Methodenartikel

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

DOI:

10.3791/64977

⸱

17. Februar 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die CRISPR/Cas9-Technologie hat den Wert des Zebrafisches für die Modellierung menschlicher genetischer Krankheiten, die Untersuchung der Krankheitspathogenese und das Screening von Medikamenten erhöht, aber die Einschränkungen des Protospacer-benachbarten Motivs (PAM) sind ein großes Hindernis für die Erstellung genauer Tiermodelle menschlicher genetischer Erkrankungen, die durch Einzelnukleotidvarianten (SNVs) verursacht werden. Bisher haben einige SpCas9-Varianten mit breiter PAM-Kompatibilität ihre Wirksamkeit im Zebrafisch gezeigt. Die Anwendung des optimierten SpRY-vermittelten Adenin-Basen-Editors (ABE), zSpRY-ABE8e und synthetisch modifizierter gRNA im Zebrafisch hat eine effiziente Adenin-Guanin-Basenumwandlung ohne PAM-Einschränkung ermöglicht. Hier wird ein Protokoll zur effizienten Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Begrenzung im Zebrafisch unter Verwendung von zSpRY-ABE8e beschrieben. Durch die Injektion einer Mischung aus zSpRY-ABE8e mRNA und synthetisch modifizierter gRNA in Zebrafischembryonen wurde ein Zebrafisch-Krankheitsmodell mit einer präzisen Mutation konstruiert, das eine pathogene Stelle des TSR2-Ribosomenreifungsfaktors (tsr2) simulierte. Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für die Etablierung genauer Krankheitsmodelle zur Untersuchung von Krankheitsmechanismen und -behandlungen dar.

Einleitung

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Einzelnukleotidvarianten (SNVs), die Missense- oder Nonsense-Mutationen verursachen, sind die häufigste Quelle für Mutationen im menschlichen Genom1. Um festzustellen, ob eine bestimmte SNV pathogen ist, und um ihre Pathogenese aufzuklären, sind präzise Tiermodelle erforderlich2. Zebrafische sind gute menschliche Krankheitsmodelle, die ein hohes Maß an physiologischer und genetischer Homologie mit dem Menschen, einen kurzen Entwicklungszyklus und eine starke Fortpflanzungsfähigkeit aufweisen, was für die Erforschung pathogener Eigenschaften und Mechanismen sowie für das Screening von Medikamenten von Vorteil ist3.

Das CRISPR/Cas9-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde in großem Umfang in der Genom-Editierung verschiedener Arten, einschließlich Zebrafisch4, eingesetzt. Mit gRNA-Führung kann das CRISPR/Cas9-System DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) an der Zielstelle erzeugen, die dann eine Einzelbasensubstitution durch Rekombination der Zielstelle mit Spender-DNA-Vorlagen über den Homologie-gerichteten Reparaturweg (HDR) ermöglichen. Die Effizienz dieser Basenersatzmethode ist jedoch recht gering, da der zelluläre DNA-Reparaturprozess hauptsächlich über den nicht-homologen End-Joining-Signalweg (NHEJ) durchgeführt wird, der in der Regel von Insertions- und Deletionsmutationen (Indel-Mutationen) begleitet wird5. Glücklicherweise entschärft die CRISPR/Cas9-basierte Single-Base-Editing-Technologie dieses Problem erheblich, indem sie Basis-Editoren verwendet, die eine effizientere Single-Base-Bearbeitung ermöglichen, ohne DSBs zu induzieren. Zwei Hauptklassen von Baseneditoren, Adenin-Basen-Editoren (ABEs) und Cytosin-Basen-Editoren (CBEs), wurden entwickelt, um die Basensubstitutions-Editierung für A· T bis G· C und C·G bis T· A bzw. 6,7,8,9,10,11. Diese vier Arten von Basensubstitutionen decken 30 % der humanpathogenen Variantenab 12. Es wurde berichtet, dass beide Klassen von Basiseditoren, einschließlich PmCDA1, BE-System, CBE4max, ABE7.10 und ABE8e, in Zebrafischen funktionieren, wobei BE4max und ABE8e insbesondere eine hohe Bearbeitungsaktivität erreichen 13,14,15,16,17,18,19.

