Die Struktur höherer Ordnung (HOS) ist ein wichtiger Aspekt der Proteincharakterisierung, da sie eng mit der Proteinfunktion zusammenhängt. Die Massenspektrometrie (MS) ist eine der wichtigsten Methoden zur Beurteilung des Proteins HOS1. Obwohl MS-basierte Ansätze nicht in der Lage sind, die Proteinstruktur mit atomarer Auflösung aufzulösen, haben sie die Vorteile einer mittleren bis hohen räumlichen Auflösung, einer hohen Spezifität, geringer Anforderungen an die Probenmenge, eines hohen Durchsatzes und proteomischer Fähigkeiten.
MS-basierte Protein-Footprinting-Ansätze bewerten das Protein HOS, indem sie die lösungsmittelzugängliche Oberfläche des Proteins analysieren, und sie sind in der Regel mit verschiedenen chemischen Markierungsansätzen gekoppelt. Reversible Markierung, z. B. durch Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX), zielt auf die Amid-Wasserstoffatome im Protein 1,2 ab. Bei der irreversiblen Markierung werden entweder Chemikalien verwendet, die auf bestimmte Aminosäureresteabzielen 3, oder Radikale, die eine Vielzahl unterschiedlicher Rückstände mit höherer Reaktionsgeschwindigkeitmarkieren 1. Die chemische Vernetzung ist ebenfalls Teil der Kategorie der irreversiblen Markierungen, ermöglicht jedoch aufgrund ihrer bivalenten Eigenschaft die Bestimmung räumlicher Einschränkungen zwischen zwei vernetzten Stellen, was einzigartige topologische Einblicke bietet 4,5. All diese Ansätze können zu einem "Werkzeugkasten" kombiniert werden, was MS zu einem wertvollen Werkzeug zur Aufklärung von Protein-HOS macht.
Wir haben diese Methodensammlung organisiert, um die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der MS-basierten Protein-HOS-Analyse vorzustellen. Die erste Gruppe von Artikeln enthält HDX-basierte Ansätze. Habibi und Thibodeaux6 beschreiben einen relativ klassischen kontinuierlichen Bottom-up-HDX-MS-Ansatz. Durch den Austausch von Wasserstoff und Deuterium (H/D) in der Lösung zu mehreren Austauschzeiten, gefolgt von einem Pepsinaufschluss auf der Säule, kann das Niveau der Deuteriumaufnahme auf Peptidebene bestimmt werden. Bei der Durchführung von differentiellen Experimenten (d. h. gebundenen und ungebundenen Zuständen) stellen Peptide, die entweder erhöhte oder verringerte Deuteriumaufnahmemengen aufweisen, Bereiche dar, in denen sich HOS ändert. Die Autoren verwenden Lanthipeptid-Synthetasen, um den HDX-MS-Workflow schön zu demonstrieren.
Neben dem Bottom-up-Ansatz kann HDX-MS auch top-down durchgeführt werden, was es den Analysten ermöglicht, verschiedene Trennstrategien auf der Ebene des intakten Proteins anzuwenden. Chaihu et al.7 verwenden die Kapillarelektrophorese, um verschiedene Proteinzustände oder Proteoformen zu trennen, die in der Lösung koexistieren. Proteine durchlaufen den H/D-Austausch während der Elektrophorese, während sie in der Kapillare in der deuterierten Hintergrundelektrolytlösung wandern, gefolgt von einer Top-down-MS-Analyse und Gasphasenfragmentierungen, um die Deuteriumaufnahme sowohl auf globaler als auch auf Fragmentebene zu beurteilen. Schließlich gibt es auch zwei weitere Verfahren in dieser Sammlung, die unterschiedliche Methoden des H/D-Austauschs hervorheben, nämlich den Austausch für lyophilisierte Leistung8 und den Austausch nach Elektrospray-Ionisation9.
Die zweite Gruppe von Artikeln befasst sich mit der Methode der irreversiblen Kennzeichnung. Bei der schnellen photochemischen Oxidation von Proteinen (FPOP) werden Radikale als Markierungsspezies verwendet, um die Oberfläche des Proteinszu markieren 10,11. In der Praxis wird Wasserstoffperoxid durch einen Laser photoaktiviert, um Hydroxylradikale zu erzeugen, die als aktive Markierungsspezies dienen. Misra und Sharp12 stellen eine Strategie für die Radikaldosimetrie vor, bei der Adenin als Reporter für die Radikalkonzentration und ein Inline-Radikaldosimetriesystem zur Überwachung der Adeninreaktion verwendet wird. Dies ermöglicht die Echtzeit-Kompensation der Hydroxylradikalkonzentrationen und damit die Normalisierung der Reaktionsbedingungen, um eine genaue Ablesung zu liefern. Anschließend arbeiteten Weinberger und Chea mit der Sharp-Gruppe zusammen, um eine laserfreie FPOP-Plattform13 zu entwickeln. Durch den Ersatz des gefährlichen Lasers durch eine Plasmalichtquelle und die Kombination mit der Inline-Radikaldosimetrie und einem automatisierten Probensammelsystem entwickeln und bieten sie eine integrierte Lösung für Forscher, die Protein-HOS charakterisieren müssen.
