$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
In der Vergangenheit haben sich Wissenschaftler stark auf Tierversuche verlassen, um festzustellen, ob ein Medizinprodukt (d. h. ein Medikament oder ein Medizinprodukt) sicher ist, bevor es am Menschen getestet wurde. Während Tierversuche in vielen Situationen immer noch gerechtfertigt sind, ist die Suche nach Alternativen sehr wünschenswert. Mit den jüngsten Fortschritten in Wissenschaft und Technik ist die Entwicklung von Alternativen zu Tierversuchen machbarer denn je. Ein erneuter Fokus auf die Entwicklung humaner In-vitro-Alternativmethoden für die Bewertung der kardialen Sicherheit ist zumindest teilweise auf Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) zurückzuführen. Menschliche Herzzellen können in einem Labor unter Verwendung einer einfachen Blut- oder Hautprobe eines Patienten erzeugt werden, wodurch humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) entstehen, die für robuste Hochdurchsatztests geeignet sind. Fortschritte in den Bereichen 3D-Gewebe-Bioengineering, Mikroelektroden-Array-Technologien, Lebendzell-Imaging und andere Technologien waren ebenfalls entscheidend für die Entwicklung der in dieser Sammlung enthaltenen Protokolle.
Das Protokoll von Gerges et al.1 wendet eine nicht-invasive optische Methode (MyoBLAZER) an, um Veränderungen der Kontraktilität in adulten humanen primären ventrikulären Kardiomyozyten zu beurteilen. Die Zellen werden elektrisch stimuliert, und die Bildanalyse misst die Sarkomerverkürzung über mehrere Zellen parallel. Diese Methode kann alle 30 Minuten Konzentrations-Wirkungs-Kurven pro Verbindung und Gerät erfassen und liefert Daten zur Struktur-Wirkungs-Beziehung. Diese nicht-invasive optische Methode trägt dazu bei, die Physiologie und Pharmakologie adulter humaner Kardiomyozyten während des Hochdurchsatz-Screenings zu erhalten. Darüber hinaus kann die Verwendung humaner adulter Kardiomyozyten ein entscheidendes translationales Element zur Vorhersage der Kontraktilität darstellen.
Die Methodik von Lickiss et al.2 stellt eine hybride Kontraktilitäts- und Impedanz-/extrazelluläre Feldpotential-Technologie (EFP) dar, die einer branchenüblichen 96-Well-Plattform durch die Verwendung eines weichen, flexiblen, siliziumbasierten Zellkultursubstrats signifikante Pro-Reifungsmerkmale hinzufügt. Der Ansatz erwies sich als erfolgreich, indem die physiologisch positive inotrope Reaktion auf Isoproterenol in kommerziell erhältlichen gesunden hiPSC-CMs wiederhergestellt wurde, die in der Standardkultur (steifes Substrat) wissentlich nicht vorhanden ist, ohne dass ein 3D-System erforderlich ist. Das Hybridsystem ermöglicht die direkte Messung der Kontraktionskraft (mN/mm2), der Schwebungsrate sowie der Dichte und Integrität der Zell-Monolayer. Es adressiert auch die Herausforderungen eines herkömmlichen 3D-Systems (d. h. geringer Durchsatz, erheblicher Schulungsbedarf) und reduziert den Zeit- und Kostenaufwand für die Durchführung des Assays.
Die Sammlung umfasst auch Arbeiten von Feaster et al.3, die eine nicht-invasive In-vitro-Methode mit hohem Durchsatz zur Bewertung der Therapie der kardialen Kontraktilitätsmodulation (CCM) in 2D-Kardiomyozyten menschlicher Stammzellen demonstrieren, die auf einer flexiblen Matrigel-Matratze plattiert sind, unter Verwendung von sondenfreier videobasierter Mikroskopie. Die Autoren heben die akuten Auswirkungen von CCM auf die kontraktilen Eigenschaften gesunder und kranker hiPSC-CM hervor. Dieses Tool bietet eine kostengünstige Methode, um die Sicherheit oder Wirksamkeit von CCMs zu verstehen, und könnte die Abhängigkeit von Tierversuchen verringern und die regulatorische Entscheidungsfindung von Medizinprodukten für die kardiale Elektrophysiologie unterstützen.
Das verfeinerte Protokoll von Schaefer et al.4 beschreibt eine neuartige Erweiterung des Standard-Mikroelektrodenarrays (MEA), das normalerweise das extrazelluläre Feldpotenzial in hiPSC-CMs aufzeichnet, und ermöglicht intrazelluläre Aufzeichnungen von Aktionspotentialen durch Öffnen von Zellmembranen mit Nanosekunden-Laserstrahlpulsen. Dieses Gerät bietet nicht nur die Standardvorteile von MEA (d.h. Signalausbreitungsüberwachung, akute und chronische Experimente), sondern ermöglicht auch einen Einblick in die intrazelluläre Form des Aktionspotentials ohne die Verwendung starker elektrischer Feldimpulse für die Zellelektroporation.