Cas9-Proteine aus verschiedenen Spezies, darunter Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes und S. canis, wurden in die Genom-Editierung von Zebrafischen implementiert, wobei das Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) am häufigsten verwendet wurde20,21,22,23. SpCas9 kann jedoch nur Zielstellen mit einem NGG-Protospacer-Nachbarmotiv (PAM) erkennen, was seinen editierbaren Bereich einschränkt und dazu führen kann, dass keine geeignete Sequenz in der Nähe des pathogenen Ortes gefunden wird24. Um den Zielbereich zu erweitern, wurde eine Vielzahl von SpCas9-Varianten entwickelt, um verschiedene PAMs durch gerichtete Evolution und strukturgeführtes Design zu erkennen. Allerdings sind nur wenige Varianten bei Tieren wirksam, insbesondere bei Zebrafischen, was die Anwendung von Zebrafischen in der SNV-bezogenen Krankheitsforschung einschränkt25,26,27,28. Kürzlich wurde berichtet, dass zwei Varianten von SpCas9, SpG und SpRY, mit weniger strengen PAM-Einschränkungen (NGN für SpG und NNN für SpRY mit einer höheren Präferenz für NRN als NYN), eine hohe Editieraktivität in menschlichen Zellen und Pflanzen aufweisen 29,30,31,32. In der Folge wurde berichtet, dass SpG und SpRY sowie eine Reihe ihrer vermittelten Basiseditoren, wie z. B. SpRY-vermittelte CBEs und SpRY-vermittelte ABEs, auch im Zebrafisch funktionieren, was die Anwendung von Zebrafischmodellen in der mechanistischen Untersuchung und dem Arzneimittelscreening von SNV-bedingten Krankheiten verbessern wird 18,33,34,35. Darüber hinaus wurde i-Silence als effektive und genaue Gen-Knockout-Strategie durch ABE-vermittelte Start-Codon-Konversion von ATG zu GTG oder ACG36 vorgeschlagen. Die Kombination aus der i-Silence-Strategie und dem SpRY-vermittelten Basiseditor zSpRY-ABE8e stellt eine neue Methode zur Krankheitsmodellierungdar 18. Dieses Protokoll demonstriert, wie Genom-Editierung mit zSpRY-ABE8e im Zebrafisch durchgeführt werden kann, um ein tsr2 (M1V)-Modell unter Verwendung der i-Silence-Strategie zu konstruieren. Die Editiereffizienz und die Phänotypen, die in Zebrafischmodellen auftreten, wurden bewertet und analysiert.

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Protokoll

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Diese Studie wurde unter strikter Einhaltung der Richtlinien des Care and Use Committee der South China Normal University durchgeführt.

1. Herstellung synthetisch modifizierter gRNA und zSpRY-ABE8e mRNA

  1. Design der gRNA nach früheren Veröffentlichungen37,38.
    1. Wählen Sie vorzugsweise NRN als PAM-Sequenz aus, da zSpRY-ABE8e eine höhere Präferenz für NRN-PAM als NYN-PAM zeigt (wobei R A oder G und Y C oder T ist)18. Stellen Sie sicher, dass sich das Adenin-Zielnukleotid im hochaktiven Editierfenster befindet (drittes bis neuntes Nukleotid entlang des Protospacers).
  2. Bestellen Sie EasyEdit sgRNA (EE gRNA), modifiziert mit 2′-O-methyl-3′-phosphorothioat (MS) an beiden Enden (Abbildung 1).
    HINWEIS: Die EE-gRNA sollte in RNase-freiem Wasser gelöst und bei −80 °C gelagert werden.
  3. Linearisieren Sie das zSpRY-ABE8e-Plasmid18.
    1. Linearisieren Sie 6 μg des Plasmids mit dem XbaI-Enzym (Table of Materials) in einem Metallbad bei 37 °C für 3 h.
    2. Reinigen Sie das linearisierte Plasmid mit dem DNA-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Transkribieren Sie die mRNA mit dem In-vitro-Transkriptionskit (Materialtabelle).
    1. Transkribieren Sie die zSpRY-ABE8e mRNA mit dem linearisierten Plasmid als Template gemäß den Herstellerangaben.
      HINWEIS: Alle Operationen, bei denen mRNA und gRNA verwendet werden, erfordern die Verwendung von RNase-freiem Laborbedarf.
  5. Verwenden Sie das RNA-Aufreinigungskit (Materialtabelle), um die mRNA gemäß den Anweisungen des Herstellers aufzureinigen.
    Anmerkungen: Vor der Elution muss das Ethanol getrocknet werden, um eine Zytotoxizität zu vermeiden, und die mRNA sollte bei −80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort verwendet wird.

