose-Hydrogel leicht wackeln, wie dies beispielsweise für die TOM-CC-Moleküle in einem Zwischenzustand mit einer mittleren Verschiebung von 120 nm gezeigt wird (Abbildung 5A).

Abbildung 1: Isolierung von TOM-CC. (A) Kryo-EM-Struktur von N. crassa TOM-CC30,39. Mitochondrien eines N. crassa-Stammes, der ein Tom22 mit einem 6xHis-Tag enthielt, wurden in DDM solubilisiert und einer Ni-NTA-Affinitätschromatographie (B) und Anionenaustauschchromatographie (C) unterzogen. (D) SDS-SEITE des isolierten TOM-CC. (E) Kristallstruktur (PDB, 1OPF) und (F) SDS-PAGE von gereinigtem E. coli OmpF. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Flussdiagramm der PMMA-Kammerbaugruppe. Schritt 1: Ein Glasdeckglas wird mit einem Agarose-Hydrogel geschleudert. Schritt 2: Das spinbeschichtete Deckglas wird in einer speziell angefertigten PMMA-Mikroskopiekammer montiert. Schritt 3: Zusätzliche niedrigschmelzende Agarose wird auf einer 35 °C heißen Heizplatte in die Einlassöffnung der PMMA-Kammer gegeben. Schritt 4: Lipid-Monoschichten werden um wässrige Tröpfchen an einer Puffer/Öl-Grenzfläche (links) und an der Agarose-Hydrogel/Öl-Grenzfläche (rechts) gebildet. Schritt 5: Einzelne wässrige Tröpfchen werden in die Vertiefungen der PMMA-Kammer pipettiert, um bei Kontakt der beiden Lipidmonoschichten eine Lipiddoppelschicht zu bilden. Schritt 6: Die Bildung der DIB-Membranen wird mittels Hofmann-Modulationskontrastmikroskopie validiert. Schritt 7: Bilder ausgewählter Bereiche der DIB-Membranen mit eingefügten Ionenkanälen werden mittels TIRF-Mikroskopie aufgenommen. Grün: 0,75% Agarose; gelb: 2,5 % Agarose mit Ca2+ Ionen; Magenta: Lipid-/Ölphase; dunkelblau: wässriger Tröpfchenpuffer, der Ca2+-empfindlichen Farbstoff und Protein enthält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Versuchsaufbau. (A) Schematische Darstellung einer DIB-Membran in einer PMMA-Well. Die Doppelschicht ruht auf einem ultradünnen 0,75%igen Agarosefilm, um die TIRF-Bildgebung des Ca 2+-Flusses durch einen Ionenkanal im Laufe der Zeit unter Verwendung eines Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs (Fluo-8) in trans zu ermöglichen. (B) Der Ca2+-Fluss wird ausschließlich durch den osmotischen Druck von cis nach trans gesteuert, was sowohl die Bestimmung der Position in der Membran als auch des offen-geschlossenen Zustands des Kanals ermöglicht. Bei dem hier gezeigten Kanal handelt es sich um den proteinleitenden Kanal TOM-CC der Mitochondrien von N. crassa 30. (C) Trajektorie eines einzelnen TOM-CC-Kanals. Grün: sich bewegender Kanal; Gelb: nicht beweglicher Kanal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Bildgebung von TOM-CC und OmpF in DIB-Membranen . (A) DIB-Membran, aufgenommen mittels Hoffmann-Modulationskontrastmikroskopie, die die Doppelschicht-Kontaktfläche zwischen dem Hydrogel und dem Tröpfchen zeigt. (B) Gebrochene DIB-Membran abgebildet wie in (A). Pfeil, Rand der PMMA-Kammer. (C) DIB-Membran, abgebildet mittels TIRF-Mikroskopie ohne Proteinkanäle. (D) DIB-Membran mit rekonstituiertem TOM-CC, abgebildet mittels TIRF-Mikroskopie. Die weißen Quadrate markieren Flecken mit hoher (SH), mittlerer (SI) und niedriger (SL) Intensität. (E) Die Anpassung des Fluoreszenzintensitätsprofils der drei in (A) markierten Punkte an zweidimensionale Gaußsche Funktionen zeigt die Position einzelner TOM-CCs und des Ca2+ -Flusses durch den Kanal. (F) DIB-Membran mit rekonstituiertem OmpF. (G) Gaußsche Anpassung des in (F) markierten Fluoreszenzflecks. Im Gegensatz zum zweiporigen β-Barrel-Proteinkomplex TOM-CC weist das dreiporige β-Barrel-OmpF nur einen Permeabilitätszustand auf. Pixelgröße: 0,16 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Die Kanalaktivität korreliert mit der lateralen Beweglichkeit von TOM-CC. (A) Die Fluoreszenzamplitudenspur (oben) und die entsprechende Trajektorie (unten) von TOM-CC deuten darauf hin, dass die Aktivität des offen-geschlossenen Kanals von TOM-CC mit der lateralen Membranmobilität des Komplexes korreliert. Die Trajektorie weist drei Permeabilitätszustände auf. Grün: vollständig geöffneter Zustand; gelb: mittlerer Permeabilitätszustand; rot: Zustand des geschlossenen Kanals; roter Stern: TOM-CC wackelt im Zwischenzustand um etwa ±60 nm um seine mittlere Position. Die Positionsgenauigkeiten37, bezogen auf die Fluoreszenzsignale im vollständig geöffneten und mittleren Zustand, liegen im Bereich zwischen 5 nm und 10 nm. (B) Fluoreszenzamplitudenspur (oben) und entsprechende Trajektorie (unten) von OmpF. OmpF zeigt nur eine Intensitätsstufe an, unabhängig davon, ob sie in Bewegung oder gefangen ist. Die Trajektoriensegmente, die den Zeitperioden der gefangenen Moleküle entsprechen, sind grau markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Pufferlösungen für die TOM-CC-Isolierung.

Tabelle 2: Pufferlösungen für die OmpF-Isolierung.

Wir erklären keine Interessenkonflikte.