Die drei Artikel von Jones' Gruppe 14,15,16 untersuchen die Möglichkeit, FPOP und Protein-Footprinting in In-vivo-Studien einzubeziehen. Der Vorteil dieses Ansatzes ist beispiellos, da er es ermöglicht, das Protein HOS in der nativen Umgebung zu analysieren. Die erfolgreiche Anwendung des Fußabdrucks in Zellen14 und in Caenorhabditis elegans15 eröffnet neue Möglichkeiten, das HOS des gesamten Proteoms in seinem nativen Zustand zu verfolgen und ermöglicht so ein tiefes Verständnis des Proteins HOS, das mit anderen Werkzeugen nicht erreicht werden kann.
Eine weitere wichtige Methode der irreversiblen Markierung verwendet chemische Reagenzien, die auf spezifische Aminosäureresteabzielen 3. Kirsch et al.17 berichten über einen gut genutzten Arbeitsablauf der Protein-Fußabdrücke durch kovalente Markierung. Unter Verwendung von Diethylpyrocarbonat als Markierungsreagenz untersuchen die Autoren die Veränderungen des Protein-HOS, indem sie einige Arten von Aminosäureresten auf der Oberfläche des Proteins markieren. Durch differentielle Experimente, gefolgt von proteolytischem Aufschluss und Bottom-up-MS-Analyse, ermöglicht der Arbeitsablauf zusammen die Identifizierung von Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit, die in direktem Zusammenhang mit Veränderungen der HOS stehen.
Schließlich ist die chemische Vernetzung ein weiterer wichtiger Ansatz, bei dem bivalente chemische Reagenzien zur Markierung von Proteinen verwendetwerden 4,5. Chemische Vernetzer werden verwendet, um zwei Proteine zu vernetzen, die räumlich nahe beieinander liegen und oft einen Strukturkomplex bilden. Haupt et al.18 berichten über ein Protokoll, in dem sie die Verwendung chemischer Vernetzer zum Verständnis der Architektur von Proteinkomplexen demonstrieren. Der vernetzte Proteinkomplex kann auf zwei verschiedenen Ebenen analysiert werden. Durch proteolytischen Verdau mit anschließender MS-Identifizierung zeigen die vernetzten Dipeptide die wechselwirkenden Stellen des Proteinkomplexes auf. Bei der Analyse der vernetzten Probe durch intakte Masse sind die stöchiometrischen Informationen über die Proteinuntereinheiten innerhalb des Komplexes leicht verfügbar.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir in den letzten drei Jahrzehnten eine erhebliche Entwicklung bei MS-basierten Werkzeugen für die Protein-HOS-Analyse erlebt haben. Irreversibles und reversibles Footprinting in Verbindung mit der MS-Analyse ergänzen sich gegenseitig und tragen zusammen wesentlich zur Charakterisierung von Protein-HOS bei. Die in dieser Methodensammlung enthaltenen Arbeiten stellen die neuesten Methoden auf dem Gebiet der MS-basierten Protein-HOS-Analyse dar; Diese Studien sind eine wertvolle Ressource für Forscher, die versuchen, MS-basierte Ansätze zur Beantwortung kritischer Fragen zu nutzen. Aus einer breiteren Perspektive ist die Einbeziehung von Footprinting-Daten in strukturelle Vorhersagen entscheidend, um die Grenzen der räumlichen Auflösung in MS-basierten Methoden zu durchbrechen. Es gibt bahnbrechende Arbeiten, die die Machbarkeit eines solchen Ansatzes belegen19,20. Darüber hinaus ist auch die Plattformintegration von entscheidender Bedeutung, da diese Ansätze einander ergänzen und Einblicke aus verschiedenen Perspektiven bieten21,22. Die Methoden, über die in dieser Sammlung berichtet wird, zeigen die Leistungsfähigkeit einer solchen Integration, und es wird eine kontinuierliche Entwicklung in diese Richtung geben. Mit all diesen Fortschritten ist der MS-basierte Ansatz über die Molekulargewichtsbestimmung hinaus gewachsen, und in den kommenden Jahrzehnten wird in diesem Bereich ein kontinuierliches Wachstum zu verzeichnen sein.