2. Herstellung von Mikroinjektionsglaskapillaren

  1. Richten Sie das Mikropipettenziehersystem ein und heizen Sie es mindestens 30 Minuten lang vor.
  2. Führen Sie einen Rampentest durch, um den Heizwert zu bestimmen, der zum Schmelzen der Borosilikatglaskapillaren (mit 1 mm Außendurchmesser und 0,58 mm Innendurchmesser) gemäß den Anweisungen des Herstellers erforderlich ist.
  3. Wählen Sie ein Programm aus und klicken Sie auf die Zahl auf der Tastatur, um die Parameterwerte einzugeben. Stellen Sie die folgenden Parameter ein, um die Glaskapillaren zu ziehen: Wärme = Rampentestwert, Zug = 50, Geschwindigkeit = 100, Zeit = 50 und Druck = 30.
  4. Installieren Sie das Kapillarrohr und stellen Sie sicher, dass es sich in der Nut befindet. Drücken Sie PULL START/STOP, um das Programm auszuführen.
  5. Bewahren Sie die gezogenen Kapillaren auf, indem Sie sie in Schaumstoff einführen, der Lücken enthält, und halten Sie die Nadel in der Schwebe.

3. Mikroinjektion der mRNA- und EE-gRNA-Mischung zSpRY-ABE8e in Zebrafischembryonen

  1. Stellen Sie in der Nacht vor der Injektion Aufzuchtbecken. Setzen Sie eine Trennwand ein, legen Sie zwei weibliche und einen männlichen Zebrafisch des AB-Stammes (3-18 Monate alt) in jedes Aquarium und decken Sie es mit dem Deckel ab. Siehe frühere Veröffentlichungen für geschlechtsspezifische Unterscheidungen39.
    HINWEIS: Um mehr Embryonen zu erhalten, wählen Sie Fische aus, die seit mindestens 1 Woche nicht mehr gebrütet haben.
  2. Am nächsten Morgen vor der Injektion die zSpRY-ABE8e mRNA und EE gRNA auf Eis auftauen. Mischen Sie die mRNA und die gRNA bis zu Endkonzentrationen von 400 ng/μl bzw. 200 ng/μl.
    1. Führen Sie die gesamte Prozedur auf Eis mit RNase-freien Spitzen und Röhrchen durch und fassen Sie sie mit Handschuhen an.
  3. Konfigurieren Sie den pneumatischen Mikroinjektor. Schließen Sie das Partialdruckventil der Luftpumpe und öffnen Sie zuerst das Hauptventil, schrauben Sie die Gasflasche ab und stellen Sie den Druck des Partialdruckventils auf 0,2 MPa/29 psi ein.
    1. Schalten Sie den pneumatischen Mikroinjektor ein, stellen Sie den Modus auf TIMER ein und stellen Sie den Druckwert des Anfangsparameters auf 20,0 psi und den TIMER-Wert auf 0,040 s ein.
  4. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Nadeln der gezogenen Glaskapillaren unter einem Stereomikroskop vorsichtig zu brechen, und achten Sie darauf, dass die Nadeln schräg geschnitten sind, um das Durchstechen des Chorions und des Eies zu erleichtern.
    Anmerkungen: Die Bruchstelle der Nadel muss an der richtigen Stelle sein und stark genug sein, um das Ei zu durchstechen, aber dünn genug, um Schäden am Ei zu minimieren.
  5. Geben Sie das Gemisch aus zSpRY-ABE8e mRNA und gRNA mit einer Microloader-Pipettenspitze an die Spitze einer Glaskapillare, um Blasen in der Kapillare zu vermeiden. Befestigen Sie die Nadel am Mikromanipulator und konfigurieren Sie den Druck und den TIMER-Wert des Injektors, um sicherzustellen, dass 2 nL Gemisch pro Injektion mit einer Mikrokappe erzeugt werden.
  6. Trennen Sie die Trennwände der Aufzuchtbecken und lassen Sie die Fische 10-15 Minuten lang brüten. Sammeln Sie die Eier mit einem Sieb und untersuchen Sie das Zellstadium und die Qualität der Eier unter einem Stereomikroskop. Wählen Sie die Eizellen im Einzelzellzustand für die Injektion aus, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern.
  7. Die Eier werden auf einer Injektionsplatte mit 1,5 % Agarose ausgekleidet und 2 ml der Mischung unter einem Mikroskop in die Zelle und nicht in das Eigelb der Embryonen injiziert, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern. Behalten Sie mindestens 15 Eier als Kontrollgruppe.
  8. Verwenden Sie 1x E3-Puffer, um die Eier in Petrischalen zu sammeln, und legen Sie sie in einen Inkubator bei 28 °C. Entfernen Sie die toten Eizellen und wechseln Sie den Kulturpuffer alle 12 Stunden bis 48 Stunden nach der Befruchtung (hpf).

