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Biomolekulare Wechselwirkungen sind wichtige Akteure in biologischen Prozessen und damit ein grundlegend wichtiger Aspekt der Lebenswissenschaften. Fluoreszenztechniken gehören zu den leistungsfähigsten und am weitesten verbreiteten Methoden, um diese Prozesse zu untersuchen und zu verstehen. In vitro Fluoreszenzansätze bieten das Potenzial für die Echtzeitdetektion von extra- und intrazellulären molekularen Wechselwirkungen, was einen großen Vorteil gegenüber anderen Ansätzen darstellt. Dies wurde für eine Vielzahl von Protein-Protein-, Protein-Nukleinsäure- und Protein-Membran-Wechselwirkungen verwendet, die eine entscheidende Rolle bei der Regulation zellulärer Prozesse spielen.
Diese Sammlung gibt einen Überblick über verschiedene fluoreszenzbasierte Techniken und Anwendungen zur Untersuchung biomolekularer Wechselwirkungen und erweitert unser Verständnis zellulärer Prozesse.
Reiser et al.1 beschreiben ein Hochdurchsatzverfahren zur Analyse der zellulären Kinetik einzelner Zellen mittels automatisierter Bildaufnahme und -verarbeitung (Live Cell Imaging on Single Cell Arrays [LISCA]). Mit dieser Technik liefern fluoreszierende Reporter eine zeitaufgelöste Auslesung verschiedener unabhängiger biologischer Prozesse, wie z. B. die Genexpression einzelner Zellen nach der Transfektion, die zelluläre Reaktion in Signalkaskaden, apoptotische Ereignisse oder die Differenzierung von Stammzellen. Die Autoren führen Bildgebung in isolierten Zellarrays mittels Raster-Zeitraffermikroskopie durch, was zu Hunderten von Einzelzelltrajektorien und genügend Daten für die statistische Analyse führt. Einzelzell-Fluoreszenz-Zeitspuren werden Forschern helfen, die Mechanismen der Genübertragung besser zu verstehen und die zelluläre Heterogenität aufzuklären – ein Kennzeichen komplexer biologischer Systeme, die normalerweise von intrinsischen Fluktuationen bestimmt werden.
Konate et al.2 berichten über eine biophysikalische Methode zur Charakterisierung der Interaktion, Störung und/oder Permeabilisierung von membraninteragierenden Peptiden. In ihrem Protokoll beschreiben sie genau die verschiedenen Schritte zur Formulierung und Reinigung von Liposomen und zur Charakterisierung von Fluoreszenzleckagen. Die Methode wird mit einem zellpenetrierenden Peptid (CPP) namens WRAP in Verbindung mit einer kleinen interferierenden RNA (siRNA) oder in Kombination mit einem potenten therapeutischen Peptid (iCAL36) angewendet und mit dem bekannten CPP, Penetratin, verglichen. Diese Technik bietet mehrere Vorteile. Es ist schnell und einfach zu implementieren. Es ermöglicht eine genaue Kontrolle der Zusammensetzung der Lipidmembran, um verschiedene Arten von Zellmembranen nachzuahmen. Die Fluorophore können je nach dem interessierenden Peptid und seinen Membranleckageeigenschaften angepasst werden. Schließlich ist die Probe nach der Aufbereitung extrem stabil. Die Vielseitigkeit der Technik macht sie zu einem nützlichen Ansatz, um verschiedene biologische Fragen in Bezug auf Zellschäden oder die Verabreichung von Medikamenten zu untersuchen.
Das Vorhandensein von Phosphatidylserin (PS) in den Zellmembranen von Säugetieren ist wichtig für verschiedene Signalprozesse wie die Zellapoptose oder die Rekrutierung von Proteinen für die Membranreparatur. Der Transfer und die Veränderungen der PS-Verteilung an der Oberfläche von Plasmamembranen sind eine Schlüsselfrage, die Ikhlef et al.3 in ihrem Artikel behandeln. Sie beschreiben ein Protokoll zur Messung des PS- und PI-4-P-Lipidtransports und -austauschs durch das rekombinante Hefeprotein Osh6p in Echtzeit. Die Methode verwendet fluoreszierende Sensoren, um zu erkennen, ob ein Lipidtransferprotein (LTP) Lipide in künstlichen Membranen entlang eines Gradienten zwischen Lipidvesikeln extrahiert oder überträgt. Dieses Protokoll ermöglicht die Arbeit mit unmarkierten Lipiden, um die korrekte Bindung von Lipiden an das LTP zu ermöglichen. Darüber hinaus wird eine bessere Zeitauflösung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, wie z.B. radioaktivitätsbasierten Assays oder Massenspektrometrie, erreicht. Diese Methode wird den Forschern helfen, die Extraktion und den Austausch von Lipiden zwischen verschiedenen Organellen und Membranen besser zu verstehen.
Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung biomolekularer Systeme. Diese Technik kann auf einzelne Moleküle (z.B. smFRET) angewendet werden und ermöglicht die Messung absoluter Abstände innerhalb von Biomolekülen. Abdelhamid et al.4 präsentieren ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung der smfBox, einem kürzlich entwickelten konfokalen Aufbau, der in der Lage ist, die FRET-Effizienz zwischen zwei Farbstoffen an frei diffundierenden Einzelmolekülen zu messen. Sie zeigen, wie die smFRET-Technik von der Probenvorbereitung über die Einrichtung des Geräts, die Ausrichtung bis hin zur Datenerfassung und -analyse implementiert und angewendet wird. Darüber hinaus beschreiben sie, wie die Korrekturfaktoren bestimmt werden, die für genaue FRET-abgeleitete Abstandsmessungen erforderlich sind. Hier wird die Methode auf frei diffundierende DNA-Duplexe angewendet und kann auf ein breites Anwendungsspektrum erweitert werden, wie z.B. die Untersuchung von Proteinkonformationsänderungen oder Protein-DNA-Wechselwirkungen.
Biologische Prozesse beinhalten sehr vielfältige und zahlreiche biomolekulare Wechselwirkungen, die viel Raum für die Entwicklung neuer fluoreszenzbasierter Assays oder Sensoren lassen. Diese Sammlung bietet Forscherinnen und Forschern einen Überblick über die Innovationen und Entwicklungen bei fluoreszenzbasierten Methoden. Jeder Artikel beleuchtet eine andere fluoreszenzbasierte Methode und hebt hervor, wie wichtig und vielseitig Fluoreszenz-Assays geworden sind. Die Sammlung beschreibt diese Methoden und regt damit zu einer breiten Anwendung in verschiedenen Gruppen und Forschungsbereichen an.