Methodenartikel

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

DOI:

10.3791/64971

⸱

2. Juni 2023

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1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben schrittweise Protokolle zur Messung der mitochondrialen Atmung von Maus und humanen Neutrophilen und HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Zusammenfassung

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Neutrophile Granulozyten sind die erste Verteidigungslinie und die am häufigsten vorkommenden Leukozyten beim Menschen. Diese Effektorzellen führen Funktionen wie Phagozytose und oxidativen Burst aus und erzeugen extrazelluläre Fallen (NETs) für die mikrobielle Clearance. Neue Erkenntnisse über die Stoffwechselaktivitäten von Neutrophilen stellen die frühe Vorstellung, dass sie in erster Linie auf Glykolyse angewiesen sind, in Frage. Durch die präzise Messung der Stoffwechselaktivitäten können unterschiedliche Stoffwechselanforderungen von Neutrophilen aufgedeckt werden, darunter der Tricarbonsäurezyklus (TCA) (auch Krebszyklus genannt), die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), der Pentosephosphatweg (PPP) und die Fettsäureoxidation (FAO) unter physiologischen Bedingungen und in Krankheitszuständen. In diesem Artikel werden ein Schritt-für-Schritt-Protokoll und die Voraussetzungen für die Messung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Indikator für die mitochondriale Atmung an aus dem Knochenmark der Maus, aus menschlichem Blut gewonnenen Neutrophilen und der neutrophilenähnlichen HL60-Zelllinie unter Verwendung der metabolischen Flussanalyse auf einem metabolischen extrazellulären Flussanalysator beschrieben. Diese Methode kann zur Quantifizierung der mitochondrialen Funktionen von Neutrophilen unter normalen und Krankheitsbedingungen verwendet werden.

Einleitung

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Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle in der Zellbioenergetik, die durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) Adenosintriphosphat (ATP) erzeugt. Darüber hinaus erstreckt sich die Rolle der Mitochondrien auf die Erzeugung und Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies, die Kalziumregulierung der zytoplasmatischen und mitochondrialen Matrix, die Zellsynthese, den Katabolismus und den Transport von Metaboliten innerhalb der Zelle1. Die mitochondriale Atmung ist in allen Zellen unerlässlich, da ihre Funktionsstörung zu Stoffwechselproblemen 2 führen kann, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen3 und einer Vielzahl neurodeg....

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Protokoll

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Heparinisierte Vollblutproben wurden von gesunden menschlichen Spendern nach Einholung der Einverständniserklärung gewonnen, die vom Institutional Review Board von UConn Health in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki genehmigt wurde. Alle Tierversuche folgten den Richtlinien des UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), und die Genehmigung für die Verwendung von Nagetieren wurde von der UConn Health IACUC gemäß den Kriterien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health eingeholt. In dieser Studie wurden männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 6 Wochen verwendet.

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Ergebnisse

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Es wird eine repräsentative OCR-Dynamik gezeigt, die auf die mitochondrialen Atmungsänderungen als Reaktion auf Oligomycin, FCCP und Rotenon/Antimycin A-Mischung aus neutrophilen Granulozyten der Maus (Abbildung 3A), humanen Neutrophilen (Abbildung 3B) und undifferenzierten und differenzierten HL60-Zellen (Abbildung 3C) hinweist. In allen Zellen senkt die Behandlung mit Oligomycin den OCR-Wert, indem der Protonenkanal der ATP-Syntha.......

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Diskussion

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Das Standardverfahren, das die mitochondriale Atmung von Neutrophilen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator misst, ist durch viele Faktoren begrenzt, darunter Zellzahl, Zellwachstum und Lebensfähigkeit. Die jeweilige Substanzkonzentration variiert je nach Art und Quelle der Zellen in diesem Assay. Oligomycin und Rotenon/Antimycin A werden bei den meisten Zelltypen meist in ähnlicher Konzentration eingesetzt. Da die FCCP-induzierte maximale Atemfrequenz jedoch zwischen verschiedenen Zellen variiert, ist ei.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären kein konkurrierendes finanzielles Interesse.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Anthony T. Vella und Dr. Federica Aglianoin von der Abteilung für Immunologie an der UConn Health für ihre Ausbildung im Umgang mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator und Dr. Lynn Puddington von der Abteilung für Immunologie an der UConn Health für ihre Unterstützung der Instrumente. Wir danken Dr. Geneva Hargis von der UConn School of Medicine für ihre Hilfe beim wissenschaftlichen Schreiben und Lektorat dieses Manuskripts. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health, des National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), des National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 und P20GM139763), e....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
37°; C Nicht-CO2  InkubatorPrecisionEconomy Model 2EGInstrument
BiorenderSoftware
Application CentrifugeEppendorfModel 5810RInstrument
Corning  Cell-Tak Zell- und GewebeklebstoffCorning102416-100Reagenz
EasySep MagnetSTEMCELL18000Magnet
EasySepMouse NeutrophilenanreicherungskitSTEMCELL19762AReagenzien
Graphpad Prism 9Softwareanwendung
Humanserum Albuminlösung (25%)GeminiBio800-120Reagenzien
Ketamin (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10Anästhetikum
PBSCytivaSH30256.01Reagenzien
PlatteneimerEppendorfUL155Zubehör
PolymorphPrepPROGEN1895 (vorherige 1114683)Polysaccharidlösung
Gereinigte Maus Anti-Human-CD18-AntikörperBiolegend302102Klon TS1/18
RPMI 1640 MediumGibco11-875-093Reagenzien
Seepferdchen metabolischer extrazellulärer FlussanalysatorAgilentXFe96Instrument
Seepferdchen XF Cell Mito Stresstest-KitAgilent103015-100mitochondrialer Stresstest-Kit
AusschwingrotorEppendorfA-4-62Rotor
Vactrap 2 VakuumfalleFox Lifesciences3052101-FLSInstrument
WaveSoftwareanwendung
XF 1,0 M GlukoselösungAgilent103577-100Reagenz
XF 100 mM PyruvatlösungAgilent103578-100Reagenz
XF 200 mM GlutaminlösungAgilent103579-100Reagenz
XF DMEM MediumAgilent103575-100Reagenz
XFe96 FluxPakAgilent102601-100Material
Xylazin (anaSed Injektion)DAILYMEDNDC 59399-110-20Anästhetikum

Referenzen

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  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation....

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Schlagwörter

Mitochondriale RespirationBioenergetik von NeutrophilenSauerstoffverbrauchratemetabolischer FlussanalyseExtracellular Flux Analyzermitochondrialer StresstestHL60 Zellenoxidative PhosphorylierungElektronentransportketteBasalrespiration

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