4. Effizienzanalyse des Base Editing mit EditR

  1. Bei 48 hpf werden drei Pools mit sechs zufällig ausgewählten injizierten Embryonen bzw. sechs zufällig ausgewählten Kontrollembryonen in PCR-Röhrchen gesammelt. Verwenden Sie eine Pipette, um den verbleibenden E3-Puffer abzusaugen.
  2. Geben Sie 40 μL 50 mM NaOH in die PCR-Röhrchen. Die Röhrchen werden für 20 min in ein Metallbad bei 95 °C gelegt und dann 15 s lang gewirbelt.
  3. Fügen Sie 4 μL 1 M Tris· hinzu HCl (pH 8,0) in jedes Röhrchen, um das NaOH zu neutralisieren. Kurz bei 2.000 x g für 10 s bei Raumtemperatur zentrifugieren, um Tröpfchen von der Röhrchenwand zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand in neuen PCR-Röhrchen und lagern Sie diese bei −20 °C.
  4. Entwerfen Sie geeignete Primer stromaufwärts und stromabwärts der gRNA-Zielstellen. Verwenden Sie 1 μL des obigen Überstands als Vorlage für die PCR-Reaktionen mit einem Volumen von 50 μL. Die in dieser Studie für die PCR verwendeten Primer sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.
  5. Führen Sie eine DNA-Agarose-Gelelektrophorese durch, um korrekte und spezifische Banden sicherzustellen, gefolgt von einer Sanger-Sequenzierung, wie zuvor beschrieben40.
  6. Analysieren Sie die Sanger-Sequenzierungsdaten mit dem Programm EditR (1.0.10)41.
    1. Laden Sie die Sequenzierungsdatei (ab1-Format) in das Feld ".ab1-Datei hochladen" hoch.
    2. Geben Sie die 20 bp gRNA-Sequenz in 5′-3′-Ausrichtung in das Feld "gRNA-Sequenz eingeben" ein.
    3. Öffnen Sie die Sequenzierungsdatei (ab1-Format) und bestätigen Sie die Basispositionen, an denen die 20 bp gRNA-Sequenz beginnt und endet. Geben Sie die entsprechende Basisposition in die Felder "5′ Start" und "3′ Ende" ein.
    4. Klicken Sie auf Predicted Editing , um die Effizienz der Basisbearbeitung zu erhalten. Überprüfen Sie die Qualität der Sequenzierungsdaten in der Nähe der gRNA-Zielsequenz, um ungeordnete Peaks oder Indels zu vermeiden.
      HINWEIS: Im Allgemeinen können die ungeordneten Peaks durch Einstellen der PCR-Annealing-Temperatur effektiv entfernt werden.