Das Protokoll von Berry et al.5 beschreibt eine neue Plattform, die die reproduzierbare Herstellung von 3D-konstruiertem Muskelgewebe (EMTs) für direkte Kontraktilitätskraftmessungen ermöglicht. Das Gerät kann Änderungen der Kontraktilitätskraft von Mikronewton detektieren und ist damit ein leistungsfähiges Werkzeug für das dosisabhängige Screening von Verbindungen. Die Kontraktilität in hiPSC-basiertem Herzgewebe sowie in Skelettmuskelgewebe kann in bis zu 24 Geweben gleichzeitig aufgezeichnet werden, und die Daten können über Wochen oder Monate hinweg longitudinal analysiert werden. Daher sind für die Forscher nur minimale zusätzliche Fähigkeiten oder Schulungen erforderlich.
Schließlich beschreibt die Veröffentlichung von Zhao et al.6 eine Reihe von funktionellen Assays (extrazelluläres Feldpotential, Aktionspotential, Kontraktilität und Kalzium), die für die Verwendung mit Kardiomyozyten optimiert sind und von Anwenderlaboren im eigenen Haus erzeugt werden können. Dies kann unter Verwendung zuvor veröffentlichter Differenzierungsprotokolle und iPSCs erfolgen, die von der Stanford University Cardiovascular Institute Biobank (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html) zur Verfügung gestellt werden und ein breites Spektrum an "kranken" und Kontrollzellen bieten. Hierbei handelt es sich um einen vollständigen Satz von Methoden für die wichtigsten kardialen Kontraktilitäts- und Elektrophysiologieaufzeichnungen, einschließlich Standardansätzen (Patch-Clamp, Mikroelektrodenarrays, kalziumempfindliche Fluoreszenzsonden und videobasierte Kontraktilitätsmessungen).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die aktuelle Methodensammlung zwar nicht den Anspruch erhebt, vollständig zu sein (und weiter wächst), aber bereits ein relativ umfassendes Methodenset ist, das viele aktuelle Herausforderungen bei der Kontraktilität und elektrophysiologischen Aufzeichnungen in menschlichen Kardiomyozyten veranschaulicht. Es umfasst Protokolle für primäre humane Kardiomyozyten1, kommerziell erhältliche hiPS-CMs von gesunden Spendern 2,3,4 sowie Protokolle, die für Zellen optimiert sind, die eine Signatur einer angeborenen Herzerkrankungtragen 3,6. Diese Methoden erstrecken sich über verschiedene Zellkulturbedingungen, von Einzelzellen für Patch-Clamp-Experimente6 bis hin zu konventionellen hiPSC-CM 2D-Monolayern auf steifen Substraten 1,4, 2D-Kardiomyozyten-Monolayern auf weichen, flexiblen Substraten 2,3 und schließlich 3D-technischen Herzgeweben5. Die eingeschlossenen Methoden verwenden unterschiedliche Ansätze zur Erfassung der wichtigsten kardialphysiologischen Parameter, wie z.B. Kontraktilität (entweder indirekt mit videobasierten Assays 1,3,6 oder direkt mit kontraktiler Kraft 2,5), Aktionspotential (in einer einzelnen Zelle mit Patch-Clamp6, ein Surrogat extrazelluläre Feldpotentiale mit einem MEA 4,6oder durch die Verwendung eines neuartigen Ansatzes, um die Zellen so zu positionieren, dass sie Aktionspotential-ähnliche Aufzeichnungen mit dem Standard-MEA-Systemaufzeichnen 4) und Kalziumtransienten (unter Verwendung von Kalzium-empfindlichen Sonden6). Zusammengenommen liefern diese Methoden nicht nur detaillierte Protokolle, die in anderen Labors reproduzierbar sind, sondern veranschaulichen auch einige der Herausforderungen bei kardialen In-vitro-Methoden beim Menschen, wie z. B.: hiPSC-CM-Unreife, insbesondere bei der Verwendung einer Standard-2D-Kultur auf steifem Substrat; unerwünschte Wirkungen von fluoreszierenden spannungs- oder kalziumempfindlichen Sonden; geringer Durchsatz der konventionellen Aktionspotentialaufnahmen; Schwierigkeiten bei der Interpretation von Aufzeichnungen über die potenzielle Dauer des Standardfelds; und Mangel an Assays für die Bewertung von Medizinprodukten (z. B. im Vergleich zu Arzneimitteln). Es ist inspirierend zu sehen, wie viele Labore an der Verbesserung dieser Methoden arbeiten, was in Zukunft unweigerlich zu einer breiten Adaption dieser Methoden führen wird.