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Ergebnisse

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Es wurde berichtet, dass die Mutation von TSR2 eine Diamond Blackfan-Anämie (DBA) verursacht42. In dieser Arbeit wurde ein DBA-Zebrafischmodell mit einer tsr2 (M1V)-Mutation unter Verwendung der i-Silence-Strategie konstruiert. Das Adenin des Startcodons des Zebrafisches tsr2 wurde mit Hilfe von zSpRY-ABE8e erfolgreich in Guanin umgewandelt (Abbildung 3).

Die EditR-Analyse der Sanger-Sequenzierungsergebnisse zeigt...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Zebrafisch-Krankheitsmodells mit Hilfe des Basiseditors zSpRY-ABE8e. Im Vergleich zum herkömmlichen HDR-Pfad für die Basensubstitution kann dieses Protokoll eine effizientere Basisbearbeitung erreichen und das Auftreten von Indels reduzieren. Gleichzeitig beinhaltet dieses Protokoll die Umsetzung der kürzlich vorgeschlagenen i-Silence-Gen-Knockout-Strategie im Zebrafisch. Zusammenfassend wird zSpRY-ABE8e die Anwendung von Zebrafischmodellen in der Krankheitsforschung ver...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Wir danken Barbara Garbers, PhD, von Liwen Bianji (Edanz) für die Bearbeitung des englischen Textes eines Entwurfs dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das Key-Area Research and Development Program der Provinz Guangdong (2019B030335001), das National Key R&D Program of China (2019YFE0106700), die National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) und das Research Fund Program des Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseSigma-AldrichA95391,5 % Agarose zur Herstellung einer Injektionsplatte
Borosilikatglas Kapillaren Harvard ApparaturBS4 30-0016
Zellkulturschalen Falcon351029
ClonExpress Ultra One Step KlonierungskitVazymeC115Kit für Infusionsklon
Codon-OptimierungsserviceSangon Biotech
Drummond MicrocapsDrummond MicrocapsP1299-1PAKLänge:32 mm, Kapazität:0,5 μ L
EasyEdit gRNA-ServiceGenScript
Feine PinzetteFeines wissenschaftliches Instrument11254-20Wird zum Aufbrechen von Meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller StotterinstrumentP-97Wird verwendet, um die Glaskapillaren zu ziehen
HotStart Taq PCR StarMixGenstarA033-101Wird für die PCR-Reaktion
verwendet Intelligente künstliche KlimaboxTENLINPRX-1000AWird verwendet, um Zebrafischembryonen zu kultivieren
MethylcelluloseSigma-AldrichM0512Wird verwendet, um Zebrafische beim Fotografieren von
Microloader-Pipettenspitzen zu fixieren. nbsp;Eppendorf5242956003
mMACHINE Bausatz 
Mut Express II Fast Mutagenese Kit V2VazymeC214-01Kit für ortsgerichtete Mutagenese
Pneumatischer MikroinjektorZGene BiotechZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9Addgene46757
RNeasy FFPE Kit Qiagen73504Kit für die RNA-Aufreinigung
Sanger-SequenzierungsserviceSangon Biotech
Natriumhydroxid, granuliertSangonA100173-0500NaOH für die Genomextraktion
StereomikroskopOlympus SZX10Wird für die Fotografie des Phänotyps
verwendet SZ-Serie Zoom StereomikroskopCNOPTECSZ650
T3 mMESSAGEAmbionAM1348Kit für die In-vitro-Transkription 
TIANprep Mini Plasmid KitTIANGENDP103-03Kit für Plasmid-Extraktionskit
TIANquick Mini Purification KitTIANGENDP203-02Kit für die Aufreinigung von linearisiertem Plasmid
TricainSigma-AldrichE10521Wird zur Anästhesie von Zebrafischen
verwendet Tris (Hydroxymethyl) AminomethanSangonA600194-0500Bestandteil von Tris· HCl für die Genomextraktion
XbaINew England BiolabsR0145SRestriktionsendonuklease für die Plasmidlinearisierung
verwendet

Referenzen

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Zebrafish Base EditingPAM Less EditingAdenine Base EditingSingle Nucleotide VariantCRISPR Cas9 ZebrafishDisease Model ZebrafishSanger SequencinggRNA DesignDiamond Blackfan Anemia

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